持久性化学物质的跨代和多代效应对于评估其对环境和人类健康的长期影响至关重要。我们提供了利用自由生活的线虫Caenorhabditis elegans研究跨代和多代效应的新型详细方法。
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本文内容
摘要
摘要
了解化学品的毒性信息对其应用和废物管理至关重要。对于低浓度化学品而言，其长期效应在评估环境和人类健康影响方面尤为重要。在揭示长期影响方面，近期研究中关于化学品跨代效应的发现提供了新的见解。本文描述了利用自由生活的线虫Caenorhabditis elegans研究化学品多代效应的实验方案。主要介绍两个方面：（1）跨代效应（TG）研究；（2）多代效应研究，后者进一步分为多代暴露（MGE）和多代残留效应（MGR）研究。跨代效应研究具有较强的可靠性，其主要目的是确定亲代接触化学品后是否会对后代产生任何残留影响。在完成对亲代表型的检测后，使用次氯酸钠溶液杀死亲代，保留后代，以便于对后代进行效应评估。该方法用于判断当亲代暴露于污染物时，其后代是否受到影响。多代暴露与多代残留效应研究则系统性地用于评估连续多代暴露是否会导致后代在多代过程中产生适应性反应。通过精细的挑取和转移操作区分不同世代，以利于对每一代进行效应测量。我们还整合了多种实验方案，用于检测运动行为、繁殖能力、寿命、生化指标以及基因表达的变化。此外，本文还列举了一些示例实验，以说明跨代和多代效应研究的具体实施。
引言
化学品的应用与废物管理在很大程度上依赖于其在特定浓度下效应的信息。值得注意的是，时间是效应与浓度之间另一个关键因素。也就是说，化学品——尤其是实际环境中低浓度的化学品——需要一定时间才能引发可测量的效应1。因此，研究人员在动物实验中设置不同长度的暴露持续时间，甚至覆盖整个生命周期。例如，小鼠暴露于尼古丁30、90或180天以研究其毒性效应2。然而，此类暴露时长仍不足以阐明污染物（如持久性有机污染物[POPs]）在环境中跨多代生物所造成的长期效应。因此，关于跨代效应的研究正受到越来越多的关注。
代际效应研究主要包括两个方面。第一个是跨代效应（TG）研究，可有效检验亲代接触化学物质是否会对子代产生任何影响3。第二个是多代效应研究，该研究更为系统，同时考虑暴露效应和残留效应。一方面，多代暴露（MGE）效应用于说明动物对长期不利环境的适应性反应；另一方面，多代残留（MGR）效应用于揭示暴露后的长期残留影响，因为母体暴露会伴随胚胎对第一代子代的暴露以及生殖系对第二代子代的暴露，从而使第三代子代成为完全未暴露的第一代4。
尽管哺乳动物（例如小鼠）在毒性研究中，特别是与人类相关的研究中是常用的模式生物，但其在代际效应研究中的应用非常耗时、昂贵且存....
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方案
1. 培养 E. coli OP50
- 通过将 4 g 氢氧化钠溶解于 100 mL 水中，制备 1 M 氢氧化钠溶液。
- 在 1 L 锥形瓶中，将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g 氯化钠溶于 1 L 超纯水中，配制溶菌肉汤（LB）培养基。用 1 M 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.0。
- 将步骤 1.2 中的 LB 液体培养基分装至 20 个锥形瓶中（最大允许体积：100 mL），每瓶加入 50 mL 培养基。用牛皮纸覆盖锥形瓶口。
- 在 121 °C 和 0.105 MPa 条件下灭菌 20 分钟。将 LB 培养基冷却至室温。
- 用移液器从细菌悬液（见步骤 1.8）中吸取 200 µL，或用接种环从琼脂平板（步骤 2.14）上挑取少量菌落，转移至 LB 培养基中。
- 在 37 °C、150 rpm 振荡条件下培养 24–48 小时。LB 培养基将由棕色透明液体变为浑浊的黄褐色悬液。
- 使用占总瓶数 80% 的细菌悬液，为线虫提供 E. coli OP50 作为食物，用于步骤 2.11。
- 将剩余含细菌悬液的锥形瓶于 4 °C 冰箱中保存。吸取 200 µL LB 悬液接种至新鲜 LB 培养基（步骤 1.4）上表面，并重复步骤 1.6 进行后续培养。
2. 培养 ....
