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方法文章

小印度猫鼬（Herpestes auropunctatus）血清中碘酚酸类似物的分析及其作为口服狂犬病疫苗生物学标志物的应用

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DOI：

10.3791/59373

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2019年5月31日

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1US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, 2IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark

本文内容

摘要

我们为圈养的獴提供了含有乙基或甲基碘苯酸作为生物标志物的安慰剂口服狂犬病疫苗诱饵，并采用一种新型的液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）验证了诱饵的摄取情况。

摘要

小型印度獴（Herpestes auropunctatus）是波多黎各狂犬病病毒（RABV）的宿主，占当地每年报告的动物狂犬病病例总数的70%以上。控制野生动物宿主中RABV传播通常采用口服狂犬病疫苗（ORV）策略。目前波多黎各尚无野生动物ORV项目。针对口服狂犬病疫苗及适用于獴的多种诱饵类型的研究已开展，并取得了有前景的结果。监测ORV成效依赖于评估目标物种对诱饵的摄取情况，通常通过检测接种后狂犬病病毒中和抗体（RVNA）的变化来进行评估。然而，在已实施野生动物ORV项目的地区，或在RABV呈地方性流行且宿主物种中存在基础水平RVNA的地区，该策略可能难以解释。在此类情况下，将生物标记物整合入疫苗或诱饵基质中可能更为有效。本研究向16只圈养獴提供了含有乙基碘苯氧乙酸（et-IPA）的安慰剂ORV诱饵，其浓度分别为诱饵内部0.4%和1%，以及外部诱饵基质中0.14%；另向12只圈养獴提供了含有甲基碘苯氧乙酸（me-IPA）的ORV诱饵，其浓度分别为外部诱饵基质中的0.035%、0.07%和0.14%。我们在投喂诱饵前采集血清样本，之后每周采集一次，持续至投喂后第八周。从血清中提取碘苯氧乙酸类物质至乙腈中，并采用液相色谱-质谱法进行定量分析。使用液相色谱-质谱法对血清中的et-IPA或me-IPA进行检测。结果表明，et-IPA和me-IPA分别至少可在体内有效标记八周和四周。两种IPA衍生物均适用于在野外评估獴对ORV诱饵的摄取情况。由于该标记物在獴血清中存留时间较长，在连续评估中应避免使用同一种IPA衍生物，以防结果混淆。

引言

狂犬病病毒（RABV）是一种负链单股RNA丽沙病毒，在食肉目（Carnivora）和翼手目（Chiroptera）的多种野生动物宿主中传播。多种獴类动物是RABV的宿主，其中小印度獴（Herpestes auropunctatus）是西半球波多黎各及其他加勒比岛屿上唯一的RABV宿主1,2,3。控制野生动物宿主中RABV的传播通常采用口服狂犬病疫苗（ORV）策略。在美国（US），该项管理工作由美国农业部动植物卫生检验局野生动物服务局国家狂犬病管理计划（NRMP）统一协调4。目前，波多黎各尚无针对野生动物的ORV项目。已有针对獴类动物的狂犬病疫苗及多种诱饵类型的研究，取得了令人鼓舞的结果，表明在獴类动物中实施ORV项目是可行的5,6,7,8。

监测口服狂犬病疫苗（ORV）效果依赖于评估目标物种对饵料的摄取情况，通常需要检测狂犬病病毒（RV）抗体血清流行率的变化。然而，在已实施活跃的野生动物ORV项目地区，或在狂犬病呈地方性流行且储存宿主物种中存在基础水平的狂犬病病毒中和抗体（RVNA）的地区，这种策略可能面临挑战。在这种情况下，使用包含在饵料内或饵料外基质中的生物标志物可能更为有效。

