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方法文章

使用 Caenorhabditis elegans 研究毒物的跨代与多代效应

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DOI：

10.3791/59367

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2019年7月29日

 ,  ,  ,  , 
1College of Environmental Sciences and Engineering, Tongji University, 2Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security, 3Jiaxing Tongji Institute of Environment, 4College of Ecological Technique and Engineering, Shanghai Institute of Technology

本文内容

摘要

持久性化学物质的跨代和多代效应对于评估其对环境和人类健康的长期影响至关重要。我们提供了利用自由生活的线虫Caenorhabditis elegans研究跨代和多代效应的新型详细方法。

摘要

了解化学品的毒性信息对其应用和废物管理至关重要。对于低浓度化学品而言，其长期效应在评估环境和人类健康影响方面尤为重要。在揭示长期影响方面，近期研究中关于化学品跨代效应的发现提供了新的见解。本文描述了利用自由生活的线虫Caenorhabditis elegans研究化学品多代效应的实验方案。主要介绍两个方面：（1）跨代效应（TG）研究；（2）多代效应研究，后者进一步分为多代暴露（MGE）和多代残留效应（MGR）研究。跨代效应研究具有较强的可靠性，其主要目的是确定亲代接触化学品后是否会对后代产生任何残留影响。在完成对亲代表型的检测后，使用次氯酸钠溶液杀死亲代，保留后代，以便于对后代进行效应评估。该方法用于判断当亲代暴露于污染物时，其后代是否受到影响。多代暴露与多代残留效应研究则系统性地用于评估连续多代暴露是否会导致后代在多代过程中产生适应性反应。通过精细的挑取和转移操作区分不同世代，以利于对每一代进行效应测量。我们还整合了多种实验方案，用于检测运动行为、繁殖能力、寿命、生化指标以及基因表达的变化。此外，本文还列举了一些示例实验，以说明跨代和多代效应研究的具体实施。

引言

化学品的应用与废物管理在很大程度上依赖于其在特定浓度下效应的信息。值得注意的是，时间是效应与浓度之间另一个关键因素。也就是说，化学品——尤其是实际环境中低浓度的化学品——需要一定时间才能引发可测量的效应1。因此，研究人员在动物实验中设置不同长度的暴露持续时间，甚至覆盖整个生命周期。例如，小鼠暴露于尼古丁30、90或180天以研究其毒性效应2。然而，此类暴露时长仍不足以阐明污染物（如持久性有机污染物[POPs]）在环境中跨多代生物所造成的长期效应。因此，关于跨代效应的研究正受到越来越多的关注。

代际效应研究主要包括两个方面。第一个是跨代效应（TG）研究，可有效检验亲代接触化学物质是否会对子代产生任何影响3。第二个是多代效应研究，该研究更为系统，同时考虑暴露效应和残留效应。一方面，多代暴露（MGE）效应用于说明动物对长期不利环境的适应性反应；另一方面，多代残留（MGR）效应用于揭示暴露后的长期残留影响，因为母体暴露会伴随胚胎对第一代子代的暴露以及生殖系对第二代子代的暴露，从而使第三代子代成为完全未暴露的第一代4。

尽管哺乳动物（例如小鼠）在毒性研究中，特别是与人类相关的研究中是常用的模式生物，但其在代际效应研究中的应用非常耗时、昂贵且存在伦理问题5。因此，一些其他生物提供了替代选择，包括甲壳类动物Daphnia magna6、昆虫Drosophila melanogaster7以及斑马鱼Danio rerio8。然而，这些生物要么与人类的相似性较低，要么在研究中需要特定的设备。

秀丽隐杆线虫 是一种小型自由生活的线虫（体长约1 mm），具有较短的生活周期（在 20 °C)9该线虫与人类共享许多保守的生物学通路，因此已被广泛用于阐明各种应激因素或有毒物质的影响。10值得注意的是，99.5%的线虫为雌雄同体，这使得该生物在研究世代效应（例如重金属和磺胺类药物的跨代效应）方面极为适用。3,11，金纳米颗粒和重金属的多代暴露效应12 和温度13，磺胺类药物的多代残留效应14以及伽马辐射的多代暴露（MGE）和多代残留（MGR）效应15 和林丹4此外，在化学物质（如玉米赤霉烯酮）对小鼠发育和繁殖的影响方面也发现了类似的结果。 秀丽隐杆线虫16,17这将有助于将这种小型动物的效应外推至人类。

无论是跨代（TG）还是多代（MG）效应研究，均耗时较长，且需要精心的设计与操作。值得注意的是，前述研究在生命阶段的选择、暴露条件以及世代分离方法上存在差异。这些差异阻碍了研究结果之间的直接比较，也限制了对结果的进一步解读。因此，建立统一的实验方案以指导跨代和多代效应研究显得尤为必要，同时有助于揭示不同毒物或污染物在长期效应中的共性规律。本实验方案的总体目标是展示利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究跨代和多代效应的清晰操作流程，为关注毒物或污染物长期效应的研究人员提供便利。

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方案

1. 培养 E. coli OP50

  1. 通过将 4 g 氢氧化钠溶解于 100 mL 水中，制备 1 M 氢氧化钠溶液。
  2. 在 1 L 锥形瓶中，将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g 氯化钠溶于 1 L 超纯水中，配制溶菌肉汤（LB）培养基。用 1 M 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.0。
  3. 将步骤 1.2 中的 LB 液体培养基分装至 20 个锥形瓶中（最大允许体积：100 mL），每瓶加入 50 mL 培养基。用牛皮纸覆盖锥形瓶口。
  4. 在 121 °C 和 0.105 MPa 条件下灭菌 20 分钟。将 LB 培养基冷却至室温。
  5. 用移液器从细菌悬液（见步骤 1.8）中吸取 200 µL，或用接种环从琼脂平板（步骤 2.14）上挑取少量菌落，转移至 LB 培养基中。
  6. 在 37 °C、150 rpm 振荡条件下培养 24–48 小时。LB 培养基将由棕色透明液体变为浑浊的黄褐色悬液。
  7. 使用占总瓶数 80% 的细菌悬液，为线虫提供 E. coli OP50 作为食物，用于步骤 2.11。
  8. 将剩余含细菌悬液的锥形瓶于 4 °C 冰箱中保存。吸取 200 µL LB 悬液接种至新鲜 LB 培养基（步骤 1.4）上表面，并重复步骤 1.6 进行后续培养。

