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方法文章

不同植物物种茎尖分生组织的共聚焦活体成像

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DOI：

10.3791/59369

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2019年3月29日

 , 
1Department of Botany and Plant Pathology, Purdue University, 2Purdue Center for Plant Biology, Purdue University

本文内容

摘要

本实验方案介绍了如何利用激光扫描共聚焦显微镜对不同植物物种的茎尖分生组织进行活体成像与分析。

摘要

茎尖分生组织（SAM）作为一种保守的干细胞储库，在胚胎后发育过程中几乎产生所有的地上组织。SAM的活性与形态决定了重要的农艺性状，例如茎的构型、生殖器官的大小与数量，以及最为重要的籽粒产量。本文提供了一种详细的实验方案，通过激光扫描共聚焦显微镜对多种物种的活体SAM表面形态及其内部细胞结构进行分析。整个实验流程从样品制备到获得高分辨率三维（3D）图像可在短短20分钟内完成。我们证明，该方案不仅适用于研究模式物种的花序SAM，也适用于多种作物的营养分生组织，为跨物种研究分生组织的结构与发育提供了一种简便而强大的工具。

引言

植物分生组织含有一个未分化的干细胞库，能够持续维持植物器官的生长与发育1。在胚胎后发育过程中，植物几乎所有地上组织均起源于茎尖分生组织（SAM）。在农作物中，SAM的活性和大小及其衍生的花分生组织与多种农艺性状密切相关，例如茎的构型、果实产量和种子产量。例如，在番茄中，SAM的扩大导致茎和花序分枝增加，从而产生额外的花和果实器官2。在玉米中，SAM尺寸的增加可带来更高的种子数量和总产量3,4。在大豆中，分生组织的无限生长特性也与茎的构型和产量密切相关5。

分生组织（SAM）的形态和解剖结构可通过多种方法进行表征，包括组织学切片/染色和扫描电子显微镜（SEM）6，这两种方法分别提供了SAM的截面视图或三维（3D）表面视图，极大地推动了分生组织的研究。然而，这两种方法均耗时较长，从样品制备到数据采集涉及多个实验步骤，且主要依赖固定样品。近年来，激光扫描共聚焦显微镜技术的进步克服了这些局限性，为我们提供了研究植物组织和器官细胞结构及发育过程的有力工具7,8。共聚焦显微镜通过光学而非物理切片，可采集一系列z轴层扫描图像，并借助图像分析软件对样品进行后续的三维重建。

在此，我们介绍一种利用激光扫描共聚焦显微镜高效研究多种植物活体分生组织内部及表面结构的实验方法，该方法可使研究人员在短至20分钟内完成全部实验流程。与已发表的其他活体共聚焦成像方法不同 拟南芥 花序分生组织9,10,11,12,13,14,15 和 拟南芥 花12,13，本文展示了该方案不仅适用于研究模式物种的花序分生组织，也高效适用于多种作物的营养期茎尖分生组织研究，例如番茄和大豆。该方法不依赖转基因荧光标记，因而有望广泛应用于多种不同物种和品种的茎尖分生组织研究。此外，我们还介绍了简单的图像处理步骤，用于观察和分析不同的茎尖分生组织 三维视图。综上所述，这种简单的方法将有助于研究人员更好地理解模式生物和作物分生组织的结构及其发育过程。

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方案

1. 培养基和成像培养皿的制备

  1. MS 培养基平板：将 0.5 倍浓度的 Murashige & Skoog MS 培养基和 1% 琼脂加入去离子水中，然后用氢氧化钾溶液调节 pH 至 5.8（可选：为长期培养植物，可添加 1% 蔗糖）。高压灭菌后倒平板。
  2. 成像培养皿：将熔化的 1.5% 琼脂糖倒入塑料培养皿（直径 6 cm，深度 1.5 cm）中，填充至 0.5–0.8 cm 高度。

2. 植物生长

  1. 拟南芥 生长
    1. 将灭菌后的种子播种于 MS 培养基平板上，将平板置于 4 °C 条件下处理两天。随后将 MS 平板转移至短日照（8 小时光照 / 16 小时黑暗）、22 °C 环境中培养两周。
    2. 将幼苗移栽至土壤中，在短日照（8 小时光照 / 16 小时黑暗）、22 °C 条件下继续生长四周。
    3. 将植株转移至连续光照、22 °C 环境中，以诱导其从营养生长阶段向生殖生长阶段转变，并用于花序分生组织（SAM）的成像观察。
  2. 番茄和大豆生长
    1. 将种子用湿润滤纸包裹后，在 28 °C 条件下孵育直至发芽。
    2. 将幼苗移栽至土壤中，在长日照（16 小时光照 / 8 小时黑暗）、25 °C 条件下生长一周或更长时间，用于营养生长阶段分生组织（SAM）的成像观察。