已使用多种生物标志物来监测多种动物对诱饵的摄取情况，包括浣熊（Procyon lotor）9,10、白鼬（Mustela ermine）11,12、欧洲獾（Meles meles）13、野猪（Sus scrofa）14、小印度猫鼬15以及草原犬鼠（Cynomys ludovicianus）16,17等。在美国，实际应用中的口服狂犬病疫苗（ORV）诱饵通常在诱饵基质中添加1%的四环素作为生物标志物，以监测诱饵摄取情况18,19。然而，使用四环素存在一些缺点，包括人们日益关注抗生素向环境中扩散的问题，且四环素的检测通常具有侵入性，需要拔牙或处死动物以获取骨组织样本20。罗丹明B已被评估可作为多种组织中的标志物，可通过紫外光（UV）照射并在毛发和触须中利用荧光进行检测10,21。

碘苯氧基乙酸（IPA）是一种白色结晶性粉末，曾用于评估多种哺乳动物物种对诱饵的摄食情况，包括郊狼（Canis latrans）22、北极狐（Vulpes lagopus）23、赤狐（Vulpes vulpes）24、浣熊9，25、野猪14、马鹿（Cervus elaphus scoticus）26、欧洲獾12和雪貂（M. furo）27等。IPA在不同物种体内的滞留时间存在差异，某些有袋类动物体内少于两周28，29，而在有蹄类动物中至少可达26周26，家犬（Canis lupus familiaris）体内则超过52周30。IPA的滞留时间也可能具有剂量依赖性31。碘苯氧基乙酸与血清白蛋白结合能力强，历史上通过测定血液碘含量进行间接检测32。该间接方法随后被高效液相色谱法（HPLC）所取代，后者通过紫外检测直接测定碘苯氧基乙酸浓度33，最终发展为液相色谱-质谱联用技术（LCMS）34，35。本研究建立了一种高灵敏度、高选择性的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），采用多反应监测（MRM）定量检测碘苯氧基乙酸的两种类似物。本研究的目的是利用该LC-MS/MS方法评估2-(3-羟基-2,4,6-三碘苯基)丙酸（甲基-IPA或me-IPA）和2-(3-羟基-2,4,6-三碘苯基)丁酸（乙基-IPA或et-IPA）在圈养獴类中通过口服狂犬病疫苗（ORV）诱饵递送后的标记效果。

使用市售烟熏香肠和鱼油作为诱饵，通过笼式捕兽器活体捕获獴。将獴单独饲养在60 cm × 60 cm × 40 cm的不锈钢笼中，每日喂食约50 g的商用干猫粮，并每周补充两次市售鸡腿肉。水可自由获取。ad libitum。我们将异丙胺（IPA）的两种衍生物——乙基-IPA和甲基-IPA，通过安慰剂口服狂犬病疫苗（ORV）诱饵投喂给圈养的獴。所有诱饵均由一个28 mm × 20 mm × 9 mm的铝箔泡罩包装构成，外部包被一层（下文简称"诱饵基质"），其中含有粉状鸡蛋和明胶（材料表）。诱饵内含0.7 mL水或IPA衍生物，总重量约为3 g，其中外部诱饵基质约占2 g。

我们向16只圈养的獴提供了三种浓度的et-IPA：0.14%（约2克诱饵基质中含有2.8 mg et-IPA；3只雄性[m]，3只雌性[f]）、0.4%（0.7 mL水泡包装体积中含有2.8 mg et-IPA；3只雄性，3只雌性）和1.0%（0.7 mL水泡包装体积中含有7.0 mg乙基-IPA；2只雄性，2只雌性）。总剂量2.8 mg对应剂量率为5 mg/kg27,36，该剂量基于波多黎各地区獴的平均体重560 g计算得出。我们将1%选为最高浓度，因为研究表明在某些物种中，当某些生物标记物浓度>1%时可能出现味觉厌恶反应37。1%剂量仅以水泡包装形式提供，因为在诱饵基质中，絮凝现象导致溶质无法充分溶解于溶剂中，从而难以均匀混入基质。一个对照组（2只雄性，1只雌性）仅接受装有无菌水且不含IPA的诱饵。我们在早晨（约上午8点）向獴提供诱饵，时间安排在其日常维持饲料投喂期间或之前。诱饵残余物在约24小时后被移除。我们在处理前、处理后第1天以及之后每周采集一次血液样本，直至处理后第8周。通过吸入异氟烷气体对獴进行麻醉，并按照雪貂的操作方法38，经前腔静脉穿刺采集最多1.0 mL全血。将全血样本离心后，转移血清至冻存管中，并在-80 °C保存直至分析。为尽量减少重复采血对动物健康的影响，并非所有动物在每个时间点均被采样。对照组动物在第0天开始采样，之后每周一次，持续至处理后第8周。