2. 培养 C. elegans

注意：按照标准方法18，使用步骤 2.1 至 2.11 进行秀丽隐杆线虫（C. elegans）的培养。

  1. 将22.8 g的K2HPO4•3H2O溶解于100 mL无菌蒸馏水中。
  2. 将6.8 g的KH2PO4溶解于50 mL无菌蒸馏水中。
  3. 混合步骤2.1和2.2中的溶液，制备1 M的K2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH 6.0，总体积150 mL）。
  4. 通过将1.232 g的MgSO4•7H2O溶解于5 mL无菌蒸馏水中制备1.0 M的MgSO4溶液，并通过0.22 µm无菌一次性膜滤器过滤该溶液至无菌容器中进行灭菌。
  5. 通过将0.554 g的CaCl2溶解于5 mL无菌蒸馏水中制备1 M的CaCl2溶液，并通过0.22 µm无菌一次性膜滤器过滤该溶液至无菌容器中进行灭菌。
  6. 通过将0.025 g胆固醇溶解于5 mL无水乙醇中制备1 M胆固醇溶液，并通过0.22 µm无菌一次性膜滤器过滤该溶液至无菌容器中进行灭菌。
  7. 通过向含有1 L超纯水的1 L锥形瓶中加入17 g琼脂粉、2.5 g蛋白胨和3 g氯化钠来制备线虫生长培养基（NGM）琼脂。加入25 mL步骤2.3中的K2HPO4-KH2PO4溶液。
  8. 在121 °C、0.105 MPa条件下对步骤2.7中的NGM琼脂灭菌20分钟。
  9. 将NGM琼脂冷却至约50 °C，加入1 mL步骤2.4至2.6中制备的1 M MgSO4、1 M CaCl2和5 mg/mL胆固醇-乙醇溶液，并充分混匀。
  10. 每皿倒入约10 mL NGM琼脂培养基至100个无菌培养皿（直径6.0 cm）中。将培养基在培养皿中冷却至室温，形成固体琼脂。
  11. 使用无菌枪头将步骤1.7中的细菌悬液170 µL加至上述NGM琼脂表面。轻轻摇动NGM琼脂，使LB培养基均匀分布在NGM琼脂表面。
  12. 将接种后的NGM琼脂正置，在37 °C下培养8–12小时，以形成细菌菌苔。
  13. 使用步骤2.12中大部分带有细菌菌苔的琼脂，在步骤2.15或2.19中培养线虫。
  14. 将1或2个琼脂倒置存放于4 °C冰箱中，以避免水分蒸发和污染，从而维持细菌活性。
  15. 当储备NGM琼脂上的线虫数量少于2,000条时（来自前期实验或由其他实验室提供），使用无菌枪头切取含C. elegans的六分之一NGM琼脂，并转移至新制备的带有细菌菌苔的NGM琼脂（来自步骤2.13）上。将NGM琼脂倒置置于22 °C培养箱中进行后续培养。
  16. 当储备NGM琼脂上的线虫数量超过2,000条时，用2 mL无菌水冲洗NGM琼脂上的线虫至离心管中。加入2 mL水后，最终体积约为1.5 mL。
  17. 将离心管中的线虫静置30分钟。用移液器弃去1 mL上清液，并向每管中加入1 mL无菌水洗涤沉淀（即线虫）。
  18. 再次将离心管中的线虫静置30分钟。用移液器弃去1 mL上清液。向每管中加入1 mL无菌水重悬线虫。
  19. 用移液器将线虫悬液（总体积约1.5 mL）分装，每份150 µL加至新的带有细菌菌苔的NGM琼脂（来自步骤2.13）上，共制备8–10个新的NGM琼脂平板。
  20. 将步骤2.19中的NGM琼脂正置放入20 °C培养箱中过夜，之后倒置进行后续培养。
  21. 每隔三天重复一次步骤2.15或步骤2.16–2.20。

3. 准备同步化的卵和L3期幼虫 秀丽隐杆线虫

  1. 将带有卵的成年线虫及新产生的卵从NGM琼脂平板上冲洗至无菌离心管中，每块NGM琼脂平板使用2 mL无菌水，最终获得约1.5 mL悬液。
  2. 将线虫在离心管中静置30分钟，然后用移液器弃去85%的上清液。
  3. 通过溶解0.6 g NaOH和5 mL NaOCl（4-6%有效浓度，参见 材料表 用水定容至25 mL，使NaOH浓度为0.5 M，NaOCl浓度为1%。
  4. 将步骤 3.2 中的沉淀物混合（标记体积为 V）0) 与 7 倍 V0 次氯酸钠溶液的体积比为1:7（步骤3.3）19.
  5. 每2分钟振荡离心管一次，持续10-15分钟，以裂解幼虫和成虫线虫；线虫悬液的颜色将由浑浊变为透明。
  6. 将离心管在 700 x g 3 分钟 20 °C，然后用移液器吸弃上清液。
  7. 将沉淀重悬于5倍体积V中0 用无菌水清洗同步化年龄的卵。在700 x g 3 分钟 20 °C，然后弃去上清液。
  8. 重复步骤 3.7 两次。
  9. 加入1倍体积的V0 将无菌水加入试管中以重悬同步化年龄的卵。
  10. 通过移液将卵悬液进行分配 50 µL onto 每个来自步骤 2.13 的带有细菌草坪的新 NGM 琼脂平板。将 NGM 琼脂平板正面朝上放置于 20 °C 孵育30分钟，使水分蒸发或被细菌菌苔吸附。然后将NGM琼脂平板倒置，用于后续培养。将此时间标记为卵期时间（T卵).
  11. 通过将 3 g NaCl 和 2.36 g KCl 溶解于 1 L 水中制备 K 培养基。对培养基进行灭菌处理 121 °C 以及 0.105 MPa 下灭菌 20 分钟，然后冷却至室温。
  12. 当时间达到 T 后 36 小时卵，线虫将发育至L3幼虫阶段（L3线虫）20用2 mL无菌水将线虫从NGM琼脂平板上冲洗至离心管中，每块NGM琼脂平板可获得约1.5 mL悬液。
  13. 静置30分钟后，用移液法将上清液更换85%，替换为K培养基，持续2小时以消化肠道内的食物3.
  14. 弃去上清液。使用K-培养基（来自步骤3.11）将线虫悬浮液调整至每约200条线虫 100 µL 用于后续实验。

