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用于研究病原体、共生菌与宿主肠上皮相互作用的人类结肠类器官单层培养模型

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DOI：

10.3791/59357

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2019年4月9日

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, University of New Mexico Health Science Center, 2Department of Medicine, Division of Gastroenterology & Hepatology, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种培养具有完整屏障功能的人类肠类器官或结肠类器官单层细胞的实验方案，用于在细胞和生化水平上研究宿主上皮细胞与微生物群之间的相互作用。

摘要

源自隐窝基底部干细胞的人源三维（3D）肠类器官或结肠类器官培养体系目前是最先进的 离体 肠道上皮的模型。由于三维培养物具有封闭的结构和显著的细胞外基质支持，因此并不适合用于宿主-病原体相互作用的研究。类肠体或类结肠体可在可渗透的组织培养膜上生长为上皮单层，从而允许对管腔侧和基底侧细胞表面及其相应液体环境进行操作。这种增强的管腔表面可及性有助于模拟细菌与宿主上皮之间的相互作用，例如肠出血性大肠杆菌降解黏液的能力 E. coli （EHEC）在结肠上皮上的作用。本文描述了一种用于三维培养物破碎、单层接种以及跨上皮电阻（TER）测量的方法，以监测细胞达到融合和分化的过程。结肠类器官单层分化后可分泌黏液，可通过免疫荧光或免疫印迹技术进行研究。更广泛而言，肠类器官或结肠类器官单层培养为评估病原性或共生微生物群可能靶向的特定细胞群体提供了一个具有生理相关性的研究平台。

引言

肠类器官、小肠类器官和结肠类器官在理解干细胞行为、肠道发育、屏障/转运功能以及细胞分化方面已取得诸多进展。1 然而，三维培养限制了对宿主上皮-病原体相互作用的研究，因为除非对封闭结构进行显微注射，否则细菌或毒力因子无法直接进入腔内。2,3 此外，从三维培养体系中难以有效采集分泌物（如小分子、蛋白质或黏液）用于后续分析。在三维培养中，已利用荧光染料和延时显微镜评估病原体对上皮屏障功能4和离子转运5的影响，但在可渗透的组织培养支持物上生长的单层细胞更适合采用其他技术，例如跨上皮电阻（TER）测量和Ussing chamber/电压钳记录技术。6,7

已有大量文献描述了类肠体/类结肠体的二维或单层培养方案。已发现可促进上皮细胞贴附的材料包括胶原蛋白水凝胶8,9、0.1% 明胶10、薄层小鼠肉瘤来源的基底膜基质（BMM）11,12,13以及人源胶原蛋白IV6,7,14,15,16,17。接种方法包括通过移液进行机械性破碎6,14,15，以及使用胰蛋白酶10,11、中性蛋白酶13或EDTA9解离细胞间黏附因子。少数方案使用非多孔组织培养塑料器皿进行接种，但这会限制基底外侧的接触，因此大多数应用依赖于可渗透的组织培养小室。关于稳定融合单层形成及维持的文献记录在不同研究之间差异较大。此外，不同研究团队所采用的人源类器官培养和分化培养基成分各不相同，并随着越来越多研究人员根据自身实验需求和可用资源对方法进行调整而持续发展。

为解决三维肠道上皮培养在宿主-病原体相互作用研究中的局限性，我们提出了一种改进的方案，可将三维人源肠类器官或结肠类器官转化为单层培养。当类器官在类似隐窝的未成熟状态下达到汇合后，撤除生长因子WNT3A、RSPO1以及抑制剂A-83-01和SB 202190，可诱导其分化为类似于小肠绒毛或结肠表面上皮的表型。我们介绍了理想的基质——人Ⅳ型胶原，用于包被培养小室插入膜，以获得均匀的肠类器官或结肠类器官片段用于接种。我们证明，该方案可形成具有高跨上皮电阻（TER）的汇合单层。结肠类器官单层可分泌一层致密的顶端黏液层，从而可通过免疫印迹或免疫染色开展病原体-黏液相互作用的离体（ex vivo）研究。本文还描述了一种改良的固定程序，以在免疫染色过程中保持结肠黏液层的完整性。该方法旨在提供一个可操作的模型，用于研究感染初期肠道宿主与病原体之间的最早期相互作用。

方案

本方案基于作者先前发表的研究6,7,14,15,16。以下步骤应在生物安全柜中采用正确的无菌技术进行操作。所有涉及人体样本的研究方法均已获得约翰斯·霍普金斯大学医学院机构审查委员会（IRB NA_00038329）的批准。