3. 茎尖的解剖

  1. 花序茎尖的解剖
    1. 用剃刀从抽薹的Arabidopsis植株上切下花序茎尖及其下方1-2 cm的主茎。用手握住主茎基部，用珠宝镊子剔除主茎上尽可能多的老化花器官。
      注意：使用剃刀时避免割伤手指。用过的剃刀应放入专用的锐器容器中妥善处理。
    2. 在体视显微镜视野下，用珠宝 镊子或手指夹住茎尖附着的茎部，继续去除剩余的花，直至几乎整个茎尖分生组织（SAM）均可从目镜中观察到。在主茎连接处彻底清除花梗。
  2. 营养茎尖的解剖
    1. 为观察番茄或大豆的营养茎尖分生组织（SAM），需从植株上解剖去除子叶、叶片和根部。
    2. 在体视显微镜下夹住植株的下胚轴，用珠宝镊子进一步去除覆盖在营养茎尖分生组织（SAM）上的叶原基。

4. 染色

  1. 为了直接观察分生组织（SAM）中的细胞，使用新配制的碘化丙啶（PI）溶液对细胞壁进行染色。将PI粉末溶于无菌去离子水中，配制1 mg/mL浓度的1 mL PI染色液，并将PI溶液置于避光的微量离心管中保存。
  2. 取50 µL PI溶液加入洁净的空培养皿中，将完整分离的茎尖浸入染料中染色2分钟。用无菌去离子水冲洗染色后的茎尖两次。在染色过程中，需将整个花序分生组织（SAM）或营养分生组织（SAM）完全浸入PI溶液中，以实现均匀染色。

5. 图像采集

注意：本方法中，所有SAM均使用直立式共聚焦显微镜配合20倍水浸物镜进行成像。如其他方案所述9,12,13,15，也可使用倒置显微镜对SAM进行成像。此外，活体成像可采用不同品牌的共聚焦显微镜完成，样品制备步骤相同。本研究中以实例详细描述了成像步骤。

  1. 使用镊子在成像培养皿中心打孔，并将染色后的茎尖垂直插入培养基中。
  2. 向成像培养皿中加入无菌去离子水，完全浸没样品。在体视显微镜下观察，通过移液器反复吹打以去除分生组织周围被困住的气泡。然后调整茎在琼脂中的角度，确保从正上方能够完全观察到茎尖分生组织（SAM）。
  3. 将成像培养皿放置在共聚焦显微镜的样品台上。降低水浸物镜，并升高显微镜样品台，使物镜尖端浸入水中。
  4. 打开共聚焦显微镜软件，在目镜的明场视野中定位茎尖分生组织（SAM）。通过调节XY控制器将SAM样品移至物镜正下方，然后通过谨慎调节Z控制器，从目镜中对SAM进行对焦。
  5. 操作共聚焦显微镜软件（见材料表）中的采集功能，启动实时模式，在计算机屏幕上观察样品，并设置激光扫描实验的全部参数。
    1. 调节参数时，使用范围指示器功能判断信号是否饱和。
    2. 可选地，使用重用功能从选定的共聚焦文件中重新加载所有参数设置。
      注意：推荐成像参数如下：激光线（激发）：515 nm 或 561 nm；发射波长：570–650 nm；针孔：1 个艾里单位（AU）；增益：600–750；扫描模式：帧扫描；帧尺寸：512 × 512 或 1024 × 1024；扫描速度：7 至最大值；扫描方向：双向；平均次数：2–4；平均方法：均值；位深度：16 位；扫描间隔：0.5–1 µm。此外，应根据不同的植物样品特性及具体成像需求进一步优化上述所有参数。

6. 图像处理

  1. 为了可视化光学正交切面和横向切面视图，请使用相同的商业软件进行图像采集。打开原始共聚焦文件，点击正交（ortho）菜单，选择正交（ortho）功能。然后选择图像的 x 位置、y 位置或 z 位置，并将图像保存为 tiff 文件。
    1. 可选地，选择 3D 距离 功能，以定义从共聚焦图像堆栈中选定的两个点之间的物理距离。
    2. 或者，使用 Fiji/ImageJ 这一开源图像处理软件包来可视化正交切面和横向切面视图。
    3. 使用 Fiji 打开原始共聚焦文件，点击图像（image）菜单，选择 堆栈（Stacks），然后选择 正交视图（Orthogonal views）。
    4. 在中间位置选择 XY、YZ 和 XZ 平面，并以 Tiff 格式保存图像。
  2. 为了可视化 3D 透明投影，请使用相同的软件。
    1. 打开原始共聚焦文件，点击 3D 菜单，选择 透明（Transparent） 以生成 3D 投影视图。
    2. 可选地，点击 3D 菜单，选择 外观（Appearance），然后选择 透明度（Transparency），以调整 3D 图像投影的三个参数：包括 阈值（Threshold）、渐变（Ramp） 和 最大值（Maximum）。
    3. 点击 3D 菜单，选择 外观（Appearance），然后选择 光照（Light），以调整 3D 图像的亮度。
    4. 导出投影图像，并将其保存为 Tiff 文件。
  3. 为了可视化 3D 最大强度投影，请使用相同的软件打开共聚焦文件，并点击 3D 菜单。
    1. 选择 3D 菜单，然后选择 最大（Maximum）。
    2. 或者，使用 Fiji/ImageJ 来可视化 3D 最大强度投影。
    3. 使用 Fiji 打开原始共聚焦文件，点击 图像菜单（Image menu），选择 堆栈（stacks）。
    4. 选择 3D 投影（3D project），并以 Tiff 格式保存图像。
  4. 为了可视化 3D 图像的深度编码视图，请使用相同的软件。
    1. 点击 3D 菜单，选择 外观（Appearance）。
    2. 选择 特殊（Special），然后选择 深度编码（Depth Coding）。
    3. 或者，使用 Fiji/ImageJ 来可视化深度编码视图。
    4. 打开共聚焦文件，点击 图像菜单（image menu），选择 超堆栈（Hyperstack）。
    5. 选择 时间-颜色编码（Temporal-Color code），并以 Tiff 格式保存图像。
      注：深度编码 z 堆栈也可通过 Fiji 的插件 Z Code Stack 实现。
  5. 为了可视化如图所示的 3D 旋转视图（视频 1 和 视频 2），请使用相同的软件（参见 材料表）。
    1. 打开共聚焦文件，点击 3D 菜单，选择 序列（Series）。
    2. 选择 渲染序列（Render series），并从以下四个选项中选择其一：绕 x 轴旋转、绕 y 轴旋转、起始与结束 和 位置列表。
    3. 将渲染序列保存为 AVI 文件。
    4. 或者，使用 Fiji/ImageJ 来可视化 3D 旋转视图。
    5. 使用 Fiji 打开原始共聚焦文件，点击 图像菜单（Image menu），选择 堆栈（Stacks）。
    6. 选择 3D 投影（3D project），并以 AVI 格式保存视频。