4. 使用 秀丽隐杆线虫 用于跨代效应研究

  1. 配制5个浓度梯度的化学溶液，并设一溶剂对照组或空白对照组，共6个组。
  2. 将对照组或化学溶液各取100 µL加入96孔无菌微孔板的中央区域，每组设10个复孔（共60孔），以避免边缘效应。
  3. 用步骤3.11中的K培养基将步骤3.14所得线虫悬浮液稀释10倍。取100 µL稀释后的线虫悬浮液加入步骤4.2中的60个孔中。标记时间为t0。
  4. 当时间达到t0后24小时，统计各孔中存活和死亡的线虫数量，计算半数致死浓度（LC50）。
  5. 配制一系列浓度低于LC50值10%的5个浓度梯度。
  6. 将步骤4.5所得对照组或化学溶液各取100 µL加入96孔无菌微孔板的中央区域，每组设10个复孔（共60孔），以避免边缘效应。
  7. 向步骤4.6中的60个孔中各加入100 µL含有约200条L3期线虫的K培养基（来自步骤3.14）。标记时间为T0。
  8. 自T0起进行24至96小时的暴露处理。
  9. 暴露结束后，用移液器将每组五个孔中的线虫收集至1.5 mL离心管中（共6管）。
  10. 静置线虫30分钟，用移液器弃去上清液，用1 mL无菌水重悬并洗涤底部线虫。
  11. 再次静置线虫30分钟，用移液器弃去上清液，取底部线虫用于暴露亲代（标记为F0）的指标测定（见第7节）。
  12. 按照步骤4.10的方法，收集、静置并重悬洗涤步骤4.9中每组剩余五个孔的线虫。
  13. 将步骤4.12所得线虫静置30分钟，用移液器弃去上清液，加入100 µL无菌水重悬线虫，将线虫悬浮液均匀转移至三个新制备的含细菌菌苔的NGM琼脂平板（来自步骤2.13）上。
  14. 将线虫在NGM平板上培养36小时使其发育为产卵期成虫，并按照步骤3.1–3.9进行年龄同步化处理。将同步化的卵在相应的含细菌菌苔的NGM琼脂平板（来自步骤2.13）上继续培养36小时。
  15. 将步骤4.14中NGM琼脂平板上的线虫冲洗至六个离心管中。
  16. 静置线虫30分钟，用移液器弃去上清液，用1 mL无菌水重悬并洗涤沉淀。
  17. 再次静置线虫30分钟，用移液器弃去上清液，取底部线虫用于子代（标记为T1）的指标测定（见第7节）。

5. 使用 秀丽隐杆线虫 用于多代暴露（MGE）效应研究

  1. 将99.0 mL NGM琼脂（来自步骤2.9）与1 mL对照溶液或化学溶液（本方案中以低浓度和高浓度为例，共三组）混合。
  2. 将步骤5.1中制备的约10 mL NGM琼脂培养基倒入100个无菌培养皿（直径6.0 cm）中。将培养皿中的培养基冷却至室温，使其凝固成固体琼脂。
  3. 按照步骤 2.11，将细菌悬液移液至琼脂上。
  4. 将培养皿的上盖移开，使细菌菌膜暴露于紫外光下（145 µW/cm2在生物安全柜中放置 15 分钟。
  5. 使用接种环挑取少量菌落，置于步骤1.4中来自琼脂的LB培养基中。将LB培养基在150 rpm振荡条件下孵育 37 °C 孵育24小时以确认细菌生长可忽略，验证杀灭步骤5.4。
  6. 将步骤3.9中同步化年龄的卵用移液器转移至步骤5.4制备的琼脂平板上。标记亲代F0开始暴露于受试物的时间为第0天（D0）。
  7. 将培养基在3 d内孵育 20 °C然后（即在第3天），使用成熟的线虫测量F0代的效应（见第7节）。
  8. 同样在第3天，使用末端缠绕成环状的人工纤维丝的玻璃棒，将F0代成熟线虫挑取至新的NGM琼脂平板（来自步骤5.4）。
  9. 在第4天，从NGM琼脂平板上挑出并弃去成熟的F0线虫。将在此24小时内（从第3天到第4天）新孵化的子代线虫标记为F1代，以进行第二代暴露处理。
  10. 在第6天，检测已暴露3天的F1代成熟线虫的各项指标（见第7节）。
  11. 在第9天，重复步骤5.8-5.10，使用F1代线虫繁殖F2代线虫，并测定F2代线虫的效应。
  12. 在第12天，重复步骤5.11，利用F2代线虫繁殖F3代个体，并测定F3代线虫的效应。通过相同方法，继续繁殖后代，并测定多代连续暴露（MGE）对后续世代的效应 n子代（Fn）。

6. 利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行多代残留（MGR）效应研究

  1. 重复步骤 5.1–5.7。在第 3 天（D3），将 F0 代成熟线虫挑至新的不含添加化学物的 NGM 琼脂平板上（来自步骤 2.13）。
  2. 在第 4 天（D4），挑出并弃去成熟的 F0 代线虫。将在此 24 小时内新孵化的子代线虫标记为 T1 代线虫。
  3. 在第 6 天（D6），检测已生长 3 天的 T1 代成熟线虫的各项指标（见第 7 节）。
  4. 在第 9 天（D9），重复步骤 6.2–6.3，利用 T1 代线虫繁殖产生 T2 代线虫，并检测 T1 代线虫的效应。
  5. 在第 12 天（D12），重复步骤 6.4，利用 T2 代线虫繁殖产生 T3 代线虫，并检测 T2 代线虫的效应。依此方法继续繁殖后代，并检测 F0 代线虫的第 n 代子代（Tn）线虫，或从步骤 5.12 起 Fn 代线虫的第 n 代子代（Tn'）线虫的多代残留（MGR）效应。