1. 用细胞外基质包被细胞培养插件

  1. 在100 mM乙酸中配制5 mL胶原蛋白IV储备液（1 mg/mL）。于4 °C静置约4小时，使其充分水合/溶解。
  2. 将胶原蛋白IV储备液分装后，保存于4 °C（≤1个月）或-20 °C（>1个月）。
  3. 包被前立即用无菌组织培养级水将胶原蛋白IV储备液稀释至终浓度为34 μg/mL。对于24孔板细胞培养小室，每孔小室加入100 μL溶液，相当于10 μg/cm2。
  4. 将培养板置于标准CO2组织培养箱中，37 °C孵育≥2小时；或为方便起见，用石蜡膜密封板边缘后，于4 °C孵育过夜或最长1周。

2. 从三维培养物中分离肠类器官/结肠类器官

注意：类器官或结肠类器官由供体活检样本建立，并根据先前描述的标准方案在三维培养体系中维持培养14,18。简言之，通过螯合及机械振荡法从肠道活检或切除组织中分离隐窝结构。隐窝经洗涤、收集后接种于基底膜基质（BMM）中。向培养物中加入扩增培养基（见步骤4.2），每2天更换一次。接种后数小时内即可观察到三维结构的形成。

  1. 从24孔板中吸除培养基，每孔加入1 mL预冷的收获液（见材料表）。
  2. 使用小型细胞刮刀松动并打碎基底膜基质沉淀物，特别注意靠近孔边缘的物质。
  3. 将板置于摇床中，在约200 rpm、4 °C条件下振荡30–45分钟。

3. 解离三维肠类器官/结肠类器官

  1. 使用带有无菌滤芯吸头的P200单通道移液器或多通道移液器对细胞悬液进行吹打重悬。
  2. 将细胞悬液汇集至一个15 mL锥形管中。若总悬液体积>6 mL，则使用多个管。
  3. 加入等体积含10 mM HEPES、L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽（1×）和青霉素-链霉素（1×）的Advanced DMEM/F12培养基（洗涤培养基）。轻轻颠倒混匀3–4次。在4 °C条件下，以300 × g离心10分钟。
    1. 可选：吸除洗涤培养基，每孔加入0.5 mL胰蛋白酶（参见材料表）。用P200移液器重悬类器官，盖紧管盖后置于37 °C水浴中约2分钟。立即取出管子，加入洗涤培养基至终体积10 mL，并重复步骤3.3的离心操作。
      注意：如果吹打无法获得大小均一的细胞团块，建议执行此步骤。

4. 接种类肠器官/类结肠器官悬液

  1. 若包被的插入式培养小室储存于 4 °C，接种细胞前需在 37 °C、5% CO2 的组织培养孵箱中平衡至少 30 分钟。
  2. 针对每个待接种的插入式培养小室，准备 1 mL 温热（25–37 °C 之间）的扩增培养基（EM），并加入 10 μM Y-27632 和 10 μM CHIR 99021。
    注：EM 由以下成分组成：Advanced DMEM/F12 培养基，含 B27（1×）、50% WNT3A 条件培养基、15% RSPO1 条件培养基、10% Noggin 条件培养基、50 ng/mL 人 EGF、500 nM A-83-01、10 μM SB 202190、抗生素/抗真菌素混合液（1×）、10 mM HEPES、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（1×）和青霉素-链霉素（1×）（参见材料表）。
  3. 吸除含有细胞沉淀的离心管中的洗涤液，并用足量 EM 重悬细胞，确保每插入式培养小室至少有 100 μL 细胞悬液。
  4. 吸除每个插入式培养小室中的 IV 型胶原溶液，并用 150 μL 洗涤液/小室洗涤两次。
  5. 向每个插入式培养小室下方空间加入 600 μL EM。
  6. 向每个插入式培养小室中加入 100 μL 细胞悬液。
  7. 将培养板放回组织培养孵箱，静置至少 12 小时。
    注：避免振荡或剧烈倾斜培养板，以防结肠类器官片段在插入式培养小室膜上分布不均。
  8. 将培养板置于相差显微镜下，使用 2.5×–10× 物镜观察细胞贴壁与铺展情况，直至形成融合的单层细胞。
  9. 接种后 1–2 天，大多数片段应已黏附于胶原基质。此时更换培养基，并停止使用 Y-27632 和 CHIR 99021。此后每 2–3 天更换一次培养基，直至细胞融合。通常在 7–10 天内达到融合状态。

