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通过荧光激活细胞分选法从人皮肤中分离乳头层和网状层成纤维细胞

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DOI：

10.3791/59372

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2019年5月7日

 ,  , 
1Skin, Endothelium Research Division, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种基于流式细胞术（FACS）的方案，用于从人皮肤中分离乳头层和网状层成纤维细胞。该方法避免了传统通过组织块培养进行细胞分离时不可避免的体外培养过程。所获得的成纤维细胞亚群在功能上具有差异，并在真皮层内表现出不同的基因表达模式和空间定位。

摘要

成纤维细胞是一类高度异质性的细胞群体，参与多种人类疾病的发病机制。在人类皮肤真皮层中，成纤维细胞传统上根据其组织学定位被划分为浅层乳头层或深层网状层。在小鼠真皮层中，乳头层和网状层成纤维细胞起源于两个不同的谱系，在生理和病理过程中具有不同的功能，并表现出独特的细胞表面标志物表达谱，因而可以相互区分。

重要的是，来自表皮浅层和深层真皮层的组织外植体培养证据表明，人类皮肤真皮中同样存在至少两种功能上不同的真皮成纤维细胞谱系。然而，与小鼠皮肤不同，目前尚未建立可用于区分人类皮肤中不同成纤维细胞亚群的细胞表面标志物。我们开发了一种新的分离方法，利用两种细胞表面标志物——成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast Activation Protein, FAP）和胸腺细胞抗原1（Thymocyte antigen 1, Thy1）/CD90，通过荧光激活细胞分选（FACS）技术分离人类乳头层和网状层成纤维细胞群体。该方法能够在无需体外操作的情况下获得纯化的成纤维细胞亚群，避免了体外培养对基因表达的影响，从而可对人类真皮成纤维细胞亚群在组织稳态或疾病病理过程中的功能进行准确的功能分析。

引言

作为结缔组织的主要细胞成分，成纤维细胞主要负责胶原蛋白和弹性纤维的沉积，这些成分最终形成细胞外基质1，因此，成纤维细胞在组织稳态、再生及疾病中的作用长期以来被低估。然而，近年来成纤维细胞逐渐成为研究人员关注的焦点，不仅因为它们是诱导性多能干细胞的重要细胞来源2，更因其具有高度可塑性，并参与多种疾病的发病机制，如器官纤维化3,4,5和癌症6,7。

人类皮肤由多层上皮组织（即表皮）及其下方的结缔组织（即真皮）构成，真皮在组织学上可进一步分为浅层的乳头层和深层的网状层，主要由成纤维细胞和细胞外基质8以及皮下组织构成。根据其在组织中的位置，真皮成纤维细胞大致可分为乳头层成纤维细胞和网状层成纤维细胞1。

重要的是，最近的研究数据表明，这些真皮成纤维细胞亚群不仅在组织学上可区分，其功能也存在显著差异。在小鼠皮肤中，乳头层和网状层成纤维细胞在胚胎发育过程中起源于两个不同的谱系9。多项证据表明，这两个谱系不仅在组织稳态、毛囊形态发生、伤口修复和纤维化过程中发挥不同作用7,9,10，而且对恶性表皮干细胞发出的不同信号也表现出不同的响应11，提示它们在癌症发病机制中具有不同的功能。方便的是，在成年小鼠皮肤中，这两个谱系表达一组互斥的特异性细胞标志物，从而能够分离出纯的真皮成纤维细胞群体，并进一步在体外对其特定功能进行深入分析9,11。

相应地，已有研究描述了人类皮肤真皮中至少存在两种形态和功能不同的成纤维细胞亚群，它们具有不同的增殖速率、组织重塑能力12,13，以及在体外支持表皮干细胞生长的能力14,15。然而，目前大多数关于人类真皮成纤维细胞的研究均使用从皮肤组织块培养中分离得到的混合成纤维细胞群体，因为迄今为止尚未建立能够像在小鼠真皮中那样，通过特异性细胞表面标志物组合来分离纯化人表皮乳头层或网状层成纤维细胞亚群的方法。

