单分子追踪显微技术——用于确定细胞质分子扩散状态的工具

摘要

三维单分子定位显微技术被用于研究活体细菌细胞中荧光标记蛋白的空间位置和运动轨迹。本文所述的实验与数据分析方案基于整合的单分子轨迹，确定胞质蛋白的主要扩散行为。

摘要

单分子定位显微镜能够在生理相关环境中，以数十纳米的空间分辨率和毫秒级的时间分辨率探测活细胞中单个分子的位置与运动。这些特性使单分子定位显微镜非常适合研究分子水平的生物学功能。本文展示了一套整合的实验方案，用于获取、处理与分析单分子追踪数据，以提取目标蛋白可能表现出的不同扩散状态。该信息可用于量化活细胞中分子复合物的形成。我们详细描述了一种基于相机的三维单分子定位实验方法，以及后续生成单个分子运动轨迹的数据处理步骤。随后，利用数值分析框架对这些轨迹进行分析，以提取荧光标记分子的主要扩散状态及其相对丰度。该分析框架基于在任意细胞几何形状空间限制下的细胞内布朗扩散轨迹的随机模拟。根据模拟生成的轨迹，以与实验图像相同的方式生成并分析原始单分子图像。通过这种方式，将实验中难以校准的精度与准确度限制显式地纳入分析流程中。通过使用模拟分布的线性组合对实验值的分布进行拟合，确定主要扩散状态的扩散系数及其相对群体比例。我们通过解析一种蛋白在细菌病原体细胞质中形成同源和异源寡聚复合物时表现出的不同扩散状态，展示了本方案的有效性。

引言

研究生物分子的扩散行为有助于揭示其生物学功能。基于荧光显微镜的技术已成为在细胞原生环境中观察生物分子的有力工具。光漂白后荧光恢复（FRAP）和荧光相关光谱（FCS）¹可提供系综平均的扩散行为信息。相比之下，单分子定位显微镜能够以高空间和时间分辨率观测单个荧光标记的分子^2,3,4。观测单个分子具有优势，因为目标蛋白可能处于不同的扩散状态。例如，当大肠杆菌（Escherichia coli）中的转录调节因子CueR在细胞质中自由扩散，或结合到DNA序列上并在测量时间尺度上被固定时，会呈现出两种易于区分的扩散状态⁵。单分子追踪技术可直接观测这些不同状态，且无需复杂的分析即可分辨它们。然而，当不同扩散状态之间的扩散速率较为接近时，分辨多个扩散状态及其群体比例将变得更加困难。例如，由于扩散系数对分子尺寸的依赖性，蛋白质的不同寡聚化状态会表现为不同的扩散状态^6,7,8,9,

方案

1. 双螺旋点扩散函数校准

注意：本节及后续章节中描述的图像均使用自行搭建的倒置荧光显微镜获取，具体装置详见Rocha等人的研究²³。该方法同样适用于其他专为单分子定位与示踪显微技术设计的显微镜系统^2,3,4。本文所述图像采集与数据处理所用全部软件均可获取（https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git）。

1. 制备琼脂糖垫以将样品固定在玻璃盖玻片上，用于显微镜观察。
   1. 向5 mL M2G缓冲液（4.9 mM Na₂HPO₄，3.1 mM KH₂PO₄，7.5 mM NH₄Cl, 0.5 mM MgSO₄₄, 10 µM FeSO₄，0.5 mM CaCl₂ 以及0.2%葡萄糖）。微波加热数秒，直至所有琼脂糖溶解。切勿使溶液沸腾。
   2. 让琼脂糖溶液冷却几分钟（2-3 分钟）....