5. 测量跨上皮电阻

  1. 连接电极导线并打开上皮细胞伏特-欧姆计（EVOM）电源。确认测量功能已设置为欧姆（ohms）。
  2. 将电极尖端短暂浸入70%乙醇中，然后用实验室纸巾擦干。将电极置于5 mL洗涤培养基中平衡约5分钟。
  3. 将较短的电极尖端浸入小室内的培养基中，较长的电极尖端插入下层孔板的培养基中。保持电极完全垂直，直至EVOM读数相对稳定，或不超过60秒。
    注意：若电极组件严重偏离垂直方向，或电极尖端高度调节不当，较短的尖端可能接触并破坏细胞单层。
  4. 将EVOM测量值与浸没在培养基中无细胞的小室所获得的数值进行比较，以评估细胞融合或分化进展情况。

6. 汇合的肠类器官/结肠类器官单层细胞的分化

  1. 将培养基从 EM 更换为分化培养基（DM），之后每两天更换一次培养基，直至第 5 天。DM 是指不含 WNT3A、RSPO1、A-83-01 和 SB 202190 的 EM 培养基。
  2. 持续监测跨上皮电阻（TER），以确认分化过程按预期进行。在分化第 1 至第 5 天期间，TER 将持续上升。单层细胞在第 5–6 天后可能继续增加 TER 并保持活力，但在第 5–6 天使用时可获得最显著且最可重复的实验结果。

7. 使用共生性或致病性 E. coli 进行细菌感染

  1. 进行感染实验前一天，使用不含抗生素的EM或DM洗涤并喂养单层细胞。
  2. 用无菌微生物接种环轻轻刮取冷冻保存的细菌甘油菌种表面，接种至2 mL LB液体培养基中，将试管置于37 °C摇床培养箱中培养12–16小时。
  3. 取50 μL初始培养物加入5 mL新鲜LB液体培养基中（1:100稀释），继续在摇床中培养90分钟。此步骤将获得对数生长期的菌液，浓度为105–106菌落形成单位（cfu）/mL。
    1. 可选：使用分光光度计在600 nm波长处测定光密度（OD600）以确认细菌浓度。
  4. 将细菌培养物在12,000 × g离心10分钟，弃上清液，用不含抗生素的EM或DM重悬细菌，调整终浓度为107 cfu/mL。
  5. 向插入式培养小室中加入10 μL细菌悬液（终浓度为106 cfu/mL）。用移液器缓慢吹打混匀，避免扰动细胞外黏液层。
  6. 将培养板放回组织培养箱中，进行所需时间的感染孵育。

8. 固定以保存和免疫染色黏液

  1. 从24孔板中取出细胞培养小室，小心地将其倒置在实验室纸巾上以去除顶端培养基，并擦去附着在小室外壁的液体。
  2. 在新的24孔板中，将小室浸入由冰醋酸与无水乙醇按1:3比例配制的Clarke固定液中，在室温下固定10分钟。
  3. 将小室倒置以去除固定液，并在1×PBS中重新水化细胞10分钟。随后按照标准免疫染色流程进行操作。
  4. 使用剃刀刀片沿小室膜的边缘切割，用镊子将膜转移至玻璃显微镜载玻片上，并用封片剂固定盖玻片。

9. 免疫印迹用细胞裂解物的制备

注意：以下步骤需在冰上或低温环境中进行。

  1. 吸弃培养基，用 PBS 清洗小室一次。
  2. 向小室中加入 150 μL 含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（见材料表），静置 5–10 分钟。裂解缓冲液包含：50 mM Tris（pH 8）、150 mM NaCl、1% IGEPAL CA-630、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS 和 1:100 的蛋白酶抑制剂混合物。
  3. 使用小型细胞刮刀将细胞从小室上刮下，然后用 P200 移液器轻轻吹打悬浮液数次，并转移至微量离心管中。
  4. 使用微探头超声仪以 20% 振幅进行 5 次、每次 1 秒的脉冲超声处理（参见材料表）。
  5. 若立即进行电泳，则加入 SDS-PAGE 上样缓冲液；否则将裂解物分装后于 -20 °C 保存。