我们最近的研究表明，人类皮肤乳头层和网状层成纤维细胞具有特定的细胞表面标志物，可通过荧光激活细胞分选技术（FACS）分离出相应的亚群16：FAP+CD90- 成纤维细胞代表主要位于真皮上层的乳头层成纤维细胞，具有较高的增殖速率和独特的基因表达特征，但无脂肪生成潜能。FAP+CD90+ 和 FAP-CD90+ 成纤维细胞属于位于真皮下层区室的网状层细胞系，其增殖能力较弱，但可高效进行脂肪生成——这是网状层成纤维细胞的典型特征。该方法不仅有助于深入研究这些不同成纤维细胞亚群在生理条件下的特异性功能，也为探讨包括皮肤癌在内的多种皮肤疾病发病机制提供了重要工具。

然而，由于成纤维细胞在二维体外培养中会改变其细胞表面标志物的表达16,17,19，本方案的应用仅限于从人真皮组织中分离原代成纤维细胞，无法在混合细胞培养群体中鉴定乳头层或网状层成纤维细胞。重要的是，尽管细胞表面标志物的表达在体外会发生变化，但我们已证明，根据下述方案分离的成纤维细胞亚群在培养过程中仍保留其特异性功能16，从而可在生理或病理条件下开展针对亚群特异性特性的体外研究。

综上所述，我们建立了一种通过流式细胞术分离不同成纤维细胞亚群的方案，该方案首次实现了从人皮肤真皮中分离出处于天然状态的纯成纤维细胞群体。

方案

皮肤样本取自26至61岁的高加索人种男性和女性（非日光暴露皮肤；腹部整形术和乳房缩小术）。在维也纳医科大学机构审查委员会批准下，依据《赫尔辛基宣言》要求，在组织采集前已获得患者的书面知情同意。

注意：我们提供了一种分离功能上不同的成纤维细胞亚群的方案，这些亚群可来源于全层真皮（请参见第1节），或在将人皮肤真皮分割为不同层次后进行分离（跳过第1节，直接参见第2节）。

1. 全层真皮的制备

  1. 将一块10 cm × 10 cm的人体皮肤组织（例如来自腹部整形或乳房缩小手术）表皮面向下放置在厚滤纸上。
  2. 用镊子紧紧夹住表皮边缘，用手术刀刮除皮下脂肪层。然后将组织切成5 mm宽的条状，再放入培养皿中。
    注意：此步骤有助于Dispase II（以下简称解离酶，见第3节）的渗透，适用于需要将表皮与整个真皮分离的情况。此时可跳过第2节，直接进入第3节。为避免污染，手术切除后应保持组织无菌，或用乙醇或碘溶液彻底清洗。若对皮肤表面进行乙醇处理，仅会引起轻微的细胞死亡。所有操作均应在组织培养超净台中的无菌条件下进行。

2. 使用制皮机将人皮肤真皮分为乳头层和网状层

  1. 将一块10 cm × 10 cm的皮肤组织（例如来自腹部整形或乳房缩小手术）放置在厚滤纸上，表皮朝上。用镊子夹紧皮肤边缘，固定皮肤。
  2. 使用电动取皮刀，调节切割厚度/深度至300 µm，将取皮刀头从自身方向向外滑动，刀片与皮肤表面呈90°角进行切片。
  3. 取下由表皮和乳头层真皮组成的首层组织（厚300 µm，“真皮层1”，图1 和 图2），放入培养皿中。立即进入第3节操作，或加入1×PBS以防止组织干燥。
    注意：为避免污染，手术切除后应保持组织无菌，或用乙醇或碘溶液彻底清洗。在组织培养超净台内无菌条件下操作。
    注意：操作取皮刀时需小心，因其刀片非常锋利。
  4. 重复步骤2.2，将取皮刀调节至700 µm的切割厚度，对剩余真皮进行切片。将定义为上层网状真皮的上层切片（“真皮层2”，图2）放入另一个独立的培养皿中。立即进入第4节操作，或加入1×PBS以防止组织干燥。
  5. 用手术刀刮除残余的下层网状真皮层（>1,000 µm）上的皮下脂肪层并弃去。收集下层网状真皮（“真皮层3”，图2）至另一培养皿中。立即进入第4节操作，或加入1×PBS以防止组织干燥。
    注意：也可不用手术刀刮除脂肪，而使用剪刀去除脂肪层。在刮除脂肪前，可将网状真皮置于冰上，有助于操作。

