小印度猫鼬（Herpestes auropunctatus）血清中碘酚酸类似物的分析及其作为口服狂犬病疫苗生物学标志物的应用

摘要

我们为圈养的獴提供了含有乙基或甲基碘苯酸作为生物标志物的安慰剂口服狂犬病疫苗诱饵，并采用一种新型的液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）验证了诱饵的摄取情况。

摘要

小型印度獴（Herpestes auropunctatus）是波多黎各狂犬病病毒（RABV）的宿主，占当地每年报告的动物狂犬病病例总数的70%以上。控制野生动物宿主中RABV传播通常采用口服狂犬病疫苗（ORV）策略。目前波多黎各尚无野生动物ORV项目。针对口服狂犬病疫苗及适用于獴的多种诱饵类型的研究已开展，并取得了有前景的结果。监测ORV成效依赖于评估目标物种对诱饵的摄取情况，通常通过检测接种后狂犬病病毒中和抗体（RVNA）的变化来进行评估。然而，在已实施野生动物ORV项目的地区，或在RABV呈地方性流行且宿主物种中存在基础水平RVNA的地区，该策略可能难以解释。在此类情况下，将生物标记物整合入疫苗或诱饵基质中可能更为有效。本研究向16只圈养獴提供了含有乙基碘苯氧乙酸（et-IPA）的安慰剂ORV诱饵，其浓度分别为诱饵内部0.4%和1%，以及外部诱饵基质中0.14%；另向12只圈养獴提供了含有甲基碘苯氧乙酸（me-IPA）的ORV诱饵，其浓度分别为外部诱饵基质中的0.035%、0.07%和0.14%。我们在投喂诱饵前采集血清样本，之后每周采集一次，持续至投喂后第八周。从血清中提取碘苯氧乙酸类物质至乙腈中，并采用液相色谱-质谱法进行定量分析。使用液相色谱-质谱法对血清中的et-IPA或me-IPA进行检测。结果表明，et-IPA和me-IPA分别至少可在体内有效标记八周和四周。两种IPA衍生物均适用于在野外评估獴对ORV诱饵的摄取情况。由于该标记物在獴血清中存留时间较长，在连续评估中应避免使用同一种IPA衍生物，以防结果混淆。

引言

狂犬病病毒（RABV）是一种负链单股RNA丽沙病毒，在食肉目（Carnivora）和翼手目（Chiroptera）的多种野生动物宿主中传播。多种獴类动物是RABV的宿主，其中小印度獴（Herpestes auropunctatus）是西半球波多黎各及其他加勒比岛屿上唯一的RABV宿主^1,2,3。控制野生动物宿主中RABV的传播通常采用口服狂犬病疫苗（ORV）策略。在美国（US），该项管理工作由美国农业部动植物卫生检验局野生动物服务局国家狂犬病管理计划（NRMP）统一协调⁴。目前，波多黎各尚无针对野生动物的ORV项目。已有针对獴类动物的狂犬病疫苗及多种诱饵类型的研究，取得了令人鼓舞的结果，表明在獴类动物中实施ORV项目是可行的^5,6,7,8。

监测口服狂犬病疫苗（ORV）效果依赖于评估目标物种对饵料的摄取情况，通常需要检测狂犬病病毒（RV）抗体血清流行率的变化。然而，在已实施....

方案

所有操作均经美国农业部国家野生动物研究中心机构动物照护与使用委员会根据批准的研究方案 QA-2597 审核通过。

注意：以下方案描述了在獴血清中检测甲基碘苯酸的分析步骤。该方法是在对獴血清中乙基碘苯酸进行分析的迭代过程基础上最终优化而成。在乙基碘苯酸的初步评估过程中，对方法进行了少量修改，最终形成了如下所述的实验方案。代表性结果包含了两次迭代过程中获得的数据。

1. 溶液与标准品的制备

1. 购买 me-IPA 和 et-IPA。
2. 配制流动相 A：将 1 mL 甲酸加入 1 L 超纯水（≥ 18 MΩ）中，制备 1 L 的 0.1%（v/v）甲酸水溶液。配制流动相 B：将 1 mL 甲酸加入 1 L 乙腈（ACN）中，制备 1 L 的 0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液。
3. 配制稀释液：将 1 mL 三氟乙酸（TFA）加入 200 mL 乙腈（ACN）中，制备 200 mL 的 0.5%（v/v）TFA-乙腈溶液。
4. 用乙腈（ACN）配制 me-IPA 和 et-IPA 的浓缩储备液，浓度约为 1,000 µg/mL。
   1. 使用微量天平称取约 10 mg 的 me-IPA，精确记录质量至 ± 0.0001 mg。用 45 mL 乙腈将 me-IPA 定量转移至 10 mL A 级容量瓶中。超声 1 分钟以溶解所有固体，再用乙腈定容。....