结果

人源肠类器官和结肠类器官以三维结构培养，随后解离并切割成小片段，接种于人胶原蛋白IV包被的细胞培养小室中。单层细胞的形成过程可通过明场显微镜每日观察，并结合免疫荧光染色（图1）以及跨上皮电阻（TER）的持续升高（图2）进行监测，TER的变化反映了紧密连接对离子的通透性，并与单层细胞的融合程度相关。空置的24孔培养小室的TER值约为50–100 Ω·cm2，当细胞融合后TER上升至约400–500 Ω·cm2。融合单层中的所有上皮细胞均通过连接复合体相互连接，该结构可在细胞周边由F-肌动蛋白环显示（图1）。在含完全生长因子的培养基中，单层细胞呈现增殖性的隐窝样上皮特征，主要由活跃分裂的细胞组成，这些细胞可掺入核苷类似物EdU（图2）。撤除生长因子WNT3A和RSPO1可促进细胞分化，形成类似绒毛结构的培养物，其中不含增殖细胞。分化后的单层细胞包含肠吸收细胞（肠类器官）或结肠细胞（结肠类器官），并可发育出特化的肠道上皮细胞类型，这已在三维培养中得到证实18，包括杯状细胞和肠内分泌细胞15。分化后的单层细胞还表现出TER显著升高（> 1000 Ω·cm2）（图2），表明其紧密连接已成熟。

在正常的人体生理条件下，肠上皮层将营养物质和富含微生物的管腔空间与无菌的浆膜环境分隔开来。上皮层严格调控这两个区室之间的相互作用。类肠体和类结肠体单层细胞保留了这一重要的区室化特性，如表1中的蛋白质组学分析所示。从分化后的类肠体单层细胞收集的顶端和基底外侧条件培养基在蛋白质组成上存在显著差异。可同时获取顶端和基底外侧两侧的培养环境，从而能够以时间依赖的方式分别收集两种上清液，用于检测其他分子（如细胞因子和趋化因子）的差异性分泌情况。15，17

单层细胞是一种便捷且高度可重复的模型，可用于通过免疫印迹和免疫染色检测蛋白质表达的变化。因此，利用这两种技术均可检测到通过shRNA敲低（KD）引起的黏蛋白2（MUC2）表达变化（图3）。shRNA转导在三维结肠类器官中进行，并在含抗生素的筛选培养基中维持培养。在确认敲低效果后，结肠类器官可长期维持为三维培养物，和/或铺板为单层细胞用于实验研究。此外，与野生型亲本结肠类器官系相比，MUC2敲低并不影响单层细胞形成的效率。用于免疫印迹的单层细胞收集操作简便，类似于人上皮腺癌来源细胞系所采用的方案。通常，从一个0.33 cm2培养小室中培养的单层细胞可提取约50 µg或更多的总蛋白。如图3所示，MUC2在未分化（UD）野生型结肠类器官单层细胞中几乎无法检测到，但在分化后（DF）的野生型单层细胞中表达水平显著升高。而在转导了MUC2 shRNA的未分化和分化结肠类器官单层细胞中，MUC2表达均低于检测限。

重要的是，单层细胞是研究上皮细胞顶面宿主-微生物相互作用的合适模型。结肠类器官单层细胞在分化后会形成一层厚的、MUC2 阳性的附着黏液层，该黏液层不易被共生性 E. coli HS 菌穿透（图 4），这与在正常人结肠中所观察到的情况相似。19 然而，肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic E. coli，EHEC）作为一种人类结肠病原菌，已被证明能够破坏富含 MUC2 的附着黏液层，从而到达上皮细胞的顶面（图 4）。14,20 此时，残留的 MUC2 仅存在于杯状细胞内部。

显微镜图像中的细胞结构和F-actin结构；细胞核为蓝色，F-actin为绿色。
图1： 人源肠类器官/结肠类器官单层培养的建立。 （A） BMM溶解并吹打后结肠类器官片段的示例。（B） 结肠类器官片段接种后插入物的示例。比例尺（A-B）= 200 μm。代表性（C）最大强度投影和（D）共聚焦光学Z切片及其对应的正交投影显示，接种于人源IV型胶原包被滤膜上的结肠类器官片段在接种后2-4天形成多个单层岛状结构。在C和D中，无细胞区域（星号）表现为缺乏细胞核染色（Hoechst 33342，蓝色）和顶端F-actin染色（鬼笔环肽，绿色）。代表性（E）最大强度投影和（F）共聚焦光学切片及其对应的正交投影显示，接种约1周后，结肠类器官单层融合，通过F-actin免疫荧光染色可检测到连续的顶端表面。（G）代表性最大强度投影的高倍放大图像和（H）共聚焦光学切片及其对应的正交投影显示，在融合的结肠类器官单层中，细胞形成F-actin周连接环（白色箭头）和不成熟的顶端刷状缘（黄色箭头）。比例尺（C-H）= 20 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞增殖分析：EdU染色（细胞核，EdU），TER曲线图，横截面（细胞核，F-肌动蛋白）。
图 2：小肠类器官/结肠类器官单层细胞分化的评估。（A） EdU（红色）掺入显示在空肠单层细胞分化过程中增殖能力逐步下降。（B） 在扩增或分化培养基中汇合的空肠单层细胞的平均TER测量值。误差条表示标准误（SEM）。UD，未分化；DF，已分化。数字对应于特定条件下的培养天数；UD1为达到汇合的第一天，约在接种后1周。（C） 与分化第5天（DF day 5）的空肠单层细胞相比，UD空肠单层细胞具有更宽、更短的细胞形态，且顶端肌动蛋白构成的刷状缘发育较不成熟。比例尺（A, C）= 50 μm。所有单层细胞均在接种后至少1周时进行观察，且在开始分化前已达到汇合状态。请点击此处查看该图的高清版本。