3. 表皮与真皮的分离

  1. 在无菌 1x PBS 中配制 3 U/mL 的解离酶（例如 Dispase II）溶液。将 5 mm 宽的皮肤条（来自第 1 节）或表皮/乳头层真皮（来自步骤 2.2），表皮面向上，放入盛有 10 mL 3 U/mL 解离酶溶液的 10 cm 培养皿中。于 37 °C 孵育 1 小时。
    1. 此处可暂停实验流程。改为将表皮/乳头层真皮置于蛋白酶溶液中，在 4 °C 冰箱内过夜孵育。如有需要，可将其他真皮层（真皮层 1、2 和 3）浸没于 1x PBS 中，置于 50 mL 离心管内，4 °C 过夜保存。
      注意：操作蛋白酶时需谨慎，接触后可能刺激皮肤和眼睛。
  2. 孵育结束后，将表皮/乳头层真皮转移至培养皿的干燥盖子上，用两把镊子分别夹住表皮或真皮的边缘，将表皮与上层真皮（真皮层 1）分离。

4. 皮肤组织的酶消化

  1. 用剪刀或解剖刀将每层真皮组织（真皮层1、2和3）分别尽可能充分地剪碎；组织碎片越小，越有利于后续的消化。
    注意：真皮组织的坚韧程度可能因其来源部位（例如腹部或上臂皮肤）不同而有所差异。
  2. 在含L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素（P/S），并加入终浓度为1.25 mg/mL的胶原酶I、0.5 mg/mL的胶原酶II、0.5 mg/mL的胶原酶IV以及0.1 mg/mL的透明质酸酶，配制成消化液（参见材料表）。
    注意：操作胶原酶时需格外小心，因其接触后可能刺激皮肤和眼睛。
  3. 将剪碎的每份组织分别加入10 mL上述消化液，转移至50 mL离心管中，在37 °C水浴中持续振荡孵育1小时。消化过程中应多次颠倒混匀离心管。
    注意：应根据剪碎皮肤组织的大小调整消化液体积。避免在10 mL消化液中加入过多组织，否则细胞得率将显著降低。建议组织总体积不超过消化液总体积的三分之一（1:2 w/v）。

5. 单细胞悬液制备与红细胞裂解

  1. 向消化后的组织中加入10 mL成纤维细胞培养基（含L-谷氨酰胺的DMEM，10% FCS和1% P/S），以终止酶解反应。此后操作均需在冰上进行。
  2. 将每支试管中的内容物倒入普通的无菌不锈钢茶筛，滤出的细胞悬液收集至洁净的培养皿中。用培养基冲洗滤筛，并用注射器活塞边缘压碎未消化的组织块。
  3. 随后，用移液器将收集的细胞悬液通过70 µm细胞滤筛转移至50 mL离心管中。用培养基冲洗细胞滤筛，并将滤过液全部收集至同一离心管中。
  4. 在4 °C下以500 × g离心10分钟。弃去上清液，用5 mL成纤维细胞培养基重悬细胞沉淀，洗涤一次。重复离心步骤。
  5. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL自制ACK红细胞裂解缓冲液（0.15 M NH4Cl，10 mM KHCO3，0.1 mM Na2EDTA；pH 7.2‒7.4）中，在室温（20‒22 °C）下孵育约1分钟。
  6. 加入9 mL含10% FCS的1×PBS终止裂解反应，再次在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。
    注意：若裂解不完全（沉淀呈红色），可适当调整红细胞裂解的孵育时间。但不可使细胞在红细胞裂解缓冲液中停留过久，以免导致成纤维细胞和免疫细胞裂解。

