单分子跟踪显微镜 - 确定细胞分子扩散状态的工具

Summary

3D 单分子定位显微镜用于探测活细菌细胞中荧光标记蛋白质的空间位置和运动轨迹。本文描述的实验和数据分析方案根据集合的单分子轨迹确定细胞蛋白的普遍扩散行为。

Abstract

单分子定位显微镜可探测活细胞中单个分子的位置和运动，具有几十纳米空间和毫秒的时间分辨率。这些功能使单分子定位显微镜非常适合研究生理相关环境中的分子级生物功能。在这里，我们演示了单分子跟踪数据的采集和处理/分析的集成协议，以提取感兴趣的蛋白质可能表现出的不同扩散状态。这些信息可用于量化活细胞中的分子复合形成。我们详细介绍了基于摄像头的 3D 单分子定位实验，以及随后产生单个分子轨迹的数据处理步骤。然后，使用数值分析框架对这些轨迹进行分析，以提取荧光标记分子的普遍扩散状态和这些状态的相对丰度。分析框架基于细胞内布朗扩散轨迹的随机模拟，这些轨迹在空间上被任意细胞几何体所限制。基于模拟轨迹，以与实验图像相同的方式生成和分析原始单分子图像。通过这种方式，实验精度和精度限制被明确纳入分析工作流中，这些限制很难进行实验校准。使用模拟分布的线性组合拟合实验值的分布，确定普遍扩散状态的扩散系数和相对总体分数。通过解决在细菌病原体的细胞溶质中形成同质和异寡体复合物时表现出不同扩散状态的蛋白质，我们证明了我们的协议效用。

Introduction

研究生物分子的扩散行为可以深入了解其生物功能。基于荧光显微镜的技术已成为观察其原生细胞环境中的生物分子的宝贵工具。光漂白 （FRAP） 和荧光相关光谱 （FCS）¹之后的荧光恢复提供整体平均扩散行为。相反，单分子定位显微镜能够观察具有高空间和时间^{分辨率2、3、4}的单个荧光标记分子。观察单个分子是有利的，因为感兴趣的蛋白质可能存在于不同的扩散状态。例如，当转录调节器（如大肠杆菌中的 CueR）在细胞醇中自由扩散或与DNA序列结合，并在测量时间尺度上固定时，会出现两种易于区分的扩散状态。.单分子跟踪为直接观察这些不同状态提供了工具，并且不需要复杂的分析来解析它们。然而，在扩散率更相似的情况下，解决多种扩散状态及其人口分数就变得更加困难。例如，由于扩散系数的大小依赖性，蛋白质的不同寡聚状态表现为不同的扩散状态^{6、7、8、9,10.....}

Protocol

1. 双螺旋点扩散功能校准

注:本部分和以下各节中描述的图像是使用定制内向荧光显微镜获取的，如Rocha^等人23所述。相同的程序适用于不同的显微镜实现设计单分子定位和跟踪显微镜2，3，4。本文中描述的所有图像采集和数据处理软件均可用（https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git）。

1. 准备用于在玻璃盖滑轨上安装样品的甘蔗垫，供显微镜下观察。
   1. 通过重量将1.5-2%的低熔点甘油添加到5 mL的M2G缓冲液（4.9 mM Na₂HPO 4，3.1mM KH₂PO₄，7.5 mM NH₄Cl，0.5 mM MgSO₄， 10 μM FeSO₄， 0.5 mM CaCl₂和 0.2% 葡萄糖）。微波几秒钟，直到所有的甘蔗溶解。不要让溶液沸腾。
   2. 让甘蔗溶液冷却几分钟（2-3分钟）。
   ....

Results

在此描述的实验条件下（20，000 帧，轨迹长度最小为 4 个定位），并根据荧光标记融合蛋白的表达水平，大约 200-3，000 个定位，产生 10-150每个细胞可以生成轨迹 （图 2a， b）。大量的轨迹是产生表观扩散系数的采样分布所必需的。这里收集的FOV大小为+55 x 55 μm，每个实验收集10个FOV。因此，要获得每个实验的 >5，000 个轨迹，每个 FOV 应包含至少 50 个细胞。理想情况下，细胞群应尽可能密集，但不要让细胞相互接触。如果细胞密度过高，则接触或重叠的细胞的存在使得^{使用OUFTI（28）}成功分割细胞变得困难，如数据后处理中所述。分割不良会导致细胞之间的定位和轨迹分配不正确。

在这里，我们提出了Y.肠杆菌3型分泌蛋白YscQ的明显扩散系数数.......