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结果
本文介绍了利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行跨代（TG）、多代暴露（MGE）和多代残留效应（MGR）研究化学物质对后代影响的实验方案。我们以自身研究结果为例进行说明：一项研究展示了重金属对运动行为的跨代效应3；另外两项研究则展示了磺甲氧唑和林丹对繁殖能力及生化与遗传指标的多代暴露和多代残留效应4,14。
重金属对运动行为的TG效应 秀丽隐杆线虫
研究了镉（Cd）、铜（Cu）、铅（Pb）和锌（Zn）对线虫亲代（F0）经母体暴露后及其子代（T1）体部弯曲频率（B.......
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讨论
为了成功实施所述实验方案，应考虑以下建议。整个实验操作应在无菌环境中进行。操作不当可能导致E. coli菌株污染，例如真菌和螨类可能阻碍C. elegans的正常生长，从而影响实验结果。在描述培养C. elegans的部分中，应通过肉眼或显微镜观察C. elegans在NGM琼脂上的生长情况。当C. elegans在琼脂表面的覆盖面积超过75%，或培养时间超过一周时，应进行新一轮的接种，以避免C. elegans过度生长或种群衰退。在进行同步化处理前，应使用显微镜观察C. elegans的生长状态，并在线虫卵在琼脂上广泛分布时继续后续操作。此外，若使用溶剂（如二甲基亚砜[DMSO]），其储备液中的浓度应低于1%，以确保最终浓度不超过0.5%（v/v），避免溶剂本身产生不良影响。在跨代效应（TG）研究中，暴露时间应超过24小时，以确保覆盖下一代胚胎形成阶段，同时暴露时间应控制在96小时内，以便后续进行世代分离。在测定寿命和繁殖力时，应使用少量线虫（通常不超过20条）；而在测定生化和基因调控指标时，则应使用大量线虫（.......
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披露
作者感谢国家水体污染控制与治理科技重大专项（2017ZX07201004）和国际科学 &中国科技合作计划（编号：2016YFE0123700）
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂粉 | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT 实时荧光定量 PCR 系统 | Applied Biosystems | ||
| 96 孔无菌微孔板 | Costar?Corning?America | ||
| 高压灭菌器 | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| 生物安全柜 | LongYue, 上海龙跃仪器设备有限公司, 中国 | ||
| 氯化钙 | 国药集团化学试剂有限公司, 中国 | 10043-52-4 | |
| 离心机 5417R | Eppendorf, 艾本德（上海）国际贸易有限公司, 德国 | ||
| 离心管 | Axygen, 爱杰金生物科技（杭州）有限公司, 美国 | ||
| 胆固醇 | 国药集团化学试剂有限公司, 中国 | 57-88-5 | |
| 二甲基亚砜 | VETEC, 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司, 美国 | 67-68-5 | |
| 磷酸氢二钠 | 国药集团化学试剂有限公司, 中国 | 7558-79-4 | |
| 乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司, 中国 | 64-17-5 | |
| 滤器 | Thermo, Thermo Fisher Scientific, 美国 | ||
| 培养箱 | YiHeng17, 上海一恒科学仪器有限公司, 中国 | ||
| 接种环 | |||
| K2HPO4•3H2O | 国药集团化学试剂有限公司, 中国 | 16788-57-1 | |
| 牛皮纸 | |||
| 微孔板读板仪 | Boitek, 博腾仪器有限公司, 美国 | ||
| MgSO4•7H2O | 国药集团化学试剂有限公司, 中国 | 10034-99-8 | |
| 显微镜 XTL-BM-9TD | BM, 上海 BM 光学仪器制造有限公司, 中国 | ||
| 培养皿 | |||
| 移液器 | Eppendorf, 艾本德（上海）国际贸易有限公司, 德国 | ||
| 氯化钾 | 国药集团化学试剂有限公司, 中国 | 7447-40-7 | |
| 磷酸二氢钾 | 国药集团化学试剂有限公司, 中国 | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy 试剂盒 | Qiagen Inc., Valencia, CA, 美国 | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR 试剂盒 | Qiagen Inc., Valencia, CA, 美国 | ||
| RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒 | Thermo Scientific, Wilmington, DE, 美国 | ||
| 氯化钠 | 国药集团化学试剂有限公司, 中国 | 7647-14-5 | |
| 氢氧化钠 | 国药集团化学试剂有限公司, 中国 | 1310-73-2 | |
| 次氯酸钠溶液 | 阿拉丁, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 中国 | 7681-52-9 | |
| 胰蛋白胨 | OXOID, Thermo Fisher Scientific, 英国 | 73049-73-7 | |
| 酵母提取物 | OXOID, Thermo Fisher Scientific, 英国 | 119-44-8 |
参考文献
- Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
- Li, W., et al.
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