6. 成纤维细胞的封闭与FACS染色

  1. 在 100 µL 含 10% FCS 的 1× PBS 中加入 5 µL 人 Fc 受体阻断液，并将细胞重悬于 100 µL 人 Fc 阻断剂中。冰上孵育 10 分钟。
  2. 设计用于染色人真皮成纤维细胞的 FACS 染色方案。在含 10% FCS 的 1× PBS 中，按以下比例混合抗体：抗人 FAP APC（1:20）、抗人 CD90 AF700（1:30）、抗人 E-钙黏蛋白 PE（1:20）、抗人 CD31 FITC（1:30）、抗人 CD45 太平洋蓝（1:20）、抗人 ITGA6 PE（1:20）、抗人 CD235ab 太平洋蓝（1:1,000）以及抗人 CD106 太平洋蓝（1:100）。
  3. Fc 受体阻断后，在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 3 分钟，沉淀细胞。吸除并弃去上清液，将细胞重悬于 100 µL 抗体混合液中。在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
    1. 染色前，取细胞数量较多的样本 20 µL，用于制备未染色和单染 FACS 对照样本。
  4. 用 500 µL 含 10% FCS 的 1× PBS 将染色后的细胞及 FACS 对照样本洗涤两次，在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 3 分钟。同时，将 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）加入含 10% FCS 的 1× PBS 中，使其终浓度为 1 µg/mL。
  5. 吸除并弃去上清液，将细胞重悬于 200 µL DAPI 溶液中，通过 70 µm 细胞滤网过滤每份细胞悬液至 5 mL FACS 管中。
    注意：若 FACS 检测将延迟进行，则应在上机前立即加入 DAPI 并过滤。

7. 人皮肤成纤维细胞亚群分离与流式细胞术的设门策略

  1. 记录流式细胞术对照，设置正确的电压参数，并进行适当的补偿。圈选单细胞和活细胞（DAPI-）、Pacific blue、PE 和 FITC 阴性细胞（CD45-、CD31-、CD235ab-、CD106-、ITGA6- 和 E-cadherin-），以获得三种成纤维细胞群体：FAP+CD90-、FAP+CD90+ 和 FAP-CD90+ 细胞。见图3。
  2. 将三种成纤维细胞亚群分选至分别装有 350 µL 裂解缓冲液（用于RNA提取）或 350 µL 成纤维细胞生长培养基（参见材料表）的 1.5 mL 螺口微量离心管中。分选后立即轻轻颠倒混匀各管，并将装有裂解缓冲液的管子置于液氮中快速冷冻，或将装有培养基的管子置于冰上。
    注意：在通风橱中配制含 0.1% b-巯基乙醇的裂解缓冲液，避免吸入。

8. 成纤维细胞培养与脂肪生成检测

  1. 流式分选后，以500 x g离心细胞 g 在4 °C下离心3分钟，然后在成纤维细胞生长培养基中接种等量细胞（每孔5,000‒10,000个细胞）（参见 材料表在48孔细胞培养板中培养细胞，待细胞生长至70%汇合度。
  2. 在成纤维细胞生长培养基中加入 5 µg/mL 胰岛素、5 µM 曲格列酮、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和 1 µM 地塞米松，配制成脂肪细胞分化培养基。
  3. 将培养细胞的培养基更换为脂肪细胞分化培养基，诱导细胞分化14天。在第2天后更换为含5 µg/mL胰岛素和5 µM曲格列酮的减量脂肪生成培养基。每隔3天补充一次培养基。rd 或 4th 天
  4. 在分化第14天，于室温（20‒22 °C）下用4% PFA固定细胞20分钟。用60%异丙醇洗涤孔板，并使其完全挥发。用5 mM油红O（使用前过滤）染色细胞20分钟。用蒸馏水洗涤染色后的细胞4次。随后进行显微镜观察。
    警告： PFA 具有毒性且有害，需谨慎操作。
    注意： 此处可暂停实验流程。固定后的细胞可在4 °C条件下保存于1x PBS中，直至进行油红O染色。储存前需用封口膜覆盖培养皿，以防止蒸发。
  5. 使用倒置显微镜在10倍放大倍数下，以透射光观察浸没在水中的细胞图像。