我们以三种浓度递送甲基异丙胺（me-IPA）：0.035%（0.7 mg）、0.07%（1.4 mg）和0.14%（2.8 mg），均掺入诱饵基质中，每组处理包含2只雄性和2只雌性。另有2只雄性和2只雌性接受填充无菌水且不含IPA的诱饵。诱饵投喂时间及獴的麻醉方法如上所述。我们在第1天治疗前采集血液样本，之后每周采集一次，持续至治疗后4周。

我们对血清浓度数据进行了正态性检验，并估算了不同处理组血清异戊酸（IPA）浓度的均值。采用线性混合模型比较了个体间合并的血清乙基异戊酸（et-IPA）浓度均值。固定效应包括诱饵类型（基质/水疱包装）和实验日期，动物编号（animal ID）作为随机效应。所有分析均使用常用统计软件（材料表）进行，显著性水平设定为 α = 0.05。

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方案

所有操作均经美国农业部国家野生动物研究中心机构动物照护与使用委员会根据批准的研究方案 QA-2597 审核通过。

注意：以下方案描述了在獴血清中检测甲基碘苯酸的分析步骤。该方法是在对獴血清中乙基碘苯酸进行分析的迭代过程基础上最终优化而成。在乙基碘苯酸的初步评估过程中，对方法进行了少量修改，最终形成了如下所述的实验方案。代表性结果包含了两次迭代过程中获得的数据。

1. 溶液与标准品的制备

  1. 购买 me-IPA 和 et-IPA。
  2. 配制流动相 A：将 1 mL 甲酸加入 1 L 超纯水（≥ 18 MΩ）中，制备 1 L 的 0.1%（v/v）甲酸水溶液。配制流动相 B：将 1 mL 甲酸加入 1 L 乙腈（ACN）中，制备 1 L 的 0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液。
  3. 配制稀释液：将 1 mL 三氟乙酸（TFA）加入 200 mL 乙腈（ACN）中，制备 200 mL 的 0.5%（v/v）TFA-乙腈溶液。
  4. 用乙腈（ACN）配制 me-IPA 和 et-IPA 的浓缩储备液，浓度约为 1,000 µg/mL。
    1. 使用微量天平称取约 10 mg 的 me-IPA，精确记录质量至 ± 0.0001 mg。用 45 mL 乙腈将 me-IPA 定量转移至 10 mL A 级容量瓶中。超声 1 分钟以溶解所有固体，再用乙腈定容。
    2. 将约 8 mL 每种储备液转移至带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖的棕色 8 mL 玻璃小瓶中。室温（RT）保存。将剩余储备液转移至危险废物容器中。
  5. 配制 25x-7 me-IPA 储备液（表 1）：用乙腈（ACN）配制浓度约为 200 µg/mL 的 me-IPA 储备液。示例：使用 1,000 µL 玻璃注射器，从步骤 1.4.2 中的浓缩储备液中转移 1 mL 至 5 mL A 级容量瓶中，用乙腈定容。将该储备液转移至带有 PTFE 衬垫盖的棕色 8 mL 玻璃小瓶中，室温（RT）保存。
  6. 按照 表 1 配制其余六种 25x me-IPA 储备液。每种储备液均使用多通道移液器，在带有 PTFE 衬垫盖的棕色 8 mL 玻璃小瓶中加入指定体积的溶液。每种储备液均于室温（RT）保存。
  7. 配制 25x 内标储备液：使用步骤 1.4.2 中制备的浓缩储备液，用乙腈（ACN）配制浓度约为 10 µg/mL 的 me-IPA 内标储备液。使用 100 µL 玻璃注射器，将 0.100 mL 浓缩 me-IPA 储备液转移至 10 mL A 级容量瓶中，再用乙腈定容。
    1. 将约 8 mL 转移至带有 PTFE 衬垫盖的棕色 8 mL 玻璃小瓶中，室温（RT）保存。将剩余储备液转移至危险废物容器中。
  8. 按照 表 2 所示，在 2 mL 螺口玻璃自动进样瓶中配制含两种分析物的 4x 储备液。
    1. 例如，配制 4x-7 储备液：使用容量为 0.5 mL 的多通道移液器，向 2 mL 小瓶中加入 0.20 mL 来自步骤 1.5 的 25x-7 me-IPA 储备液。再使用相同移液器加入 0.20 mL 来自步骤 1.7 的 25x 内标 et-IPA 储备液。
    2. 使用容量为 1 mL 的多通道移液器加入 0.85 mL 乙腈（ACN）。盖紧瓶盖，倒置混匀 5 次。
  9. 按照 表 3 所示，在 2 mL 螺口自动进样瓶中配制标准曲线溶液。
    1. 例如，配制标准品 7（Std 7）：使用容量为 0.5 mL 的多通道移液器，向 2 mL 小瓶中加入 0.20 mL 来自步骤 1.8.2 的 4x-7 储备液。再使用容量为 1 mL 的多通道移液器加入 0.60 mL 超纯去离子水。盖紧瓶盖，倒置混匀 5 次。