Discussion

成功应用所提出的协议的一个关键因素是确保单分子信号彼此很好地分离（即，它们需要在空间和时间上稀疏（补充Mov.1）。如果同时细胞中有多个荧光分子，则定位可能错误地分配给另一个分子的轨迹。这称为链接问题³⁰。可以选择蛋白质表达水平和激发激光强度等实验条件，以避免连接问题。然而，应注意获得野生型蛋白质表达水平，以确保有代表性的结果。在这里，我们使用原生启动子控制下的等位替代物，而不是化学诱导表达，以确保标记蛋白质的本地表达水平。因此，激发激光强度（用于eYFP闪烁）或活化激光强度（用于光活化荧光探头）可用于及时控制有源发射体的浓度。或者，当化学染料标记与HALO和SNAP^{标签31，32}结合使用时，染料的浓度可以降低，直到荧光信号稀疏到足以跟踪单个^分子33。此处介绍的协议通过丢弃同一单元中同时存在两个或多个定位的轨迹，进一步消除了链接问题（补充 Mov. 2）。因此.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,6-二氨基庚二酸	Chem Impex International	5411	Y. 小肠结肠炎 细胞生长所必需的。
4f 镜头	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm，2"
514 nm 激光	Coherent	Genesis MX514 MTM	用于荧光激发
琼脂糖	Inivtrogen	16520100	用于制作凝胶垫，以将液体细菌样品安装在显微镜上。
氯化铵	Sigma Aldrich	A9434	M2G 成分。
带通滤光片	Chroma	ET510/bp	激发通路。
脑心输液	Sigma Aldrich	53286	Y. 小肠结肠炎生长培养基。
氯化钙	Sigma Aldrich	223506	M2G 成分。
相机	Imaging Source	DMK 23UP031	用于相差成像的相机。
介电相位掩模	双螺旋，LLC	N/A	产生 DHPSF 信号。
磷酸二钠	Sigma Aldrich	795410	M2G 成分。
乙二胺四乙酸	Fisher Scientific	S311-100	螯合物 Ca2+。诱导 T3SS 分泌。
翻转镜	Newport	8892-K	允许在荧光和相差通路之间切换。
fluospheres	Invitrogen	F8792	荧光珠。540/560 激发和发射波长，直径 40 nm。
玻璃盖玻片	VWR	16004-302	#1.5,22mmx22mm
葡萄糖	Chem Impex International	811	M2G 成分。
浸油	Olympus	Z-81025	放置在物镜上。
硫酸铁 （II） Sigma	Aldrich	F0518	M2G 成分。
长通滤光片	Semrock	LP02-514RU-25	发射途径。
Fisher Scientific	S25414A	M2G 成分的	硫酸镁
显微镜平台	Mad City Labs	用于	倒置显微镜的定制平台。
萘啶酸	Sigma Aldrich	N4382	Y. 小肠结肠炎 细胞对萘啶酸具有耐药性。
物镜	Olympus	1-U2B991	60X， 1.4 NA
臭氧清洁剂	Novascan	PSD-UV4	用于消除玻璃盖玻片上的背景荧光。
磷酸钾	Sigma Aldrich	795488	M2G 成分。
红色 LED	Thorlabs	M625L3	照亮样品以进行相差成像。625纳米。
sCMOS 相机	滨松	ORCA-Flash 4.0 V2	相机，用于荧光成像。
短通滤光片	Chroma	ET700SP-2P8	发射途径。
镜筒状体	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm，2"
耶尔森氏菌小肠结肠炎dHOPEMTasd	N/A	N/A	菌株 AD4442，eYFP-YscQ
零阶四分之一波板	Thorlabs	WPQ05M-514	激发途径。