结果

在本文所述实验条件（20,000帧，轨迹长度至少包含4个定位点）下，根据荧光标记融合蛋白的表达水平，每个细胞可产生约200–3,000个定位点，形成10–150条轨迹图 2a，b). 要生成充分采样的表观扩散系数分布，需要大量的轨迹数据。此处采集的视场（FOV）大小约为 55 x 55 µm，每次实验采集10个视野（FOV）。因此，为了获得 >每次实验的5,000条轨迹中，每个视野应至少包含50个细胞。理想情况下，细胞群体应尽可能密集，但细胞之间不得相互接触。若细胞密度过高，则会出现细胞相互接触或重叠的情况，从而难以使用OUFTI成功进行分割。²⁸），如所述 数据后处理分割效果不佳可能导致细胞间的定位和轨迹分配错误。

本文展示了对Y. enterocolitica

讨论

成功应用本方案的一个关键因素是确保单分子信号在空间和时间上彼此充分分离（即信号在空间和时间上需足够稀疏）（补充视频 1）。如果同一时间细胞内存在多个发光分子，则定位结果可能被错误地关联到另一个分子的轨迹上，这一问题被称为“连接问题”³⁰。可通过选择适当的实验条件（如蛋白表达水平和激发激光强度）来避免连接问题。然而，应注意使蛋白表达水平接近野生型，以确保结果具有代表性。本研究中，我们采用在天然启动子控制下的等位基因替换策略，而非化学诱导表达，以保证标记蛋白的天然表达水平。因此，可通过调节激发激光强度（用于 eYFP 闪烁）或激活激光强度（用于光激活荧光探针）来控制活性发光分子在时间上的浓度。另外，当使用化学染料标记并结合 HALO 和 SNAP 标签时^31,32，可通过降低染料浓度，直至荧光信号足够稀疏，从而实现单分子追踪³³。本方案进一步通过排除同一细胞内同时出现两个或以上定位事件的轨迹，来消.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,6-二氨基庚二酸	Chem Impex International	5411	用于培养Y. enterocolitica细胞所必需。
4f透镜	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm，2"
514 nm激光器	Coherent	Genesis MX514 MTM	用于荧光激发
琼脂糖	Inivtrogen	16520100	用于制备凝胶垫，以在显微镜上固定液态细菌样品。
氯化铵	Sigma Aldrich	A9434	M2G组分。
带通滤光片	Chroma	ET510/bp	激发光路。
脑心浸液培养基	Sigma Aldrich	53286	Y. enterocolitica的生长培养基。
氯化钙	Sigma Aldrich	223506	M2G组分。
相机	Imaging Source	DMK 23UP031	用于相差成像的相机。
介电相位掩模	Double Helix, LLC	N/A	用于产生DHPSF信号。
磷酸氢二钠	Sigma Aldrich	795410	M2G组分。
乙二胺四乙酸	Fisher Scientific	S311-100	螯合Ca2+，可诱导III型分泌系统（T3SS）的分泌。
翻转镜	Newport	8892-K	用于在荧光与相差成像光路之间切换。
荧光微球	Invitrogen	F8792	荧光微珠，激发/发射波长为540/560 nm，直径40 nm。
玻璃盖玻片	VWR	16004-302	#1.5，22 mm × 22 mm
葡萄糖	Chem Impex International	811	M2G组分。
浸油	Olympus	Z-81025	滴加在物镜上使用。
硫酸亚铁	Sigma Aldrich	F0518	M2G组分。
长通滤光片	Semrock	LP02-514RU-25	发射光路。
硫酸镁	Fisher Scientific	S25414A	M2G组分。
显微镜平台	Mad City Labs	custom	倒置显微镜用平台。
萘啶酸	Sigma Aldrich	N4382	所使用的Y. enterocolitica细胞对萘啶酸具有抗性。
物镜	Olympus	1-U2B991	60X，1.4 NA
臭氧清洗仪	Novascan	PSD-UV4	用于消除玻璃盖玻片上的背景荧光。
磷酸钾	Sigma Aldrich	795488	M2G组分。
红色LED	Thorlabs	M625L3	用于相差成像的样品照明，波长625 nm。
sCMOS相机	Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	用于荧光成像的相机。
短通滤光片	Chroma	ET700SP-2P8	发射光路。
管镜	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm，2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A	菌株AD4442，eYFP-YscQ
零级四分之一波片	Thorlabs	WPQ05M-514	激发光路。