7. 测量指标

  1. 测量运动行为。
    1. 使用无菌水将线虫从NGM琼脂平板上冲洗下来，并收集至离心管中。静置30分钟，弃去上清液，使用沉淀中的线虫进行效应测定。
    2. 用1 mL无菌水重悬沉淀中的线虫，通过移液将其转移至不含细菌菌苔的NGM琼脂平板（来自步骤2.10）上。
    3. 使用体视显微镜观察并记录线虫的体弯曲频率（BBF），即在60秒时间内，咽部后球沿运动路径垂直方向改变运动方向的次数。
    4. 使用体视显微镜观察并记录反向运动（RM），即在60秒时间内，运动方向改变超过90°的次数，包括后退转弯和Ω形转弯（OT）。OT是指线虫头部接触或几乎接触尾部，使虫体呈希腊字母Ω（Ω）形状的运动方式。
      注：每次实验重复中，每种处理至少检测6只线虫。
多代暴露（F0至F3）对繁殖力和寿命影响的示例，共3组（一个对照组和两个暴露处理组）。
天MGE 研究用 NGM 琼脂编号说明
寿命繁殖
030（F0代暴露）每组10个重复，标记为F0-1-1-0至F0-3-10-0，最后一位数字表示存活天数。
130（F0 存活 1 天）F0-1-1-0 至 F0-3-10-0 应更改为 F0-1-1-1 至 F0-3-10-1。
230（F0 存活 2 天）F0-1-1-1 至 F0-3-10-1 应更改为 F0-1-1-2 至 F0-3-10-2。
F0 代线虫在3天内无需转移。
330（F0 存活 3 天，在线虫转移和收集后清除）3天后，F0代线虫成熟，使用36个新的NGM琼脂平板（每个平板上放置2条线虫）观察其存活和繁殖情况。
36（F0-1-1-3 至 F0-3-12-3）应进行预实验以确定F0代线虫的数量，确保后续多代实验中至少获得200个子代个体。
值得注意的是，若研究MGR效应，应将F0线虫转移至不含化学物质的纯净NGM琼脂平板上，并记为T1起点。
大部分F0代线虫被收集用于测定化学和遗传指标，F0代的30个琼脂平板被清空。
436（F0-1-1-4 至 F0-3-12-4）36（F1-1-1-1 至 F1-3-12-1）寿命和繁殖力的测量需要每天进行转移。
将F0-1-1-3至F0-3-12-3代亲本线虫挑取至标记为F0-1-1-4至F0-3-12-4的新NGM平板上。
F0-1-1-3 至 F0-3-12-3 琼脂中剩余的子代线虫（即 MGE 中的 F1 或 MGR 中的 T1）已生长 1 天，标记更改为 F1-1-1-1 至 F1-3-12-1。这些琼脂也用于通过每日转移监测 F1 的寿命。
536（F0-1-1-5 至 F0-3-12-5）36（F1-1-1-2 至 F1-3-12-2）F1-1-1-1 至 F1-3-12-1 琼脂上的线虫已生长 2 d，变得易于观察，此时对线虫进行计数，并将标记更改为 F1-1-1-2 至 F1-3-12-2。
36（F0-1-1-4 至 F0-3-12-4）F0-1-1-4 至 F0-3-12-4 琼脂中的子代线虫已生长 1 d。
636（F0-1-1-6 至 F0-3-12-6）36（F0-1-1-4 至 F0-3-12-4，计数后清除）F1-1-1-2 至 F1-3-12-2 琼脂上的线虫已生长 3 天，标记应更改为 F1-1-1-3 至 F1-3-12-3。值得注意的是，F1 代线虫在当天开始繁殖 F2 代，应将 F1 代线虫转移至新的 NGM 琼脂平板上，标记为 F2-1-1-0 至 F1-3-12-0。对于多代残留效应（MGR）研究，T2 阶段从当天开始。
36（F1-1-1-3 至 F1-3-12-3）36（F0-1-1-5 至 F0-3-12-5）化学暴露可能导致这一过程延迟，因此每次实验都应进行灵活调整，以确保后续世代有足够数量的线虫。
36（F2-1-1-0 至 F1-3-12-0）F0-1-1-4 至 F0-3-12-4 培养基上的子代线虫已培养 2 d，计数后清除培养基。
F0-1-1-5 至 F0-3-12-5 琼脂上的子代线虫已培养 1 d。
736（F0-1-1-7 至 F0-3-12-7）36（F0-1-1-5 至 F0-3-12-5，计数后清除）F0-1-1-5 至 F0-3-12-5 培养基上的子代线虫已培养 2 d，计数后清除培养基。
36（F1-1-1-4 至 F1-3-12-4）36（F0-1-1-6 至 F0-3-12-6）F1-1-1-1 至 F1-3-12-1 琼脂板、F0-1-1-4 至 F0-3-12-4 琼脂板以及 F0-1-1-5 至 F0-3-12-5 琼脂板中的线虫总数用于计算 F0 代的初始繁殖力。
36（F2-1-1-1 至 F2-3-12-1）F0-1-1-6 至 F0-3-12-6 琼脂上的子代线虫已培养 1 d。
F2-1-1-0 至 F1-3-12-0 上的 F2 线虫已生长 1 d，其标记已更改为 F2-1-1-1 至 F2-3-12-1。
836（F0-1-1-8 至 F0-3-12-8）36（F0-1-1-6 至 F0-3-12-6，计数后清除）F0-1-1-6 至 F0-3-12-6 培养基上的子代线虫已培养 2 d，计数后清除培养基。
36（F1-1-1-5 至 F1-3-12-5）36（F0-1-1-7 至 F0-3-12-7）F0代线虫在F0-1-1-7至F0-3-12-7号琼脂平板上的子代线虫已培养1天。
36（F2-1-1-2 至 F2-3-12-2）36（F1-1-1-4 至 F1-3-12-4）F1-1-1-4 至 F1-3-12-4 琼脂上的 F1 代线虫子代已生长 1 d。
36（F2-1-1-1 至 F2-3-12-1，计数后更改为 F2-1-1-2 至 F2-3-12-2）F2-1-1-1 至 F2-3-12-1 上的 F2 线虫已培养 2 天，统计线虫数量，并将其标记更改为 F2-1-1-2 至 F2-3-12-2。
936（F0-1-1-9 至 F0-3-12-9）36（F0-1-1-7 至 F0-3-12-7，计数后清除）F0代线虫在F0-1-1-7至F0-3-12-7号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂平板。
36（F1-1-1-6 至 F1-3-12-6）36（F1-1-1-4 至 F1-3-12-4，计数后清除）F1代线虫在F1-1-1-4至F1-3-12-4号琼脂平板上已培养2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F2-1-1-3 至 F2-3-12-3）36（F0-1-1-8 至 F0-3-12-8）F0代线虫在F0-1-1-8至F0-3-12-8号琼脂平板上孵育1天后，其子代线虫已生长1天。
36（F3-1-1-0 至 F3-3-12-0）36（F1-1-1-5 至 F1-3-12-5）F1-1-1-5 至 F1-3-12-5 琼脂上的 F1 代线虫子代已生长 1 d。
F2线虫从F2-1-1-2至F2-3-12-2已生长3天，其标记更改为F2-1-1-3至F2-3-12-3。F2线虫今日开始繁殖，需转移至36个新的NGM培养基，标记为F3-1-1-0至F3-3-12-0。对于多代残留效应（MGR）研究，T3阶段从今日开始。
1036（F0-1-1-10 至 F0-3-12-10）36（F0-1-1-8 至 F0-3-12-8，计数后清除）F0代线虫在F0-1-1-8至F0-3-12-8号琼脂平板上培养2天后，子代线虫已发育，计数后琼脂平板被清除。
36（F1-1-1-7 至 F1-3-12-7）36（F1-1-1-5 至 F1-3-12-5，计数后清除）F1-1-1-5 至 F1-3-12-5 培养基上的 F1 代线虫后代已培养 2 d，计数后清除培养基。
36（F2-1-1-4 至 F2-3-12-4）36（F0-1-1-9 至 F0-3-12-9）F2-1-1-1 至 F2-3-12-1、F1-1-1-4 至 F1-3-12-4 琼脂以及 F1-1-1-5 至 F1-3-12-5 中的线虫总数用于计算 F1 代的初始繁殖力。
36（F3-1-1-1 至 F3-3-12-1）36（F1-1-1-6 至 F1-3-12-6）F0代线虫在F0-1-1-9至F0-3-12-9号琼脂平板上的子代线虫已培养1天。
F1-1-1-6 至 F1-3-12-6 琼脂上的 F1 代线虫子代已培养 1 d。
F3-1-1-0 至 F3-3-12-0 琼脂上的子代线虫已生长 1 d，标记已更改为 F3-1-1-1 至 F3-3-12-1。
值得注意的是，F0 代线虫在最初几天后繁殖能力将显著下降。因此，自第10天起，线虫的转移无需每日进行，可每2天进行一次。然而，存活情况仍需每日观察。
相同的规则也适用于 F1（T1，T1’）、F2（T2，T2’）和 F3（T3，T3’）。
1136（F0-1-1-11 至 F0-3-12-11）36（F0-1-1-9 至 F0-3-12-9，计数后清除）F0代线虫在F0-1-1-9至F0-3-12-9号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂平板。
36（F1-1-1-8 至 F1-3-12-8）36（F1-1-1-6 至 F1-3-12-6，计数后清除） F1-1-1-6 至 F1-3-12-6 培养基上的 F1 代线虫后代已培养 2 天，计数后清除培养基。
36（F2-1-1-5 至 F2-3-12-5）36（F0-1-1-10 至 F0-3-12-10）F0代线虫在F0-1-1-10至F0-3-12-10号琼脂平板上的子代线虫已培养1天。
36（F3-1-1-2 至 F3-3-12-2）36（F1-1-1-7 至 F1-3-12-7）F1-1-1-7 至 F1-3-12-7 琼脂上的 F1 代线虫子代已培养 1 d。
36（F2-1-1-4 至 F2-3-12-4）F2-1-1-4 至 F2-3-12-4 琼脂板上的 F2 代线虫后代已培养 1 d。
