本文介绍了一种用于检测经KDM1A抑制剂处理的人或动物细胞、组织及血液样本中KDM1A靶点结合情况的实验方案。该方案利用化学探针标记游离的KDM1A酶，并通过基于化学探针的免疫检测方法直接定量靶点占据率，可用于临床前及临床研究。
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本文内容
摘要
摘要
靶点结合（即药物与其设计靶向的蛋白质之间的相互作用）的评估，是解释药物研发或基础研究项目中任何化合物生物学活性的基本要求。在表观遗传学领域，靶点结合通常通过分析替代标志物来评估，而非直接测量化合物与靶点的结合。已分析的下游生物学读数包括组蛋白修饰变化或基因表达改变。KDM1A 是一种赖氨酸去甲基化酶，可去除H3K4单甲基化和二甲基化上的甲基基团，该修饰与基因表达沉默相关。替代标志物的变化依赖于所研究细胞的细胞类型及其基因构成的功能，这使得结果解释和跨案例比较变得相当困难。为克服这些问题，本文提出了一种通用的实验方案，用于评估KDM1A直接靶点结合的剂量效应和动态变化。所述检测方法利用KDM1A化学探针捕获并定量未受抑制的酶，可广泛应用于细胞或组织样本，无需进行基因改造，具有优异的检测窗口，既可用于基础研究，也可用于临床样本分析。
引言
赖氨酸特异性去甲基化酶1（KDM1A）1是一种参与基因转录调控的去甲基化酶。该蛋白已成为肿瘤学领域潜在的药物靶点2，包括急性髓系白血病3（AML）、骨髓增生异常综合征（MDS）4、骨髓纤维化（MF）5,6、小细胞肺癌（SCLC）7；在镰状细胞病（SCD）8,9以及中枢神经系统疾病（如阿尔茨海默病（AD）、多发性硬化症（MS））和攻击行为10中也具有研究价值。
目前处于临床研发阶段的大多数KDM1A抑制剂均为环丙胺类衍生物，通过与黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子发生共价结合来抑制该蛋白活性11。KDM1A的抑制可引发基因表达的改变，但这些改变在不同组织、细胞类型或疾病状态下差异极大。KDM1A的抑制还可改变组蛋白修饰12，然而这些修饰通常仅在基因组的特定局部位点产生，且同样具有高度的组织和细胞特异性。
该方案旨在直接测定生物样品中KDM1A与靶点的结合情况，并已针对环丙胺类抑制剂的使用进行了优化。本检测基于ELISA技术，在固相检测体系中平行分析来自生物样品的天然蛋白提取物中的总KDM1A和游离KDM1A（即未与抑制剂结合的KDM1A）。第一步是在生物样品裂解过程中加入生物素标记的KDM1A特异性化学探针OG-88113,14，该探针源自选择性KDM1A抑制剂ORY-1001（iadademstat），后者是一种正处于临床开发阶段、用于治疗肿瘤性疾病的高效KDM1A抑制剂。该化学探针对KDM1A的IC50为120 nM，包含一个黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合基团，并连接有生物素化的聚乙二醇（PEG）尾部。该化学探针仅特异性结合样品中的游离KDM1A，而不结合已被抑制剂占据的KDM1A。在化学探针结合后，样品中含有KDM1A的复合物将被捕获至微孔板上：测定游离KDM1A时使用链霉亲和素包被的微孔板，测定总KDM1A时则使用包被了单克隆抗KDM1A捕获抗体的微孔板。洗涤后，两块板均与抗KDM1A检测抗体孵育，再次洗涤后，再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的驴抗兔IgG二抗孵育，随后使用发光底物进行检测，并通过化学发光仪测量相对光单位（RLU）进行定量分析（图1）。