结果

获取单细胞悬液的皮肤组织处理主要步骤概述见图1，包括皮肤切片（图1A）、不同真皮层结构（图1B）、皮下脂肪层的去除（图1C）、表皮与乳头层真皮的分离（图1D），以及机械法和酶解法组织解离的各个步骤（图1E、F）。图2展示了三层真皮结构的示意图。

图3展示了用于分析人皮肤中不同成纤维细胞亚群的流式细胞术染色 panel 的设门策略。其他不表达于成纤维细胞上的细胞表面标志物可用于排除皮肤中存在的多种其他细胞，例如免疫细胞、表皮细胞、间充质干细胞（MSCs）、红细胞或内皮细胞，从而获得高纯度的分离细胞群。使用与图2中完全相同的FACS panel来鉴定这些成纤维细胞亚群并非必需，但我们推荐采用该方案。研究者可使用不同荧光染料标记的抗体，或调整排除性标志物的组合。

值得注意的是，本方案能够鉴定出人类皮肤中三种成纤维细胞群体，这些群体在真皮内的定位、基因表达谱以及功能方面均有所不同（图4). FAP+CD90- 在乳头层真皮中富集，而FAP+CD90+ 和 FAP-CD90+ 在网状真皮中更为丰富（图 4A）。三种亚群在细胞培养分选后均表现出典型的成纤维细胞形态（图 4B）。有趣的是，它们在分化为脂肪细胞的能力上存在差异，而分化为脂肪细胞是网状成纤维细胞的标志性特征。将这些结果与通过实时聚合酶链式反应（RT-PCR）进行的基因表达谱分析相结合16 (图4C），表明 FAP+CD90- 细胞高表达通常归因于乳头状成纤维细胞的标志物，如 CD26、NTN 和 PDPN，而 CD90+ 细胞高表达已知的网状细胞标志物，如 CD36、ACTA2 和 PPARγ，因此我们得出结论：FAP+CD90- 细胞属于乳头状和CD90+ 细胞属于网状细胞系。

用于实验室分析的组织处理流程；包括切片、染色和样品过滤。
图 1：从完整人皮肤中分离真皮单细胞悬液。 （A）皮肤使用电动取皮刀切成乳头层和网状层真皮。 （B）乳头层真皮及其相邻的表皮厚度为 300 µm（上图），而上部网状层真皮厚度为 700 µm（下图）。 （C）使用手术刀刮除下部网状层真皮的皮下脂肪层。 （D）乳头层真皮在解离酶溶液中于 37 °C 孵育 1 小时后，可用镊子轻松去除表皮。 （E）不同真皮层用剪刀剪碎后转移至含有胶原酶 I、II、IV 和透明质酸酶的酶消化混合液中。 （F）在 37 °C 下解离 1 小时后，终止组织消化，并将悬液通过茶滤器过滤，以去除未消化的皮肤碎片。 （G）细胞悬液再经 70 µm 细胞滤器过滤一次，并在 4 °C 下以 500 × g 离心 10 分钟。 （H）离心后，细胞沉淀用含 10% FCS 的 1× PBS 洗涤，即可用于 FACS 染色。 请点击此处查看本图的放大版本。

人类皮肤结构示意图：表皮、真皮层、皮下组织、组织学切片、组织深度。
图2：使用皮片机将人皮肤真皮分为乳头层和网状层。 示意图显示通过皮片机将全层皮肤切分为乳头层真皮（包含表皮；0‒300 µm；真皮层1）、上部网状层（300‒1,000 µm；真皮层2）和下部网状层（>1,000 µm；真皮层3）三个真皮层。 请点击此处查看此图的放大版本。