36（F3-1-1-1 至 F3-3-12-1，在计数后更改为 F3-1-1-2 至 F3-3-12-2）F3-1-1-1 至 F3-3-12-1 琼脂上的线虫已培养 2 d，计数线虫后，标记更改为 F3-1-1-2 至 F3-3-12-2。
1236（F0-1-1-12 至 F0-3-12-12）36（F0-1-1-10 至 F0-3-12-10，计数后清除）F0代线虫在F0-1-1-10至F0-3-12-10培养基上孵育2天后，子代线虫已发育，计数后清除培养基。
36（F1-1-1-9 至 F1-3-12-9）36（F1-1-1-7 至 F1-3-12-7，计数后清除）F1代线虫在F1-1-1-7至F1-3-12-7号琼脂平板上已培养2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F2-1-1-6 至 F2-3-12-6）36（F2-1-1-4 至 F2-3-12-4，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-4至F2-3-12-4号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂。
36（F3-1-1-3 至 F3-3-12-3）36（F0-1-1-11 至 F0-3-12-11）F0代线虫在F0-1-1-11至F0-3-12-11号琼脂平板上的子代线虫已培养1天。
36（F4-1-1-0 至 F4-3-12-0）36（F1-1-1-8 至 F1-3-12-8）F1-1-1-8 至 F1-3-12-8 琼脂上的 F1 代线虫子代已生长 1 d。
36（F2-1-1-5 至 F2-3-12-5）F2-1-1-5 至 F2-3-12-5 琼脂上的 F2 代线虫后代已培养 1 d。
F3-1-1-2 至 F3-3-12-2 琼脂上的线虫已生长 3 天，标记已更改为 F3-1-1-3 至 F3-3-12-3。F3 代线虫今日开始繁殖，需将其转移至 36 个新的 NGM 琼脂平板上，标记为 F4-1-1-0 至 F4-3-12-0。对于多代残留效应（MGR）研究，F3 代的子代（即 T1’）自今日开始培养。
1336（F0-1-1-13 至 F0-3-12-13）36（F0-1-1-11 至 F0-3-12-11，计数后清除）F0代线虫在F0-1-1-11至F0-3-12-11号琼脂平板上培养2天后，子代线虫已发育，计数后清除琼脂平板。
36（F1-1-1-10 至 F1-3-12-10）36（F1-1-1-8 至 F1-3-12-8，计数后清除）F1代线虫在F1-1-1-8至F1-3-12-8号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂。
36（F2-1-1-7 至 F2-3-12-9）36（F2-1-1-5 至 F2-3-12-5，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-5至F2-3-12-5号琼脂平板上已培养2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F3-1-1-4 至 F3-3-12-4）36（F0-1-1-12 至 F0-3-12-12）F3-1-1-1 至 F3-3-12-1、F2-1-1-4 至 F2-3-12-4 琼脂以及 F2-1-1-5 至 F2-3-12-5 中的线虫总数用于计算 F2 代的初始繁殖力。
36（F4-1-1-1 至 F4-3-12-1）36（F1-1-1-9 至 F1-3-12-9）F0代线虫在F0-1-1-12至F0-3-12-12培养基上孵育的子代线虫已生长1天。
36（F2-1-1-6 至 F2-3-12-6）F1-1-1-9 至 F1-3-12-9 琼脂上的 F1 代线虫子代已培养 1 d。
F2-1-1-6 至 F2-3-12-6 琼脂板上的 F2 代线虫子代已培养 1 天。
F3代线虫的子代在F4-1-1-0至F4-3-12-0培养1天后，标记变更为F4-1-1-1至F4-3-12-1。
1436（F0-1-1-14 至 F0-3-12-14）36（F0-1-1-12 至 F0-3-12-12，计数后清除）F0代线虫在F0-1-1-12至F0-3-12-12培养基上孵育2天后，线虫计数完毕，培养基被清除。
36（F1-1-1-11 至 F1-3-12-11）36（F1-1-1-9 至 F1-3-12-9，计数后清除）F1-1-1-9 至 F1-3-12-9 培养基上的 F1 代线虫后代已培养 2 天，计数后清除培养基。
36（F2-1-1-8 至 F2-3-12-8）36（F2-1-1-6 至 F2-3-12-6，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-6至F2-3-12-6号琼脂平板上已培养2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F3-1-1-5 至 F3-3-12-5）36（F4-1-1-1 至 F4-3-12-1，计数后清除）F3代线虫在F4-1-1-1至F4-3-12-1上的后代已生长2天，计数后清除琼脂。在MGR研究中，T1’代线虫已生长2天，将于次日（第15天）开始繁殖T2’代，T2’代将于第18天开始繁殖T3’代。以野生型C. elegans的寿命为例，其寿命约为15天，因此T3’代寿命的结束时间为第33天。
36（F0-1-1-13 至 F0-3-12-13）F0代线虫在F0-1-1-13至F0-3-12-13号琼脂平板上的子代线虫已培养1天。
36（F1-1-1-10 至 F1-3-12-10）F1代线虫在F1-1-1-10至F1-3-12-10号琼脂平板上已生长1天。
36（F2-1-1-7 至 F2-3-12-7）F2-1-1-7 至 F2-3-12-7 琼脂上的 F2 代线虫后代已培养 1 d。
36（F3-1-1-4 至 F3-3-12-4）F3代线虫在F3-1-1-4至F2-3-12-4号琼脂平板上已生长1天。
1536（F0-1-1-15 至 F0-3-12-15）36（F0-1-1-13 至 F0-3-12-13，计数后清除）F0代线虫在F0-1-1-13至F0-3-12-13号琼脂平板上培养2天后，子代线虫已生长，计数后琼脂平板被清除。
36（F1-1-1-12 至 F1-3-12-12）36（F1-1-1-10 至 F1-3-12-10，计数后清除）F1代线虫在F1-1-1-10至F1-3-12-10号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂平板。
36（F2-1-1-9 至 F2-3-12-9）36（F2-1-1-7 至 F2-3-12-7，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-7至F2-3-12-7号琼脂平板上已培养2天，计数线虫后弃去琼脂平板。
36（F3-1-1-6 至 F3-3-12-6）36（F3-1-1-4 至 F3-3-12-4，计数后清除）F3代线虫在F3-1-1-4至F3-3-12-4号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂。
36（F0-1-1-14 至 F0-3-12-14）F0代线虫在F0-1-1-14至F0-3-12-14号琼脂平板上的子代已培养1天。
36（F1-1-1-11 至 F1-3-12-11）F1-1-1-11 至 F1-3-12-11 琼脂上的 F1 代线虫子代已培养 1 天。
36（F2-1-1-8 至 F2-3-12-8）F2代线虫在F2-1-1-8至F2-3-12-8号琼脂平板上已生长1天。
36（F3-1-1-5 至 F3-3-12-5）F3代线虫在F3-1-1-5至F2-3-12-5号琼脂平板上已培养1天。
1636（F0-1-1-15 至 F0-3-12-15，续）36（F0-1-1-14 至 F0-3-12-14，计数后清除）野生型 C. elegans 的寿命以 15 天为例。因此，自暴露开始后，F0 代应在第 16 天之前全部死亡。
36（F1-1-1-13 至 F1-3-12-13）36（F1-1-1-11 至 F1-3-12-11，计数后清除）F0代线虫在F0-1-1-14至F0-3-12-14培养基上已生长2天，计数后清除培养基。
36（F2-1-1-10 至 F2-3-12-10）36（F2-1-1-8 至 F2-3-12-8，计数后清除）F1代线虫在F1-1-1-11至F1-3-12-11号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂平板。
36（F3-1-1-7 至 F3-3-12-7）36（F3-1-1-5 至 F3-3-12-5，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-8至F2-3-12-8号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂。
36（F0-1-1-15 至 F0-3-12-15）F3代线虫在F3-1-1-5至F3-3-12-5号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂。
36（F1-1-1-12 至 F1-3-12-12）F4-1-1-1 至 F4-3-12-1、F3-1-1-4 至 F3-3-12-4 琼脂以及 F3-1-1-5 至 F3-3-12-5 中的线虫总数用于计算 F3 代的初始繁殖力。
36（F2-1-1-9 至 F2-3-12-9）F0代线虫在F0-1-1-15至F0-3-12-15号琼脂平板上的子代已生长1天。
36（F3-1-1-6 至 F3-3-12-6）F1代线虫在F1-1-1-12至F1-3-12-12培养基上已生长1天。