图1. 用于检测KDM1A靶点结合的ELISA酶联化学探针免疫吸附测定示意图： A) 采用夹心ELISA法测定总KDM1A水平；B) 采用化学探针ELISA法测定游离KDM1A水平。请点击此处查看该图的放大版本。
在两块ELISA板中均包含标准曲线，以验证每次检测的线性关系。每个样本中KDM1A靶点结合的测定结果均相对于给药前或载体处理样本计算为相对值。
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方案
血样根据西班牙法规（生物库皇家法令 1716/2011）并经当地伦理委员会批准，由Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau生物样本库提供。动物组织相关研究均依照PRAAL-PCB动物实验伦理委员会制定的实验室动物护理与使用机构指南（欧洲共同体理事会指令86/609/EEC）进行。
1. 准备检测用的生物样本。
警告：本实验方案涉及生物样本的操作，可能受美国职业安全与健康管理局（OSHA）血源性病原体标准（29 CFR 1910.1030）、欧洲议会与理事会2000年9月18日第2000/54/EC号指令或类似法规的约束。此外，生物样本可能含有生物活性试验性化学化合物的残留物，且本方案可能涉及对这类化合物的进一步操作。实验开始前，应查阅所用化合物的安全数据表（SDS），并严格遵守研究机构制定的所有适用安全措施，包括使用适当的个人防护装备（PPE）。实验过程中须穿戴合适的防护服，并采取适当的屏蔽措施。残余物应丢弃于指定的废弃物容器中（生物危害/细胞毒性废物容器）。
注意：本方案从经 KDM1A 抑制剂处理的受试者细胞或样本及其未经处理或经载体/安慰剂处理的对照样本开始3。
- 经溶剂或KDM1A抑制剂体外处理的细胞
- 对于悬浮培养的细胞，以10 mL培养液体积转移至洁净的15 mL锥形管中，随后进行步骤1.1.3。
- 对于贴壁细胞（在75 cm²培养瓶中培养）2 移除培养瓶中的培养基，用 4 mL PBS 短暂洗涤。加入 1.5 mL 0.5% 胰蛋白酶-EDTA，消化 2–5 分钟以使细胞脱离（消化条件可能因细胞系而异，请参照供应商推荐条件），随后加入 4 mL PBS，将细胞转移至洁净的 15 mL 锥形管中。
- 将试管放入台式离心机中，以400 × g离心5分钟收集细胞 g 在 4 °C. 去除上清液，用移液器加入1 mL PBS重悬沉淀，并将悬液转移至1.5 mL微量离心管中。
- 将样品放入微量离心管中，以400 x g离心5分钟 g 在 4 °C. 用移液枪吸除 PBS，将沉淀物置于冰上并立即进行步骤 2；或在干冰上速冻沉淀物，随后于 -80 °C 直至第 3 步。
- 经溶剂/安慰剂或KDM1A抑制剂处理的受试者或动物样本
- 组织：将组织切成小块， ≈1 cm3 使用解剖刀将组织切成小块。将组织小块在液氮中冷冻2 在杜瓦瓶中并储存在 -80 °C 直至第 3 步