显示通过FSC-SSC、Pacific blue、ITGA6和FAP标记进行细胞分选的流式细胞术分析图。
图3：人真皮成纤维细胞亚群的FACS设门策略。（A‒E）首先，对单细胞（B）和活细胞（DAPI-）进行设门（C）。排除免疫细胞（CD45+）、间充质干细胞（CD106+）和红细胞（CD235ab+）（C），进一步对Pacific blue阴性细胞根据E-钙黏蛋白（Ecad）和ITGA6双阴性细胞进行设门（PE通道，D）。E-钙黏蛋白和ITGA6是表皮细胞上表达的标志物。接着，排除CD31-FITC阳性细胞（内皮细胞和淋巴管细胞）（D），最终获得三个成纤维细胞群体，这些群体表达两种细胞表面成纤维细胞标志物FAP和CD90中的一种或两种：FAP+CD90-、FAP+CD90+和FAP-CD90+（E）。请点击此处查看该图的放大版本。

皮肤真皮层的流式细胞术、显微镜观察和基因表达分析；结果比较。
图 4：FAP+CD90-、FAP+CD90+ 和 FAP-CD90+ 成纤维细胞在真皮定位、基因表达和功能上存在差异。（A）从乳头层、上层网状层和下层网状层真皮中分离的门控成纤维细胞的代表性流式细胞术图。门控策略见图 3。FAP+CD90- 成纤维细胞在乳头层真皮中富集（19.2%），而在下层网状层真皮中比例较低（0.83%）。FAP+CD90+ 细胞在整个真皮中均存在，但在上层网状层真皮中丰度最高（40.7%）。FAP-CD90+ 细胞则在下层网状层真皮中富集（64.4%）。（B）值得注意的是，三种分选后的亚群在培养7天后均呈现典型的成纤维细胞形态（左图）。有趣的是，它们在脂肪生成实验中表现出不同的行为。培养14天后，FAP+CD90- 细胞未分化为脂肪细胞，而 FAP+CD90+ 和 FAP-CD90+ 细胞则 readily 发生脂肪生成（右图；油红O染色将含脂质细胞染成红色）。比例尺 = 1,000 µm。（C）直接分选的 FAP+CD90- 成纤维细胞表达乳头层成纤维细胞标志物 CD26、NTN1 和 PDPN，而 FAP-CD90+ 细胞表达 CD36、ACTA2 和 PPARγ，这些是已知由网状层谱系表达的分子。* p ≤ 0.05；*** p ≤ 0.0005，与 FAP+/CD90- 细胞相比；# p ≤ 0.05；### p ≤ 0.0005，与 FAP-/CD90+ 细胞相比。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种从人皮肤中分离乳头层和网状层成纤维细胞的方法。CD90已被广泛用于真皮成纤维细胞的鉴定或分离18,20,21。然而，我们已证明，除CD90+成纤维细胞外，人真皮中还存在表达FAP的CD90-成纤维细胞亚群16，而FAP已被确立为活化成纤维细胞及癌症相关成纤维细胞（CAFs）的标志物22,23,24,25。重要的是，我们能够在所有健康人供体的皮肤活检样本中鉴定出三种成纤维细胞亚群：FAP+CD90-、FAP+CD90+和FAP-CD90+。因此，我们得出结论：FAP不仅是活化成纤维细胞或CAFs的标志物，也是正常组织成纤维细胞的标志物。

值得注意的是，采用上述排除和设门策略后剩余的 FAP-CD90- 细胞群体不包含成纤维细胞，因为这些细胞在体外成纤维细胞培养基中无法增殖，而更可能是一类混合细胞群体，其中包括淋巴细胞和周细胞等16。

采用上述方案所获得的细胞得率可能因用于分离的皮肤组织取自身体的不同部位而有所差异。不同部位的真皮在结构、厚度以及胶原蛋白组成方面均存在差异。例如，面部或上臂的皮肤明显比腹部或大腿的皮肤更薄，后者通常还具有更厚的皮下脂肪层。此外，皮肤供体的年龄和性别不仅可能影响组织解离的效率，还可能影响从全层皮肤中分离出的三种成纤维细胞亚群的分布（图3）。这主要是由于乳头层真皮随年龄增长而萎缩，且总成纤维细胞数量随年龄增加而减少11,26,27,28。此外，乳头层真皮所得的细胞沉淀通常可能比网状层真皮更大，因为上层真皮中成纤维细胞的密度高于网状层真皮。同时，下层真皮的胶原蛋白更为致密且组织更坚韧，导致组织更难解离，成纤维细胞更难释放。需要注意的是，细胞沉淀可能呈现明显的红色，因此建议进行红细胞裂解处理。