F2-1-1-9 至 F2-3-12-9 琼脂上的 F2 代线虫后代已培养 1 d。
F3代线虫在F3-1-1-6至F2-3-12-6号琼脂平板上已生长1天。
1736（F1-1-1-14 至 F1-3-12-14）36（F0-1-1-15 至 F0-3-12-15，计数后清除，结束）F0代线虫在F0-1-1-15至F0-3-12-15培养基上已生长2天，计数后清除培养基。F0代不再产生后代。
36（F2-1-1-11 至 F2-3-12-11）36（F1-1-1-12 至 F1-3-12-12，计数后清除）F1代线虫在F1-1-1-12至F1-3-12-12培养基上已生长2天，计数后清除培养基。
36（F3-1-1-8 至 F3-3-12-8）36（F2-1-1-9 至 F2-3-12-9，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-9至F2-3-12-9号琼脂平板上已培养2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F3-1-1-6 至 F3-3-12-6，计数后清除）F3代线虫在F3-1-1-6至F3-3-12-6号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂。
36（F1-1-1-13 至 F1-3-12-13）F1-1-1-13 至 F1-3-12-13 琼脂上的 F1 代线虫子代已培养 1 d。
36（F2-1-1-10 至 F2-3-12-10）F2代线虫在F2-1-1-10至F2-3-12-10号琼脂平板上已生长1天。
36（F3-1-1-7 至 F3-3-12-7）F3代线虫在F3-1-1-7至F2-3-12-7号琼脂平板上已培养1天。
1836（F1-1-1-15 至 F1-3-12-15）36（F1-1-1-13 至 F1-3-12-13，计数后清除）F1代线虫在F1-1-1-13至F1-3-12-13号琼脂平板上已培养2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F2-1-1-12 至 F2-3-12-12）36（F2-1-1-10 至 F2-3-12-10，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-10至F2-3-12-10号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂平板。
36（F3-1-1-9 至 F3-3-12-9）36（F3-1-1-7 至 F3-3-12-7，计数后清除）F3代线虫在F3-1-1-7至F3-3-12-7号琼脂平板上已生长2天，计数后清除琼脂。
36（F1-1-1-14 至 F1-3-12-14）F1代线虫在F1-1-1-14至F1-3-12-14号琼脂平板上已生长1天。
36（F2-1-1-11 至 F2-3-12-11）F2-1-1-11 至 F2-3-12-11 琼脂上的 F2 代线虫子代已培养 1 天。
36（F3-1-1-8 至 F3-3-12-8）F3代线虫在F3-1-1-8至F2-3-12-8号琼脂平板上已培养1天。
在MGR研究中，T2’将于今日开始繁殖T3’。以野生型C. elegans的寿命为例，其寿命为15天。因此，T3’的寿命将在D33结束。
1936（F1-1-1-15 至 F1-3-12-15，续）36（F1-1-1-14 至 F1-3-12-14，计数后清除）F1代线虫在F1-1-1-14至F1-3-12-14号琼脂平板上已生长2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F2-1-1-13 至 F2-3-12-13）36（F2-1-1-11 至 F2-3-12-11，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-11至F2-3-12-11号琼脂平板上已培养2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F3-1-1-10 至 F3-3-12-10）36（F3-1-1-8 至 F3-3-12-8，计数后清除）F3代线虫在F3-1-1-8至F3-3-12-8号琼脂平板上已培养2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F1-1-1-15 至 F1-3-12-15）F1-1-1-15 至 F1-3-12-15 琼脂上的 F1 代线虫子代已培养 1 天。
36（F2-1-1-12 至 F2-3-12-12）F2代线虫在F2-1-1-12至F2-3-12-12号琼脂平板上已生长1天。
36（F3-1-1-9 至 F3-3-12-9）F3代线虫在F3-1-1-9至F2-3-12-9培养基上已生长1天。
2036（F2-1-1-14 至 F2-3-12-14）36（F1-1-1-15 至 F1-3-12-15，计数后清除）F1代线虫在F1-1-1-14至F1-3-12-14号琼脂平板上已生长2天，计数后琼脂平板被清除。不再有新的F1代子代产生。
36（F3-1-1-11 至 F3-3-12-11）36（F2-1-1-12 至 F2-3-12-12，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-12至F2-3-12-12培养基上已生长2天，计数后清除培养基。
36（F3-1-1-9 至 F3-3-12-9，计数后清除）F3代线虫在F3-1-1-9至F3-3-12-9培养基上已生长2天，计数后清除培养基。
36（F2-1-1-13 至 F2-3-12-13）F2-1-1-13 至 F2-3-12-13 琼脂上的 F2 代线虫后代已培养 1 d。
36（F3-1-1-10 至 F3-3-12-10）F3代线虫在F3-1-1-10至F2-3-12-10号琼脂平板上已培养1天。
2136（F2-1-1-15 至 F2-3-12-15）36（F2-1-1-13 至 F2-3-12-13，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-13至F2-3-12-13号琼脂平板上已培养2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F3-1-1-12 至 F3-3-12-12）36（F3-1-1-10 至 F3-3-12-10，计数后清除）F3代线虫在F3-1-1-10至F3-3-12-10号琼脂平板上已生长2天，计数后清除琼脂平板。
36（F2-1-1-14 至 F2-3-12-14）F2代线虫在F2-1-1-14至F2-3-12-14号琼脂平板上已生长1天。
36（F3-1-1-11 至 F3-3-12-11）F3代线虫在F3-1-1-11至F2-3-12-11号琼脂平板上已生长1天。
2236（F2-1-1-15 至 F2-3-12-15，续）36（F2-1-1-14 至 F2-3-12-14，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-14至F2-3-12-14号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂。
36（F3-1-1-13 至 F3-3-12-13）36（F3-1-1-11 至 F3-3-12-11，计数后清除）F3代线虫在F3-1-1-11至F3-3-12-11号琼脂平板上已生长2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F3-1-1-12 至 F3-3-12-12）F3代线虫在F3-1-1-12至F2-3-12-12琼脂平板上已生长1天。
2336（F3-1-1-14 至 F3-3-12-14）36（F2-1-1-15 至 F2-3-12-15，计数后清除）F2代线虫在F2-1-1-15至F2-3-12-15号琼脂平板上已生长2天，计数后琼脂平板被清除。此后不再有F2代子代线虫产生。
36（F3-1-1-12 至 F3-3-12-12，计数后清除）F3代线虫在F3-1-1-12至F3-3-12-12号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂平板。
36（F3-1-1-13 至 F3-3-12-13）F3代线虫在F3-1-1-13至F2-3-12-13号琼脂平板上已生长1天。
2436（F3-1-1-15 至 F3-3-12-15）36（F3-1-1-13 至 F3-3-12-13，计数后清除）F3代线虫在F3-1-1-13至F3-3-12-13号琼脂平板上已培养2天，计数后琼脂平板被清除。
36（F3-1-1-14 至 F3-3-12-14）F3代线虫在F3-1-1-14至F2-3-12-14号琼脂平板上已培养1天。
2536（F3-1-1-15 至 F3-3-12-15，续）36（F3-1-1-14 至 F3-3-12-14，计数后清除）F3代线虫在F3-1-1-14至F3-3-12-14号琼脂平板上已培养2天，计数后清除琼脂平板。
36（F3-1-1-15 至 F3-3-12-15）F3代线虫在F3-1-1-15至F2-3-12-15号琼脂平板上已生长1天。
2636（F3-1-1-15 至 F3-3-12-15，计数后清除）F3代线虫在F3-1-1-15至F3-3-12-15号琼脂平板上已生长2天，计数后琼脂平板被清除。
值得注意的是，在MGR研究中，F3代首次未暴露的子代（即T3’）将在第18天出生。以野生型C. elegans的寿命为例，其寿命为15天。因此，T3’代寿命的结束时间将为第33天。
当线虫寿命较长时，MGE 和 MGR 研究将持续更长时间。