MUC2在野生型与敲低型中的共聚焦显微镜图像，以及显示蛋白质大小的SDS-PAGE凝胶电泳。
图3： 野生型结肠类器官与经shRNA转导的敲低（KD）结肠类器官均能形成汇合的单层结构。 （A） 分化5天的野生型（WT）人类汇合结肠类器官单层的代表性图像，以及（B） 来源于MUC2敲低（KD）结肠类器官培养物的类似生长的单层结构。比例尺（A–B）= 50 μm。（C） 经转导表达乱序shRNA或MUC2 shRNA的结肠类器官培养物的代表性免疫印迹结果表明，敲低引起的蛋白表达变化可通过免疫印迹进行定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

MUC2、大肠杆菌、EHEC抗原的共聚焦显微镜图像；上皮细胞中MUC2强度的图表。
图4：类肠体/类结肠体单层培养模型适用于研究管腔微生物与宿主之间的相互作用。 (A) 人类类结肠体单层培养的代表性最大强度投影与正交光学切面显示，其顶端存在较厚的MUC2阳性黏液层，该黏液层可阻止E. coli HS（黑色箭头）穿透，细菌仅停留在黏液层表面。该单层培养模型以106 cfu/mL浓度的HS菌株感染6小时。 (B) 人类类结肠体单层培养在顶端接种肠出血性大肠杆菌（EHEC，106 cfu/mL，6小时）后的代表性最大强度投影图像。比例尺（A-B）= 50 μm。 (C) MUC2免疫荧光强度检测结果显示，与未感染对照组相比，EHEC感染的类结肠体单层培养中MUC2表达显著降低。误差线表示标准误（SEM）。 请点击此处查看本图的高清版本。

蛋白登录号肽丰度
基底外侧培养基
肝型脂肪酸结合蛋白 [Homo sapiens]NP_001434.11299
前纤维蛋白-1 [Homo sapiens]NP_005013.1797
载脂蛋白A-IV前体 [Homo sapiens]NP_000473.2744
细胞外ADP-核糖基转移酶4前体 [Homo sapiens]NP_066549.2633
甘油醛-3-磷酸脱氢酶同工型1 [Homo sapiens]NP_002037.2 (+1)616
血清转铁蛋白前体 [Homo sapiens]NP_001054.1 (+1)572
维生素D结合蛋白同工型3前体 [Homo sapiens]NP_001191236.1 (+2)567
过氧化氢酶 [Homo sapiens]NP_001743.1427
聚集蛋白同工型1前体 [Homo sapiens]NP_940978.2 (+1)377
乳转铁蛋白同工型1前体 [Homo sapiens]NP_002334.2 (+1)262
顶侧培养基
三叶因子3前体 [Homo sapiens]NP_003217.3326
三叶因子1前体 [Homo sapiens]NP_003216.1304
基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白同工型a前体 [Homo sapiens]NP_001278789.1 (+3)303
丝束蛋白B同工型1 [Homo sapiens]NP_001157789.1 (+2)240
三叶因子2前体 [Homo sapiens]NP_005414.1182
恶性脑肿瘤缺失蛋白1同工型b前体 [Homo sapiens]NP_015568.2 (+3)169
角蛋白，II型细胞骨架1 [Homo sapiens]NP_006112.3157
肌球蛋白-9 [Homo sapiens]NP_002464.1150
氨基肽酶N前体 [Homo sapiens]NP_001141.2 (+1)145
聚集蛋白前体 [Homo sapiens]NP_940978.2 (+1)112

表1. 通过液相色谱/串联质谱法在分化的空肠单层细胞顶侧和基底侧液体样本中鉴定出的部分肽段列表。

讨论

成功形成肠类器官/结肠类器官单层的关键参数包括：1）以健康且处于增殖状态的三维培养物作为起始材料；2）在接种单层细胞前，用人类胶原蛋白IV型包被细胞培养小室表面；3）通过机械或酶消化方法将三维培养物进行碎片化处理，但不应解离至单细胞水平。