除了在完整的人类皮肤中鉴定出三个亚群外，我们还表明，在皮片切取的皮肤中，每种成纤维细胞亚群均富集于乳头层或网状层真皮16。使用皮片切取器精确切割皮肤对于从不同真皮层中获得每种亚群的充分富集至关重要。由于乳头层非常薄，代表该层的皮片切取样本厚度不应超过 300 µm。上层网状层和下层网状层成纤维细胞均属于网状层谱系，具有相似的功能和基因表达特征，因此也可考虑不将二者分离。

重要的是，这三种成纤维细胞群体均分布于整个真皮层，并非仅存在于某一层中，因此来自乳头层或网状层的组织块培养会得到混合的成纤维细胞群体。然而，FAP+CD90- 乳头层成纤维细胞在乳头层中最为丰富，并呈现出从浅层向深层真皮递减的梯度分布，而 FAP+CD90+ 和 FAP-CD90+ 成纤维细胞则呈现从深层向浅层递增的相反梯度16。此外，乳头层中大多数 CD90+ 成纤维细胞几乎 exclusively 分布于血管周围，表达血管周成纤维细胞标志物 CD14629，因此其功能可能与其余 CD146- 网状成纤维细胞不同16。CD146 可作为分选策略中的一个附加标志物，用于排除该细胞群体。

在真皮层解离后，分离得到的细胞将用一种特别设计的抗体混合物进行染色，该混合物包含多种抗体，用于排除免疫细胞、内皮细胞和淋巴管内皮细胞、表皮细胞、红细胞以及间充质干细胞（MSCs），从而获得纯化的成纤维细胞群体。值得注意的是，由于已发表的MSC标志物数量众多，选择用于鉴定和排除MSCs的标志物可能较为复杂30,31。由于MSCs与成纤维细胞一样均表达CD90，因此额外的MSC标志物（如CD105或CD271）可能有助于其鉴定。然而，MSCs仅占所有真皮细胞的极小比例，且CD90+成纤维细胞在分选后表现出典型的成纤维细胞形态特征，因此可以认为，通过特异性细胞表面标志物排除MSCs可能是不必要的。

重要的是，我们在分选后将细胞培养 7-14 天，检测了 FAP 和 CD90 基因的表达（数据未显示），发现两种标志物在各自分选出的单阳性细胞（FAP+CD90- 或 FAP-CD90+）中均上调16。因此，我们强调，上述标志物组合和方案可用于直接从组织中分离原代成纤维细胞亚群，但不能用于从先前已培养的混合成纤维细胞群体中分离。

然而，我们证明了这三种亚群的功能在细胞培养中均得以保留，无论细胞表面标志物的表达发生何种改变，因为分选为FAP+CD90-的乳头层成纤维细胞在长期培养后仍不具备脂肪生成能力，而分选为FAP+CD90+或FAP-CD90+的网状层成纤维细胞则维持其向脂肪细胞分化的潜能16。重要的是，我们还发现乳头层和网状层特异性基因在FAP+CD90-和CD90+细胞中仍分别表现出更高水平的表达。