表1：标记物列表及其定义。

  1. 在多代暴露（MGE）效应研究中测量繁殖力和寿命。
    1. 在第0天（D0），重复步骤5.6。将琼脂平板标记为Fx-a-b-c（共3组，每组10个重复），其中x表示代数，a表示组别（1为对照组，2为低浓度组，3为高浓度组）；b表示重复编号（1至10）；c表示暴露持续时间（0表示起始）。对于D0，将琼脂平板标记为F0-1-1-0至F0-3-10-0。读者可参考表1获取详细信息。
    2. 在第1天（D1），检查琼脂平板上线虫的生长情况，并将标记从F0-1-1-0至F0-3-10-0更改为F0-1-1-1至F0-3-10-1。
    3. 在第2天（D2），检查琼脂平板上线虫的生长情况，并将标记更改为F0-1-1-2至F0-3-10-2。
    4. 在第3天（D3），从每组中挑取24只F0代线虫，转移到12个新的NGM琼脂平板上（使用步骤5.4制备的两个NGM平板）。将新平板标记为F0-1-1-3至F0-3-12-3。
    5. 在第4天（D4），通过挑取的方式将F0-1-1-3至F0-3-12-3平板上的两只亲本线虫转移至步骤5.4中新制备的NGM琼脂平板上。将新NGM平板标记为F0-1-1-4至F0-3-12-4。同时，将F0-1-1-3至F0-3-12-3平板的标记更改为F1-1-1-1至F1-3-12-1，以表示F0代开始繁殖后第一天产生的子代（即F1代）。
    6. 在第5天（D5），使用解剖显微镜计数F1-1-1-1至F1-3-12-1平板上的线虫数量（此时线虫已生长2天）。让F1-1-1-1至F1-3-12-1平板继续繁殖F2代，用于后续多代暴露效应研究。
    7. 通过挑取的方式，将F0-1-1-4至F0-3-12-4平板上的两只亲本线虫转移至步骤5.4中新制备的NGM琼脂平板上。将新NGM平板标记为F0-1-1-5至F0-3-12-5。同时，将F0-1-1-4至F0-3-12-4平板的标记更改为F1-1-1-2至F1-3-12-2，以表示F0代开始繁殖后第二天产生的子代（即F1代）。
    8. 在第6天（D6），计数F1-1-1-2至F1-3-12-2平板上的线虫数量。将F0-1-1-5至F0-3-12-5平板上的亲本线虫转移至F0-1-1-6至F0-3-12-6平板。同时，将F0-1-1-5至F0-3-12-5平板的标记更改为F1-1-1-3至F1-3-12-3，以表示F0代开始繁殖后第三天产生的子代（即F1代）。
    9. F1-1-1-1至F1-3-12-1平板上的线虫已生长3天。利用这些线虫繁殖F2代，用于后续的多代暴露效应研究。依此方法，使用F2代线虫繁殖F3代，持续进行多代暴露效应研究。
    10. 采用相同方法，每天转移两只亲本线虫，并在次日计数其子代线虫数量，直至每组中6个NGM平板（即每组总平板数的一半）上的亲本线虫停止繁殖为止。
    11. 将整个繁殖期间产生的子代总数计算为总产仔数（total brood size）。以亲本前三天内产生的子代数量代表其初始繁殖力。
    12. 以每组中6个NGM平板上亲本线虫停止繁殖的日期估算繁殖持续时间。以每只亲本线虫存活的天数作为其寿命。
    13. 采用与F0代相同的方法，获得F1代的初始繁殖力、繁殖持续时间、总产仔数和寿命。类似地，通过重复上述操作，可获得F2代（至Fn代）的繁殖力和寿命信息。
  2. 在多代残留（MGR）效应研究中测量繁殖力和寿命。
    1. 执行步骤7.2.4，但将步骤5.4中的NGM琼脂平板替换为步骤2.13中制备的NGM琼脂平板。
  3. 测量生化指标。
    1. 用无菌水冲洗NGM琼脂平板上的线虫，并收集至离心管中。静置30分钟，弃去上清液。使用沉淀中的线虫进行效应测定。
    2. 向1.5 mL离心管中的线虫沉淀加入1 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0），以洗涤线虫。
    3. 在4 °C条件下，以10,000 × g离心5分钟，然后用移液器小心弃去上清液。
    4. 使用液氮或-80 °C超低温冰箱对沉淀进行速冻。
    5. 在冰浴中使用研杵匀浆沉淀。取出研杵前，用200 µL预冷PBS冲洗研杵上残留的液体并收集至离心管中。
    6. 再次在4 °C条件下以10,000 × g离心5分钟，取上清液用于商业试剂盒检测生化物质的活性或含量（详见材料表）。
    7. 测定样品中总蛋白（TP）含量，并将其结果作为分母用于表示其他生化指标，以消除不同样品间线虫数量差异的影响。
  4. 测量基因表达。
    1. 重复步骤7.4.1至7.4.4。使用商业RNA提取试剂盒（详见材料表）按照制造商说明书从线虫样品中提取总RNA21。
    2. 按照制造商说明书，使用RNA合成cDNA21。
    3. 使用SYBR Green RT-PCR试剂盒（见材料表），按照制造商说明书对cDNA样品进行实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）分析21。
    4. 采用2-ΔΔCT法量化目标基因的相对表达水平22，并将gdp-2（或其他参考基因）的表达水平作为阴性参照。