- 多态性外周血单个核细胞（PBMCs）：采集于K抗凝管中的新鲜血液10 mL（采血后2小时内完成处理），用适量培养基稀释2-EDTA 管中加入 2 体积 PBS 至 50 mL 离心管中。使用商品化的 PBMC 分离管，按照制造商说明书从血液中分离 PBMC。将细胞沉淀置于冰上，进行步骤 3.2；或在干冰上速冻后于 -80 °C 保存80 °C 直至第3步
注意：湿细胞沉淀量为 20 至 50 μL 含有 ≈ 1 × 107 细胞，具体体积取决于细胞大小。从10 mL健康人血液中获得的湿PBMC沉淀体积为 ≈ 20 μL 并且包含 ≈ 1 × 107 PBMCs。组织或细胞沉淀可在 -80 保存 ºC，最长可保存6个月。
2. 溶液配制
- 制备 2 μM OG-881 工作液：从 4 °C 冰箱中取出一支 10 μL 的 20 mM 生物素标记探针 OG-881 原液，室温（RT）放置 10 分钟。使用带滤芯吸头的移液器，通过在 PBS 中对 OG-881 原液进行逐级稀释，配制 2 μM 工作液，并在不同稀释步骤之间更换吸头。
- 制备 10x 蛋白酶抑制剂：将 1 片试剂溶解于 1 mL PBS 中，置于微量离心管内。
- 配制所需体积的含 25 nM OG-881 化学探针的 1x 细胞裂解缓冲液。每 1 mL 混合液中加入 100 μL 商品化的 10x 细胞裂解缓冲液、150 μL 10x 蛋白酶抑制剂、12.5 μL 2 μM OG-881 和 737.5 μL 一级双蒸水。
- 可选：参照步骤 2.3，配制所需体积的含 25 nM ORY-1001 而非 OG-881 的 1x 细胞裂解缓冲液。也可使用效价较低的抑制剂，但可能需要更高浓度，用于实现 100% 抑制的阳性对照（见步骤 3.5）。
注意：应采取适当措施，防止 OG-881 或 KDM1A 抑制剂原液对溶液或样品造成意外污染。计算含 25 nM OG-881 的 1x 细胞裂解缓冲液所需体积时，可按每 40 mg 粉碎组织需 400 µL，或每 107 个细胞的湿沉淀需 200 µL 估算。
3. 天然蛋白质提取
- 从组织中：
- 研磨并匀浆化一个 ≈ 1 cm3 用预冷在干冰上的研钵和研杵将冷冻组织块研磨成粉，分装至一次性小管中，每管含 ≈ 40 mg 组织粉末，全程避免解冻。立即进行步骤 3.1.2. 以进行后续处理，或保存于 -80 °C.
- 将40 mg粉末状组织重悬于 400 µL 加入1×细胞裂解缓冲液和25 nM OG-881，涡旋10秒，然后用18号钝头注射器针头反复推注样品至少五次，直至组织完全裂解，获得浑浊的浅黄色至橙色悬液。避免产生气泡。
- 继续进行步骤 3.3
- 从细胞沉淀（PBMC 和细胞系）：
- 重悬一管沉淀 ≈ 1 × 107 细胞中 200 µL 加入含有25 nM OG-881的1×细胞裂解缓冲液。短暂涡旋混匀样品，冰上孵育5分钟。
- 在超声波破碎仪中对样品进行超声处理，每次20秒，共3次，频率为45 kHz；每次超声间隔将样品置于冰上冷却20秒。
注意：生物样本一旦在1x细胞裂解缓冲液中重悬后，后续操作过程中应始终置于冰上。
- 将样品置于冰上静置5分钟，短暂涡旋振荡后，在预冷的离心机中以14 000 × g离心10分钟 4 °C.