综上所述，我们建立了一种通过流式细胞荧光分选（FACS）分离功能上 distinct 的成纤维细胞亚群的方案，首次实现了从人皮肤真皮层中分离和分析纯度高且未经体外培养的成纤维细胞亚群。该方法相较于常用的表皮和真皮深层组织块培养法是一大进步，原因在于：（i）从皮肤表面至皮下组织存在表皮乳头层与网状层成纤维细胞的相反梯度分布；（ii）成纤维细胞在体外培养过程中会改变其基因表达特征。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们衷心感谢Bärbel Reininger和Wolfgang Bauer在FACS分选方面的协助。本工作获得了奥地利科学基金（FWF: V 525-B28）以及欧洲生物化学学会联合会（FEBS，后续研究基金）对B. M. L.的资助。S. F. 是奥地利科学院（OeAW）DOC奖学金的获得者。我们衷心感谢维也纳医科大学核心设施提供的卓越支持。我们感谢Bernhard Gesslbauer、Christine Radtke和Martin Vierhapper提供人皮肤组织材料。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料：
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤SigmaI5879
氯化铵Sigma9718用于自制ACK裂解缓冲液
Amniomax-C100 (1x) 基础培养基Gibco17001-074用于成纤维细胞生长培养基
β-巯基乙醇ScharlauME0095注意
C100 补充剂Thermo Scientific12556015用于成纤维细胞生长培养基
胶原酶 IThermo Scientific17100017警告
胶原酶 IIGibco17101015警告
胶原酶IVSigmaC5138警告
DAPI赛默飞世尔科技62248
地塞米松SigmaD8893
Dispase II罗氏4942078001注意
杜尔贝科‘s 改良伊格尔培养基 + GlutaMAXGibco31966-021
EDTA 二钠盐SigmaE1644用于自制ACK裂解缓冲液
胎牛血清（热灭活）Gibco10500-064
透明质酸酶SigmaH4272注意
胰岛素SigmaI5500
异丙醇默克1,096,341,011
油红OSigmaO-0625
ParaformaldehydSigma158127警告 致癌物。对皮肤和眼睛有刺激性。需谨慎操作。
青霉素/链霉素Gibco15070-063
不含 Ca 的磷酸盐缓冲液2+ && Mg2+LonzaBE17-512F
碳酸氢钾Sigma237205用于自制ACK裂解缓冲液
PureLink RNA MicroKitInvitrogen12183-016
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCRInvitrogen11752
Taqman 2x Universal PCR Master Mix应用生物系统公司4324018警告：皮肤和眼睛刺激物。
曲格列酮SigmaT2573
名称公司目录编号评论
流式细胞术抗体：
抗人 CD31-AF488Biolegend303109稀释比例：1:30，批号：B213986，RRID：AB_493075
抗人 CD45-太平洋蓝Biolegend304029稀释比例：1:20，批号：B218608，RRID：AB_2174123
抗人 CD49f/ITGA6-PESerotecMCA699PE稀释比例：1:20，批号：0109，RRID: AB_566833
抗人 CD90/Thy-1-AF700Biolegend328120稀释比例：1:30，批号：B217250，RRID：AB_2203302
抗人 CD106-AF421BD744309稀释比例：1:100，批号：7170537，RRID：x
抗人 CD235ab-太平洋蓝Biolegend306611稀释比例：1:1000，批号：B224563，RRID：AB_2248153
抗人 E-钙黏蛋白-PEBiolegend147304稀释比例：1:20，批号：B197481，RRID: AB_2563040
抗人FAP-APCR&研发FAB3715A稀释比例：1:20，批号：AEHI0117111，RRID：x
人源 TruStain FcXBiolegend422302稀释比例：1:20，批号：B235080，RRID: x
名称公司目录编号评论
设备：
1.4 mL 微量管Thermo Scientific4140
1.5 mL 螺口盖微量离心管Sarstedt72,692,405
5 mL 聚苯乙烯圆底管配细胞筛帽Falcon352235
48孔细胞培养板Costar3548
50 mL 聚丙烯标准管Falcon352070
70 µm细胞滤器 尼龙Falcon352350
Aesculap Acculan 3Ti 皮肤取皮刀VWRAESCGA670
Aesculap 皮肤取皮刀刀片VWRAESCGB228R
MicroAmp 快速光学 96 孔板Applied Biosystems4346906
原代细胞培养皿康宁353803
手术刀片F.S.T10022-00
茶漏xx
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成纤维细胞生长培养基：
AmnioMAX 基础培养基，添加 AmnioMAX C-100 补充剂、10% FCS 和 1% P/S

参考文献

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通过荧光激活细胞分选法从人皮肤中分离乳头层和网状层成纤维细胞
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