在分离三维肠类器官/结肠类器官时，最佳振荡速度可能因特定振荡仪的旋转直径不同而有所变化。目的是不仅要充分振荡培养板以实现有效混匀，还要避免细胞悬液溅到培养板盖上或邻近孔中。孵育时间短于<30分钟可能导致细胞表面残留较多的基质胶（BMM），这会影响细胞在插入式培养小室上贴附并形成均一的单层细胞。过长的孵育时间（≥1小时）将显著降低细胞活力。

将三维肠类器官/结肠类器官解离所需的吹打程度可能因移液器活塞的硬度和操作者的熟练程度而异。建议在吹打过程中定期使用相差显微镜观察孔内内容物，以评估碎片的均一性，目标为每个碎片约含30个细胞。除了或替代吹打操作，也可用胰蛋白酶对悬液进行短时间消化，以获得更小且均一的碎片。如果单层中存在大量类似三维结构的区域，则胰酶消化可能更为合适。然而，不建议将类器官完全解离为单细胞，因为这会显著降低细胞活力。通常情况下，一个在35 μL基质胶微滴中培养的肠类器官/结肠类器官孔足以接种2–3个Transwell小室，但具体数量还取决于类器官/结肠类器官的数量及其平均大小。

随着类结肠体单层细胞的分化，其可能吸收大量顶侧培养基。可通过向插入式培养皿的上层添加额外的DM培养基（150–200 μL）来避免此问题，尽管上层培养室部分干燥似乎不会对后续实验中单层细胞的存活率或功能产生不利影响。分化约4–5天后，类结肠体单层细胞会形成细胞表面可见的胞外黏液，在小心吸除DM培养基后，可观察到细胞表面存在较厚或凝胶状物质。

对于肠出血性大肠杆菌与外层黏液层的相互作用，我们常规使用本方案中指定的细菌滴度和孵育时间。然而，对于独特的细菌菌株，应首先在多种浓度和孵育时间条件下进行检测，以确定达到预期效果的合适参数。

在黏液固定过程中，吸除顶端培养基可能会带走大部分细胞外未附着的黏液层。因此，需小心倾倒培养基。若因表面张力导致培养基残留在小室中，可用折叠的实验纸巾一角破坏表面张力，并吸走大部分培养基。固定和染色后，在将盖玻片覆盖于小室滤膜上时，可能会无意中使黏液层脱落或压平。为保持黏液层的高度，应将滤膜置于一滴封片剂液滴上，再小心地将盖玻片盖在滤膜上。切勿敲击或按压盖玻片，以免显著压平黏液层。

为了从三维培养的细胞形成极化单层，必须重现肠上皮细胞基底外侧膜整合素与细胞外基质（ECM）蛋白之间的相互作用。层粘连蛋白、IV型胶原、纤连蛋白以及多种蛋白聚糖构成了肠上皮的细胞外基质21,22。我们比较了人源细胞来源的层粘连蛋白、纤连蛋白、IV型胶原以及小鼠来源的基底膜基质（BMM）作为插入式培养小室的包被材料。只有IV型胶原能够支持稳定、长期（长达4周）融合的类肠体/类结肠体单层的形成（图1-2）。在其他每种测试基质上仅获得小片状类似单层的生长区域，但这些区域未能进展至完全融合。使用人源IV型胶原作为ECM替代物具有多项优势。来源于Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤细胞的BMM并非人源，而人源IV型胶原可商业化获取，且通常更具成本效益。此外，BMM是成分复杂的蛋白质混合物，存在固有的批次间差异，并可能含有肉瘤细胞分泌的生长因子，从而影响基因表达23。

肠上皮细胞与下方细胞外基质（ECM）在肠上皮修复过程中的相互作用仍未完全阐明。已有研究提示，IV型胶原而非层粘连蛋白，可作为人结肠上皮细胞的黏附配体24，并促进肠隐窝上皮细胞的修复25，该结论基于抗IV型胶原抗体可抑制细胞黏附的实验结果得出。上皮细胞表达的β1-整合素似乎在ECM相互作用中具有重要作用，因为特异性针对β1-整合素的抗体可显著阻断结肠上皮细胞与IV型胶原的黏附24。尽管IV型胶原可作为类器官/结肠类器官单层培养中可靠的ECM基质，但在此模型中，上皮细胞随时间对ECM的重塑作用尚未被评估，更复杂的、由IV型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白组成的明确定义的ECM混合物的影响也尚未研究。