2. 样品制备

警告：执行本操作的人员必须已完成狂犬病暴露前预防接种的全部剂次，并在联邦职业健康指定医疗机构获得记录在案的狂犬病抗体滴度高于0.5 IU。操作提取过程中，人员必须始终穿戴实验服并佩戴眼部防护装备。警告：步骤2.3−2.6必须在II级生物安全柜中进行。

  1. 每个样品准备一个含有 200−300 mg NaCl 的 1.5 mL 微量离心管。将这些离心管按顺序放入一个 80 孔塑料管架中，并放置一旁，留待步骤 2.6 使用。
    注意：若样品数量较多，建议使用微型药勺（或其他小型量具）。
  2. 为每个样品标记两个 1.5 mL 微量离心管：一个标记为“A”，另一个标记为“B”。将这些离心管按顺序放入一个 80 孔塑料管架中。
  3. 将血清提取所需的以下材料和设备放入 II 级生物安全柜中：按步骤 2.1 和 2.2 准备好的微量离心管（置于管架中）、涡旋混合器、配备 0.5 mL 和 5 mL 容量吸头的重复移液器、配备 1,000 µL 吸头的 100−1,000 µL 空气置换移液器、分别装有约 100 mL 稀释液和超纯去离子水的容器，以及生物危害废物容器。
  4. 从冷冻储存中取出血清样品，在生物安全柜中使其升温至室温（RT）。取样前对每份血清样品进行涡旋混匀。
  5. 使用配备 0.5 mL 容量吸头的重复移液器，向标记为“A”的管中加入 0.050 mL 獴血清，再加入 0.050 mL 25 倍浓度的替代物储备液。然后使用配备 5 mL 容量吸头的重复移液器向管“A”中加入 0.950 mL 稀释液。盖紧管盖，涡旋混匀 10−15 秒。
  6. 将步骤 2.1 中预先称量好的 NaCl 加入管“A”中，涡旋混匀 3 次，每次 8−12 秒。使用 70%（v/v）异丙醇擦拭装有管“A”的管架外表面。
    注意：此时可将样品管架从 II 级生物安全柜中取出。
  7. 将管“A”在 12,000 x g 条件下离心 1 分钟，以分离水相和乙腈（ACN）相。使用 100−1,000 µL 空气置换移液器吸取 0.80 mL 上层 ACN 相转移至管“B”中。将管“A”中剩余溶液转移至危险废物容器，并将空管丢弃至生物危害废物容器中。
  8. 在 45 °C 水浴中，用温和的氮气（N2）气流去除管“B”中的 ACN 和三氟乙酸（TFA）。
  9. 使用重复移液器向管“B”中加入 0.250 mL ACN，涡旋混匀 4−5 秒，然后在 12,000 x g 条件下短暂离心（2−4 秒），使液体沉降至管底。
  10. 使用配备 5 mL 容量吸头的重复移液器向管“B”中加入 0.750 mL 超纯去离子水，涡旋混匀 4−5 秒，然后在 12,000 x g 条件下离心 1 分钟，以澄清样品。
  11. 使用 1,000 µL 空气置换移液器将 0.75 mL 上清液转移至自动进样瓶中。将移液器吸头丢弃至生物危害废物容器中。
  12. 盖紧自动进样瓶，进行 LC-MS/MS 分析（第 4 节）。将管“B”中剩余溶液转移至危险废物容器，空管丢弃至生物危害废物容器中。所有生物危害废物应通过高压灭菌或焚烧处理。