- 使用1 mL移液器将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中，冰上放置2 h。继续进行第4步。
- 可选地，可按如下方法制备阳性对照以模拟100%靶点结合：
- 将对照或未处理（给药前）样本的细胞沉淀或冻存组织粉末用含有25 nM ORY-1001的适量1×细胞裂解缓冲液重悬，并按照步骤3.1至3.3所述方法进行处理。
- 将阳性对照的上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中，置于冰上孵育1 h。ORY-1001可特异性抑制KDM1A，从而阻断化学探针的结合。
- 添加 5 μL 的 2 μM 向阳性对照上清液（由40 mg组织样本产生的阳性对照体积）中加入OG-881工作液 2.5 μL 的 2 μM OG-881 工作液（阳性对照用，由10生成的体积）7-细胞样品）调整至与其他样品相同的OG-881浓度，并在冰上孵育2小时。继续进行第4步。
4. 使用 Bradford 法测定天然蛋白质含量
- 将商业来源的Bradford蛋白质测定试剂用H2O型1号双蒸水。根据样品和标准品的总数计算所需试剂体积（每个样品或标准品1 mL，另加5 mL过量体积）。
- 对于牛血清白蛋白（BSA）标准曲线，准备1个含有1 mL稀释的Bradford蛋白检测试剂（空白）的微量离心管，以及7个微量离心管 995 μL 稀释后的Bradford蛋白测定溶液。加入 5 μL 每种BSA标准品（浓度范围从125到 2,000 µg/mL将上述溶液分别加入7个微量离心管中，轻轻翻转管子数次以混匀。室温孵育5分钟。
- 将稀释后的标准品转移至比色皿中，使用分光光度计在280 nm处测定空白对照和牛血清白蛋白标准品样品的OD值。
- 对于生物样品，准备一个含有1 mL稀释的Bradford蛋白测定溶液（空白）的微量离心管，以及若干含有 999 μL 稀释后的Bradford蛋白测定试剂作为待测样品。使用自动P2移液器，加入 1 μL 将第3步制备的天然蛋白提取物加入各微量离心管中，通过轻轻翻转管子数次混匀。室温孵育5分钟。
- 将各体积样品转移至比色皿中，使用分光光度计在280 nm波长下测定样品的OD值。
- 优先立即进行步骤5。或者，将天然蛋白质提取物保存在-80 °C 直至第5步。避免冻融循环。
5. 用于总KDM1A和游离KDM1A检测的发光ELISA
注意：将实验室温度恒定保持在 23-24 °C（室温）。
- 使用捕获性 KDM1A 抗体或链霉亲和素包被微量滴定板
- 总 KDM1A ELISA：每块板，用 PBS 将 KDM1A 捕获抗体配制为最终浓度 2 μg/mL，总体积 10 mL。向板的每个孔中加入 100 µL。
- 游离 KDM1A ELISA：每块板，用 PBS 将链霉亲和素配制为 10 µg/mL，总体积 10 mL。向板的每个孔中加入 100 µL。
- 用自粘膜密封总 KDM1A 和游离 KDM1A ELISA 板，并在 4 °C 冰箱中过夜孵育。
- 洗涤与封闭板
- 将板从冰箱中取出，在使用前于室温平衡约 45 分钟。
- 每块板准备 1,000 mL 洗涤缓冲液（含 0.1% Tween 的 PBS）和 50 mL 封闭缓冲液（含 1% BSA 的 PBS）。
- 用洗涤缓冲液洗涤板 3 次。在此步骤及后续步骤中，每次洗涤后均需将板在纸巾上轻拍，以去除残留液体。
- 向两块板的每个孔中加入 200 µL 封闭缓冲液，用自粘膜密封两块板，并在室温孵育 2 小时。
- 生物样本制备
- 使用 PBS 将第 3 步末获得的天然蛋白提取物稀释至适当浓度。推荐浓度将根据生物样本中 KDM1A 的表达水平而变化。适当的浓度范围示例如下：（1）细胞沉淀：每孔 0.5 - 10 μg；（2）外周血单个核细胞（PBMCs）：每孔 5 - 30 μg；（3）粉碎组织（脑、肺、皮肤）：每孔 20 - 100 μg。样本制备过程中保持冰上操作。在条件允许时，进行技术重复三份的样本分析。
- 使用人重组 KDM1A（rKDM1A）制备标准曲线：
- 为制备 KDM1A 标准工作液，用移液器取适量体积的 rKDM1A，使其终浓度为 25 pg/µL，加入 75 μL 的 2 μM OG-881，并用 1×PBS 定容至总体积 6 mL，置于 15 mL 离心管中。将 KDM1A 标准工作液置于冰上 1 小时，并每隔 20 分钟轻轻倒置 15 mL 离心管数次以混匀溶液。