以单层形式培养的人源肠类器官/结肠类器官（图1-4）可实现对微生物或小分子的操控与取样，而这些操作在三维基质包埋的类器官培养体系中往往繁琐甚至无法完成。三维肠类器官/结肠类器官在大小、结构复杂性及腔内容积方面存在较大变异，因此对微生物或小分子进行显微注射时难以实现精确的定量。此外，与单层培养相比（表1），三维培养体系无法直接接触腔面和基底外侧表面，从而难以检测与生理或病理生理过程相关的离子、营养物质、细胞因子或分泌性因子。融合度（图1-2）是肠类器官/结肠类器官单层培养的关键特性之一，不仅对于建立营养物质、离子及其他大分子的生理浓度梯度至关重要16，而且有助于在腔内微生物群与无菌的、富含间充质细胞/免疫细胞的浆膜环境之间形成有效的屏障。在今后的研究中，若需将肠类器官/结肠类器官单层与间充质细胞、免疫细胞或神经元细胞共培养以构建更复杂的生理模型，上述因素均需予以充分考虑。

本文所述细胞培养小室模型的已知局限性包括缺乏流体剪切应力和机械拉伸/压缩（蠕动）等物理力，以及缺少肠道上皮在体内通常所处的厌氧性顶侧环境。这些因素有可能通过更复杂的微生理系统加以解决26，但其实现也需要额外的成本、设备和技术专长。无论是三维培养还是单层培养，除非特意添加相关组分，否则均不存在与肠道微生物组、间质细胞群体以及免疫系统的相互作用或贡献。

在胶原蛋白IV包被的细胞培养小室上培养的肠类器官/结肠类器官单层细胞，未来可应用于其他病原性或共生微生物相互作用、药物或营养吸收、毒性、代谢、屏障功能以及通过与其他肠道细胞类型共培养所介导的功能增强等方面的研究。不仅可利用健康供体的肠上皮进行评估，也可利用携带基因突变或患有肠道疾病个体的组织进行研究，前提是这些个体的体内表型已被证实可在体外肠类器官/结肠类器官培养中得以保留。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 P01 AI125181、K01 DK106323（JGI）和 K01 DK113043（JFA）。我们感谢美国马里兰州巴尔的摩市马里兰大学 James Kaper 提供大肠杆菌（E. coli）HS 菌株和肠出血性大肠杆菌（EHEC）。同时感谢约翰斯·霍普金斯大学 Conte 消化疾病基础与转化研究核心中心（P30 DK089502）的整合生理学与影像学核心设施以及约翰斯·霍普金斯大学质谱与蛋白质组学核心设施的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇SigmaT4661Tris 碱，裂解缓冲液组分
A-83-01Tocris2939ALK4/5/7 抑制剂
冰乙酸Fisher ScientificA38
高级 DMEM/F12Life Technologies12634-010生长培养基组分
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽Life TechnologiesA12379F-肌动蛋白荧光探针
抗生素/抗真菌剂混合液Invivogenant-pm-2Primocin (100x)
B27, 50xLife Technologies17504-044生长培养基组分
细胞培养小室Corning3470Transwell，PET 膜，0.4 μm 孔径，24 孔板
CHIR 99021Tocris4423GSK3β 抑制剂
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 成像试剂盒Life TechnologiesC10639
IV 型胶原蛋白，来源于人胎盘SigmaC5533
Cultrex 类器官收获溶液Trevigen3700-100-01降解基底膜基质
肠出血性 Escherichia coli (EHEC)Kaper 实验室，马里兰大学
上皮细胞伏特计World Precision InstrumentsEVOM2
上皮细胞伏特计电极World Precision InstrumentsSTX3
Escherichia coli 菌株 HSKaper 实验室，马里兰大学
无水乙醇Pharmco111000200
FluorSave 封片剂Millipore345789用于将小室膜固定在显微镜载玻片上
GlutaMAXLife Technologies35050-061L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，200 mM
HEK293T/Noggin-Fc 细胞系van den Brink 实验室，Tytgat 肝脏与肠道研究研究所用于制备 Noggin 条件培养基
HEK293T/RSPO1-Fc-HA 细胞系Trevigen3710-001-K用于制备 R-脊椎蛋白-1 条件培养基
HEPES，1 MLife Technologies15630-080生长培养基组分
Heraeus Multifuge X1R 离心机Thermo Fisher Scientific75004250
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570荧光核染料
人表皮生长因子 (EGF)R&D Systems236-EG-01M生长培养基组分
IGEPAL CA-630SigmaI8896裂解缓冲液组分
倒置细胞培养光学显微镜OlympusCKX51
LB 肉汤EMD Millipore1.10285.0500
L-WNT3A 细胞系ATCCCRL-2647用于制备 Wnt3a 条件培养基
Matrigel，生长因子减少型Corning356231用于三维培养的基底膜基质
小型细胞刮刀United BioSystemsMCS-200
MUC2 抗体，小鼠单克隆Abcamab11197免疫染色使用 1:100，免疫印迹使用 1:500
MUC2 shRNA 慢病毒颗粒GE DharmaconRHS4531GIPZ 慢病毒 shRNA，ID: 4583
轨道摇床Grant InstrumentsPSU-10i
青霉素-链霉素，100xLife Technologies15140-122生长培养基组分
磷酸盐缓冲液Corning21-031
带微探头的超声破碎仪Branson Ultrasonics450
哺乳动物细胞蛋白酶抑制剂混合液SigmaP8340裂解缓冲液组分
SB 202190Tocris1264p38 MAPK 抑制剂
氯化钠SigmaS3014裂解缓冲液组分
脱氧胆酸钠SigmaD6750裂解缓冲液组分
十二烷基硫酸钠SigmaL3771裂解缓冲液组分
TrypLE Express，1xLife Technologies12605-010胰蛋白酶，用于消化肠类器官/结肠类器官片段
连环蛋白抗体，兔单克隆Abcamab129002免疫印迹使用 1:1000
水，组织培养级，无菌过滤Corning25-055
Y-27632Tocris1254RhoA/ROCK 抑制剂