3. 质量控制样品

注意：请遵循第 2 节中描述的警示说明。

注意：以下步骤描述了分析所需的最少质量控制（QC）样本数量。如果控制用猫鼬血清量充足，建议每个水平设置重复样本。

  1. 准备四个含有 200−300 mg NaCl 的 1.5 mL 微量离心管。将这些管子排列在 80 孔塑料管架中。
  2. 针对每个质控样品，标记两个 1.5 mL 微量离心管：一个标记为“A”，另一个标记为“B”。将这些管子排列在 80 孔塑料管架中。
  3. 重复步骤 2.3。
  4. 从冷冻储存中取出对照细尾獴血清，在生物安全柜中恢复至室温。取样前使用涡旋振荡器充分混匀对照血清。
  5. 使用带有 0.5 mL 容量吸头的重复移液器，将 0.050 mL 对照细尾獴血清分装至四个 1.5 mL 的“A”管中。
  6. 使用带有 0.5 mL 容量吸头的重复移液器，按照 表 4 中规定对四个质控样品进行加标。确保每个质控样品管盖紧后，涡旋混匀 10−15 秒。
  7. 按照步骤 2.6−2.12 所述进行提取操作。

4. 液相色谱-串联质谱分析

  1. 按照表5中所述的所有参数配置液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）。启动LC-MS/MS，待色谱柱温度升至70 °C后，再将流速设定为0.800 mL/min。
  2. 在数据采集软件（材料表）中设置序列，使每个包含质控样品和未知样品的批次前后均注入标准曲线样品。
  3. 注入所有标准品和样品，并使用表5中列出的参数采集多反应监测（MRM）离子色谱图。
  4. 序列完成后，关闭LC-MS/MS，并将所有自动进样瓶作为危险废物处理。

5. 定量分析

  1. 使用数据分析软件，以 et-IPA 作为内标物，绘制 me-IPA 的相对响应值相对于相对浓度的校准曲线。相对响应值通过 me-IPA 的定量 MRM 转换（556.6 → 428.7）除以 et-IPA 的 MRM 转换（570.7 → 442.7）计算得到。采用加权 1/x 且忽略原点的二阶二次函数构建 7 个浓度水平的校准曲线。
  2. 使用以下公式计算 me-IPA 的血清浓度（Cserum）：
    血清浓度计算公式示意图：C_serum=((c_instrument)(1.25)(V_final))/V_serum
    其中 cinstrument 为根据校准曲线由仪器测得的浓度，单位为 µg/mL；1.25 为稀释因子 比值计算公式，1 mL/0.8 mL = 1.25，用于科学计算分析。；Vfinal 为最终样品体积（1.0 mL）；Vserum 为血清体积，单位为 mL（标称值为 0.050 mL）。