- 根据表 1（标准品制备），在 1.5 mL 微量离心管中制备 KDM1A 标准稀释系列，配制体积需满足两个 96 孔微量滴定板的三份重复分析所需。
| 标准系列 | KDM1A 标准工作溶液（µL) | |
| （每孔 pg KDM1A） | PBS（磷酸盐缓冲液）µL) | |
| 2500 对于 C-* | 800 | - |
| 2500 | 800 | - |
| 1750 | 560 | 240 |
| 1250 | 400 | 400 |
| 750 | 240 | 560 |
| 250 | 80 | 720 |
| 25 | 8 | 792 |
| 0 | 0 | 800 |
| 注意： | ||
| (1) 每种稀释液的配制体积足以在2块检测板上各进行3次重复实验。 | ||
| (2) 推荐范围为每孔 2.5 至 5,000 pg | ||
| * 作为阴性对照 C-，不加KDM1A检测抗体 | ||
表1：标准品配制。配制KDM1A蛋白标准品系列时，将指定体积的KDM1A标准工作液和PBS分别加入八个正确标记的1.5 mL微量离心管中。
表 2：深孔板设计。将步骤 5.4.2 中的标准品（蓝色）和样品（黄色）移液至深孔板中对应的位置，以便按照蓝色（标准品）和黄色（样品）箭头的方向加载至 ELISA 板中。请点击此处下载该文件。
表 3：ELISA 板设计。 该检测板包含重组 KDM1A 靶标的浓度递减的标准曲线（蓝色）；生物样本（S，黄色）；以及相应的阴性对照（包含样本但不含一抗检测抗体，白色），这些将从深孔板加样至 ELISA 板中。空白孔（标准曲线中的 0）包含所有捕获和检测试剂，但不含样本。请点击此处下载该文件。
- ELISA
- （接步骤 5.2.4）孵育 2 小时后，弃去封闭缓冲液，并用洗涤缓冲液洗涤酶标板。
- 将适当稀释的样品（天然蛋白提取物和步骤 5.3 中的标准曲线样品）按照 表 2（深孔板设计）所示的板分布转移至冷藏的 96 孔深孔储存板中。
- 将该深孔板置于冰上保存，直至按照 表 3（ELISA 板设计）所示的板分布，向总 KDM1A 和游离 KDM1A ELISA 板中每孔加入 100 μL 样品。
- 室温孵育 1 小时，弃去样品，用洗涤缓冲液洗涤酶标板 5 次。
- 在封闭缓冲液中配制 20 mL 兔抗 KDM1A 检测抗体（终浓度为 0.125 µg/mL），除阴性对照孔（C-）外，向每块板的每孔中加入 100 µL；用顶部密封膜封板，室温孵育 1 小时。
- 弃去检测抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤酶标板 6 次。
- 在封闭缓冲液中将二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 抗体）按 1:5,000 稀释，配制 25 mL，每孔加入 100 µL 至微孔板中，室温孵育 1 小时。
- 化学发光检测
- 在步骤 5.4.7 结束前 30 分钟，在弱光条件下，将 Luminol 增强液与过氧化物溶液等体积混合（10.5 mL : 10.5 mL，适用于 2 块板），置于棕色瓶中，室温放置。
注意：Luminol 工作液应保存在棕色瓶中，避免长时间暴露于强光下。短时间暴露于常规实验室光照不会影响工作液的性能。 - 在开始检测发光信号前至少 20 分钟，开启酶标仪并设定温度为 25 °C，读数参数设置为积分时间 1,000 毫秒，稳定时间 150 毫秒。参数设置可能需根据具体仪器进行优化。
- 步骤 5.4.7 孵育 1 小时后，弃去二抗溶液，用洗涤缓冲液洗涤酶标板 6 次。
- 向每孔加入 100 µL 步骤 5.5.1 中配制的 Luminol 工作液（化学发光底物），加样时务必缓慢，避免产生气泡。使用计时器严格控制从加样到进行发光检测之间的时间间隔，并保持该时间恒定，以确保不同实验间的良好重复性。
- 用顶部密封膜封板后，在板式离心机中以 500 × g 室温离心 45 秒，以消除残留气泡。随后在板式振荡器上以 100 rpm 振荡孵育 1 分钟。
- 将酶标板放入酶标仪中，不加盖粘性膜，静置 3 分钟，使板内温度稳定至 25 °C。始终优先检测游离 KDM1A ELISA 板。
- 读取每块 ELISA 板（游离和总 KDM1A）的相对发光单位（RLU）。