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结果

为了评估本实验方案的效率并探究不同物种分生组织的形态特征，我们对花序分生组织进行了共聚焦活体成像实验 拟南芥 以及番茄和大豆的营养分生组织。在本研究中， 拟南芥 生态型Landsberg erecta，番茄品种 Micro-Tom 和大豆品种 Williams 82 已被用作示例。

从中间正交切面观察 拟南芥 SAM中，PI能够对多层细胞中几乎所有细胞的横向细胞壁进行染色，这一点十分明显（图1A）。从花序分生组织茎尖的一个横切面显示，XY平面的细胞也得到了清晰成像（图1B）。在3D投影视图中，花序分生组织形成类似穹顶的结构，周围环绕着正在发育的花原基，这些区域的细胞也被染色并成像（图1 C-D) (视频 1

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讨论

本文介绍了一种简单的成像方法，经过少量修改后可应用于不同植物茎尖分生组织的研究，为在模式植物和作物中研究分生组织在营养期和生殖期的调控机制开辟了新途径。与扫描电镜（SEM）和组织化学染色方法相比，该实验方案无需繁琐的样品固定和/或组织切片步骤，即可同时呈现茎尖分生组织（SAM）的表面形态和内部细胞结构。此外，本方案还可与已建立的基于荧光报告基因的成像方法兼容，有望提供良好的细胞分辨率，从而获得关键基因和蛋白质在茎尖分生组织中表达模式的三维视图16,17,18,19。同时，本文所描述的配套图像处理流程将极大帮助研究人员对不同物种的茎尖分生组织进行三维分析与比较，推动进化发育生物学和农业科学研究的发展。

该简易实验方案中有几个关键步骤。首先，样品制备与解剖。植物茎尖分生组织（SAM）通常被 茎尖分生组织及其幼嫩器官位于茎尖...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢普渡大学Bindley生物科学中心成像设施提供激光扫描共聚焦显微镜的使用权限和技术支持，并感谢普渡大学Bindley成像设施中Andy Schaber提供的帮助。本项目由普渡大学资助，属于AgSEED Crossroads基金的一部分，旨在支持印第安纳州农业与农村发展。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
植物琼脂Dot Scientific Inc.DSA20300-1000
琼脂糖Dot Scientific Inc.AGLE-500
镊子ROBOZRS-4955Dumont #5SF 超细镊子，不锈钢尖端尺寸为 0.025 × 0.005 mm，用于解剖茎尖。
LSM 880 直立式共聚焦显微镜 Zeiss
Murashige & Skoog MS 培养基Dot Scientific Inc.DSM10200-50
Plan APO 20x/1.1 水浸物镜Zeiss
塑料培养皿 100 mm × 15 mmCELLTREAT Scientific Products229694用于制备 MS 平板
塑料培养皿 60 mm × 15 mmCELLTREAT Scientific Products229665用作成像培养皿
扦插培养基质Sungro Horticulture
碘化丙啶Acros Organics440300250溶于水的 1 mg/mL 溶液，用于染色细胞壁
剃须刀片PERSONNA62-0179用于从植株上切割茎尖
体视显微镜NikonSMZ1000
擦拭纸VWR82003-820
Zen blackZeiss图像采集软件

参考文献

  1. Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
  2. Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
  3. Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
  4. Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
  5. Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
  6. Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751(1953).
  7. Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
  8. Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331(2006).
  9. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  10. Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
  11. Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
  12. Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156(2017).
  13. Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).
  14. Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
  15. Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773(2017).
  16. Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
  18. Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043(2015).
  19. Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23(2013).
  20. Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).

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