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结果

代表性离子色谱图来自 me-IPA 分析，如下所示 图1对照猫鼬血清（图1A)展示了et-IPA（替代分析物）的保留时间，以及在指定保留时间处不存在me-IPA。质量控制样品（图1B) 展示了 me-IPA 与 et-IPA 的基线分离，以及 me-IPA 的定量离子和定性离子跃迁。 图1C 显示了该研究中一个具有代表性的样本，其观测到的血清浓度为 33.5 µg/mL me-IPA 

me-IPA 分析的典型校准曲线如图2所示。该7个浓度水平、共14个点的标准曲线中，me-IPA 的浓度范围为 0.00202 至 8.27 µg/mL，相关系数（r

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讨论

本研究建立的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法利用多反应监测的选择性，准确定量獴血清中的甲基异丙胺（me-IPA）和乙基异丙胺（et-IPA）。串联质谱检测的选择性还使得样品前处理步骤得以简化，仅需使用乙腈沉淀血清中的蛋白质，无需其他净化步骤即可进行分析。

碘酚酸可溶于乙腈，但在水中几乎不溶。为了从乙腈萃取中排除水，加入氯化钠以提高水相（血清相）的离子强度，从而促使水相与乙腈相清晰分离。此外，还加入了挥发性酸三氟乙酸（TFA），以确保在萃取过程中碘酚酸保持质子化状态，从而更易溶于乙腈相。TFA在LC-MS/MS分析前的干燥步骤中被去除。

从獴体内采集的血样约为1 mL，可获得0.5 mL或更少的血清。为了对每个样本进行重复分析，需要采用微量化样品制备流程，使用微量离心管而非典型的分析实验室玻璃器皿（如A级容量移液管和容量瓶）。为获得准确且精确的结果，分析人员必须熟练掌握玻璃微量注射器以及配有微升级吸头的正位移重复移液器的操作技术。

该方法的一个局限性是需要昂贵的液...

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披露

作者 AV 和 SO 是一家口服狂犬病疫苗诱饵制造商的全职员工。

致谢

本研究部分得到了美国农业部动植物卫生检验局野生动物服务局国家狂犬病管理计划和IDT Biologika（德国德绍-罗斯劳）机构研究计划的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈，Optima 级FisherA996
分析天平Mettler ToledoXS204
C18 色谱柱，2.1 × 50 mm，2.5-µm 粒径Waters Corp.186003085
ESI 离子源Agilent G1958-65138
乙基碘苯氧乙酸，97%Sigma AldrichN/A批号 MKBP5399V
甲酸，LC/MS 级FisherA117
LCMS 软件AgilentMassHunter 数据采集与定量分析软件
甲基碘苯氧乙酸，97% (w/w)PR EuroChem Ltd.N/A批号 PR0709514717
微量分析天平Mettler ToledoXP6U
微量离心机Eppendorf5415C
串联质谱仪（MS/MS）AgilentG6470A
氮吹仪（N-Evap）Organomation115
口服狂犬病疫苗诱饵IDT Biologika, Dessau Rossleau, GermanyN/A
丙基碘苯氧乙酸，99% (w/w)PR EuroChem Ltd.N/A批号 PR100612108RR
多通道移液器EppendorfM4
螺口自动进样瓶盖，聚四氟乙烯（PTFE）衬垫Agilent5190-7024
氯化钠，经认证的 ACS 级FisherS271
统计分析软件包SAS Institute, Cary, North Carolina, USAN/A
三氟乙酸，99%Alfa AesarL06374
超高效液相色谱仪（UPLC）Agilent1290 系列
涡旋混合器Glas-Col099A PV6
0.2 mL 移液器吸头Eppendorf30089.413
0.5 mL 移液器吸头Eppendorf30089.421
1.5 mL 微量离心管Fisher14-666-325
1250-µL 容量移液吸头GeneMateP-1233-1250
1 mL 移液器吸头Eppendorf30089.43
2 mL 棕色螺口自动进样瓶Agilent5182-0716
5 mL 移液器吸头Eppendorf30089.456
80 孔微量离心管架Fisher05-541-2
8 mL 棕色带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫瓶盖的小瓶Wheaton224754
70% (v/v) 异丙醇FisherA459
100–1000 µL 空气置换式移液器EppendorfES-100

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