结果

代表性离子色谱图来自 me-IPA 分析，如下所示 图1对照猫鼬血清（图1A)展示了et-IPA（替代分析物）的保留时间，以及在指定保留时间处不存在me-IPA。质量控制样品（图1B) 展示了 me-IPA 与 et-IPA 的基线分离，以及 me-IPA 的定量离子和定性离子跃迁。 图1C 显示了该研究中一个具有代表性的样本，其观测到的血清浓度为 33.5 µg/mL me-IPA 

me-IPA 分析的典型校准曲线如图2所示。该7个浓度水平、共14个点的标准曲线中，me-IPA 的浓度范围为 0.00202 至 8.27 µg/mL，相关系数（r

讨论

本研究建立的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法利用多反应监测的选择性，准确定量獴血清中的甲基异丙胺（me-IPA）和乙基异丙胺（et-IPA）。串联质谱检测的选择性还使得样品前处理步骤得以简化，仅需使用乙腈沉淀血清中的蛋白质，无需其他净化步骤即可进行分析。

碘酚酸可溶于乙腈，但在水中几乎不溶。为了从乙腈萃取中排除水，加入氯化钠以提高水相（血清相）的离子强度，从而促使水相与乙腈相清晰分离。此外，还加入了挥发性酸三氟乙酸（TFA），以确保在萃取过程中碘酚酸保持质子化状态，从而更易溶于乙腈相。TFA在LC-MS/MS分析前的干燥步骤中被去除。

从獴体内采集的血样约为1 mL，可获得0.5 mL或更少的血清。为了对每个样本进行重复分析，需要采用微量化样品制备流程，使用微量离心管而非典型的分析实验室玻璃器皿（如A级容量移液管和容量瓶）。为获得准确且精确的结果，分析人员必须熟练掌握玻璃微量注射器以及配有微升级吸头的正位移重复移液器的操作技术。

该方法的一个局限性是需要昂贵的液.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈，Optima 级	Fisher	A996
分析天平	Mettler Toledo	XS204
C18 色谱柱，2.1 × 50 mm，2.5-µm 粒径	Waters Corp.	186003085
ESI 离子源	Agilent	G1958-65138
乙基碘苯氧乙酸，97%	Sigma Aldrich	N/A	批号 MKBP5399V
甲酸，LC/MS 级	Fisher	A117
LCMS 软件	Agilent	MassHunter 数据采集与定量分析软件
甲基碘苯氧乙酸，97% (w/w)	PR EuroChem Ltd.	N/A	批号 PR0709514717
微量分析天平	Mettler Toledo	XP6U
微量离心机	Eppendorf	5415C
串联质谱仪（MS/MS）	Agilent	G6470A
氮吹仪（N-Evap）	Organomation	115
口服狂犬病疫苗诱饵	IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany	N/A
丙基碘苯氧乙酸，99% (w/w)	PR EuroChem Ltd.	N/A	批号 PR100612108RR
多通道移液器	Eppendorf	M4
螺口自动进样瓶盖，聚四氟乙烯（PTFE）衬垫	Agilent	5190-7024
氯化钠，经认证的 ACS 级	Fisher	S271
统计分析软件包	SAS Institute, Cary, North Carolina, USA	N/A
三氟乙酸，99%	Alfa Aesar	L06374
超高效液相色谱仪（UPLC）	Agilent	1290 系列
涡旋混合器	Glas-Col	099A PV6
0.2 mL 移液器吸头	Eppendorf	30089.413
0.5 mL 移液器吸头	Eppendorf	30089.421
1.5 mL 微量离心管	Fisher	14-666-325
1250-µL 容量移液吸头	GeneMate	P-1233-1250
1 mL 移液器吸头	Eppendorf	30089.43
2 mL 棕色螺口自动进样瓶	Agilent	5182-0716
5 mL 移液器吸头	Eppendorf	30089.456
80 孔微量离心管架	Fisher	05-541-2
8 mL 棕色带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫瓶盖的小瓶	Wheaton	224754
70% (v/v) 异丙醇	Fisher	A459
100–1000 µL 空气置换式移液器	Eppendorf	ES-100