- 从原始数据 Excel 文件中保存并复制原始 RLU 值，用于后续结果分析。
- 在步骤 5.4.7 结束前 30 分钟，在弱光条件下，将 Luminol 增强液与过氧化物溶液等体积混合（10.5 mL : 10.5 mL，适用于 2 块板），置于棕色瓶中，室温放置。
6. 靶点结合率的计算
- 在电子表格软件中，计算样品 S 的 RLU Free 和 RLU Total 值X 以及来自其技术重复样本的原始数据中的参考样本 REF（未经处理、溶剂处理或给药前样本），具体如下：
- 输入空白孔、标准曲线、阴性对照 C- 和生物样本（S）的各个原始 RLUi 总值和原始 RLUi 游离值X 并将分析数据表（例如，Excel）中标准曲线得出的KDM1A含量（以pg为单位）输入数据表中。
- 计算原始平均 RLU 及标准差 σRLU，以及变异系数 CVRLU 根据每个技术重复数据点的原始总 RLUi 和原始游离 RLUi 数据。
- 应用离群值剔除（以三复孔为例）：针对每个技术重复三孔中的单个原始 RLU 总值和原始 RLU 游离值数据点 RLUi，当三孔的 CV 满足条件时，应用 Grubbs 法则 > 0.15，并在单个可疑原始RLU值满足该条件时予以剔除
,
其中，当 n = 3 且置信区间（CI）为 90% 时，Z = 1.148。 - 若应用了离群值剔除，则需重新计算原始平均 RLU 值和标准差 σRLU 和 CVRLU 根据每个数据点的非排斥（nr）Raw RLUi 总值和 Raw RLUi 游离值计算。
- 应用背景校正：计算每个标准样品及每个样品S的RLU Free和RLU Total的平均值X 以及参考样本 REF 作为：
- 以图形方式表示数据如下：
- 绘制相对光单位（RLU）免费 和 RLU总计 条形图中各样本鉴定结果（X轴）相对于其数值（Y轴）的表示。
- 同时，将标准品的RLU值（Y轴）相对于rKDM1A蛋白的含量（pg，X轴）分别绘制散点图，用于游离态和总态的检测，并绘制相应的线性趋势线，计算r值。2 （线性相关系数的平方）值。
- 计算靶点结合率（TE），即每个样本 S 中 KDM1A 抑制剂结合的 KDM1A 占比X 相对于参考样本 REF（未经处理、给予载体或给药前样本），方法如下：
- 根据以下公式，计算 SX 和 REF 样品的游离（Free）与总（Total）平均 RLU 值的比值 R：
- 然后计算样本 S 的靶点结合率（TE）X 作为：
可选：（1）若进行了 N 次生物学重复实验，每次实验包含 n 个技术重复；首先计算 TESX 针对技术重复组，随后计算生物学重复组的平均TE值、标准差（SD）和变异系数（CV）值。
- 根据以下公式，计算 SX 和 REF 样品的游离（Free）与总（Total）平均 RLU 值的比值 R：
- 修订确认是否满足检测验收标准：验证（1）检测背景值是否可接受，且空白孔平均值 < 0.05 × 107 RLU；（2）样品无自发光现象，且阴性对照 C- 的 RLU 值低于定量下限（LLOQ = 空白均值 + 10 × 标准差）；（3）rKDM1A 标准曲线呈线性，且 r² ≥ 0.98；（4）生物样品的 RLU 值位于检测方法的动态线性范围内，即介于 LLOQ 与 2,500 pg/孔之间。
注：步骤 6.1 至 6.4 可在微积分数据表中轻松实现自动化。 - 将转座元件（TE）数据导出至用户选定的开源或商业统计软件，用于TE值的图形化展示及进一步的统计分析。
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结果
总KDM1A和游离KDM1A检测的线性关系。
标准品系列按照步骤5.3.2所述方法制备，使用0至2500 pg的全长人源重组KDM1A酶。通过检测总rKDM1A和游离rKDM1A的RLU值以验证其线性关系（图2A 和 2B）。数据表示为3次独立实验、每次3个技术重复（n）的平均值±标准差（SD）。在3名独立志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）中检测到的总KDM1A和游离KDM1A的RLU值叠加于 图2C 和 2D 的标准曲线中。血液样本来自西班牙生物银行法规（Real Decreto de Biobancos 1716/2011）及当地伦理委员会批准的Instituto de Investigación Biomédica S...