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结果

本文介绍了利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行跨代（TG）、多代暴露（MGE）和多代残留效应（MGR）研究化学物质对后代影响的实验方案。我们以自身研究结果为例进行说明：一项研究展示了重金属对运动行为的跨代效应3；另外两项研究则展示了磺甲氧唑和林丹对繁殖能力及生化与遗传指标的多代暴露和多代残留效应4,14。

重金属对运动行为的TG效应 秀丽隐杆线虫

研究了镉（Cd）、铜（Cu）、铅（Pb）和锌（Zn）对线虫亲代（F0）经母体暴露后及其子代（T1）体部弯曲频率（B...

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讨论

为了成功实施所述实验方案，应考虑以下建议。整个实验操作应在无菌环境中进行。操作不当可能导致E. coli菌株污染，例如真菌和螨类可能阻碍C. elegans的正常生长，从而影响实验结果。在描述培养C. elegans的部分中，应通过肉眼或显微镜观察C. elegans在NGM琼脂上的生长情况。当C. elegans在琼脂表面的覆盖面积超过75%，或培养时间超过一周时，应进行新一轮的接种，以避免C. elegans过度生长或种群衰退。在进行同步化处理前，应使用显微镜观察C. elegans的生长状态，并在线虫卵在琼脂上广泛分布时继续后续操作。此外，若使用溶剂（如二甲基亚砜[DMSO]），其储备液中的浓度应低于1%，以确保最终浓度不超过0.5%（v/v），避免溶剂本身产生不良影响。在跨代效应（TG）研究中，暴露时间应超过24小时，以确保覆盖下一代胚胎形成阶段，同时暴露时间应控制在96小时内，以便后续进行世代分离。在测定寿命和繁殖力时，应使用少量线虫（通常不超过20条）；而在测定生化和基因调控指标时，则应使用大量线虫（...

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披露

作者感谢国家水体污染控制与治理科技重大专项（2017ZX07201004）和国际科学 &中国科技合作计划（编号：2016YFE0123700）

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 琼脂粉OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK9002-18-0
79nnHT 实时荧光定量 PCR 系统 Applied Biosystems 
96 孔无菌微孔板Costar?Corning?America
高压灭菌器Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
生物安全柜LongYue, 上海龙跃仪器设备有限公司, 中国
氯化钙国药集团化学试剂有限公司, 中国10043-52-4
离心机  5417REppendorf, 艾本德（上海）国际贸易有限公司, 德国
离心管Axygen, 爱杰金生物科技（杭州）有限公司, 美国
胆固醇国药集团化学试剂有限公司, 中国57-88-5
二甲基亚砜VETEC, 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司, 美国67-68-5
磷酸氢二钠国药集团化学试剂有限公司, 中国7558-79-4
乙醇国药集团化学试剂有限公司, 中国64-17-5
滤器Thermo, Thermo Fisher Scientific, 美国
培养箱YiHeng17, 上海一恒科学仪器有限公司, 中国
接种环
K2HPO4•3H2O国药集团化学试剂有限公司, 中国16788-57-1
牛皮纸
微孔板读板仪Boitek, 博腾仪器有限公司, 美国
MgSO4•7H2O国药集团化学试剂有限公司, 中国10034-99-8
显微镜 XTL-BM-9TDBM, 上海 BM 光学仪器制造有限公司, 中国 
培养皿
移液器Eppendorf, 艾本德（上海）国际贸易有限公司, 德国
氯化钾国药集团化学试剂有限公司, 中国7447-40-7
磷酸二氢钾国药集团化学试剂有限公司, 中国7778-77-0
Qiagen RNeasy 试剂盒Qiagen Inc., Valencia, CA, 美国
QuantiTect SYBR Green RT-PCR 试剂盒Qiagen Inc., Valencia, CA, 美国
RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒Thermo Scientific, Wilmington, DE, 美国
氯化钠国药集团化学试剂有限公司, 中国7647-14-5
氢氧化钠国药集团化学试剂有限公司, 中国1310-73-2
次氯酸钠溶液阿拉丁, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 中国7681-52-9
胰蛋白胨OXOID, Thermo Fisher Scientific, 英国73049-73-7
酵母提取物OXOID, Thermo Fisher Scientific, 英国119-44-8

参考文献

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使用 Caenorhabditis elegans 研究毒物的跨代与多代效应
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