参考文献

  1. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, 633-642 (2016).
  2. Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, e29132(2017).
  3. Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6, 301-319 (2018).
  4. Leslie, J. L., et al. Persistence and Toxin Production by Clostridium difficile within Human Intestinal Organoids Result in Disruption of Epithelial Paracellular Barrier Function. Infection and Immunity. 83, 138(2015).
  5. Foulke-Abel, J., et al. Human Enteroids as a Model of Upper Small Intestinal Ion Transport Physiology and Pathophysiology. Gastroenterology. 150, 638-649.e638 (2016).
  6. Yin, J., et al. Molecular Basis and Differentiation-Associated Alterations of Anion Secretion in Human Duodenal Enteroid Monolayers. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 591-609 (2018).
  7. Tse, C., et al. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC)—Secreted Serine Protease EspP Stimulates Electrogenic Ion Transport in Human Colonoid Monolayers. Toxins. 10, 351(2018).
  8. Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue engineering. Part C, Methods. 19, 961-969 (2013).
  9. Wang, Y., et al. Self-renewing Monolayer of Primary Colonic or Rectal Epithelial Cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4, 165-182 (2017).
  10. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7, 818-828 (2014).
  11. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64, 911(2015).
  12. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell–derived human enteroids. Science. 353, 1387(2016).
  13. Kozuka, K., et al. Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
  14. In, J., et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2, 48-62 (2016).
  15. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270(2017).
  16. Vernetti, L., et al. Functional Coupling of Human Microphysiology Systems: Intestine, Liver, Kidney Proximal Tubule, Blood-Brain Barrier and Skeletal Muscle. Scientific Reports. 7, 42296(2017).
  17. Noel, G., et al. Enterotoxigenic Escherichia coli is phagocytosed by macrophages underlying villus-like intestinal epithelial cells: modeling ex vivo innate immune defenses of the human gut. Gut Microbes. 9, 382-389 (2018).
  18. Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  19. Johansson, M. E. V., Sjövall, H., Hansson, G. C. The gastrointestinal mucus system in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10, 352-361 (2013).
  20. Hews, C. L., et al. The StcE metalloprotease of enterohaemorrhagic Escherichia coli reduces the inner mucus layer and promotes adherence to human colonic epithelium ex vivo. Cellular Microbiology. 19, e12717(2017).
  21. Laurie, G. W., Leblond, C. P., Martin, G. R. Localization of type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and fibronectin to the basal lamina of basement membranes. The Journal of Cell Biology. 95, 340(1982).
  22. Timpl, R. Macromolecular organization of basement membranes. Current Opinion in Cell Biology. 8, 618-624 (1996).
  23. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10, 1886-1890 (2010).
  24. Ishii, S., et al. Normal colonic epithelium adheres to carcinoembryonic antigen and type IV collagen. Gastroenterology. 106, 1242-1250 (1994).
  25. Moore, R., Madri, J., Carlson, S., Madara, J. L. Collagens facilitate epithelial migration in restitution of native guinea pig intestinal epithelium. Gastroenterology. 102, 119-130 (1992).
  26. Bein, A., et al. Microfluidic Organ-on-a-Chip Models of Human Intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 659-668 (2018).

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用于研究病原体、共生菌与宿主肠上皮相互作用的人类结肠类器官单层培养模型
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