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讨论
本方案旨在利用一种新型的基于KDM1A化学探针捕获的ELISA方法，直接测量KDM1A的靶点结合情况。该方法已在培养的人源细胞系以及人、大鼠、小鼠和狒狒的离体样本（包括外周血单个核细胞、肺、脑、皮肤和肿瘤组织）中得到验证，也可便捷地应用于其他KDM1A抗体靶向表位及催化中心保守的物种。由于OG-881是一种基于活性的化学探针，因此样本质量至关重要，在实验流程的初始步骤中尤其需要规范操作和妥善保存样本，以确保KDM1A的酶活性得以维持。
本实验方案已优化，用于分析共价靶向FAD的抑制剂对KDM1A的靶点结合情况。该方案也可用于阻断KDM1A辅因子FAD结合位点的可逆性抑制剂。对于具有长停留时间的强效可逆性抑制剂，可直接采用未经修改的实验方案。
OG-881 化学探针可能不适用于具有高解离速率的低效价可逆性抑制剂。本研究中使用的特定化学探针不具备细胞膜穿透能力，因此分析需在体外对裂解样品进行。
该方法可在科研和分析实验室中广泛配备的仪器上运行；无需对细胞引入基因修饰，且可轻松...
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披露
作者 Tamara Maes 是 Oryzon Genomics S.A. 的执行董事和股东，作者 Cristina Mascaró 和 Raquel Ruiz Rodriguez 是 Oryzon Genomics S.A. 的员工。Oryzon Genomics S.A. 正在开发 KDM1A 抑制剂，并拥有涵盖本文所用化合物和方法的专利。
致谢
本研究由 Oryzon Genomics S.A. 和 Hoffman-La Roche 资助，并得到 CIIP-20152001 及 RETOS 合作项目 RTC-2015-3332-1 的部分支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X 蛋白酶抑制剂片剂 | Roche | #11836153001 | |
| 96 孔深孔储存板 | VWR | #734-1679 | |
| 96 孔 ELISA 板 | Nunc | #436110 | |
| 黑色粘性膜 | Perkin Elmer | #6050173 | |
| 透明粘性膜 | VWR | #60941-062 | |
| 生物素标记的 KDM1A 探针 OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | # 3117057001 | |
| 牛血清白蛋白标准品 | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford 蛋白检测试剂盒 | BioRad | #500-0001 | |
| 细胞裂解缓冲液 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| 适用于 96 孔板的离心机 | Hettich | Rotina 420R | |
| 烧瓶 | Thermo Scientific | #156499 | |
| 全长、酶活性人源重组 LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 项目 | GraphPad Software | NA | |
| 鲁米诺增强剂和过氧化物溶液（化学发光底物） | Thermo Scientific | #37074 | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5415 R | |
| 无限 200-Tecan 微孔板读数仪 | Tecan | Infinite 200 | |
| 小鼠单克隆捕获抗体 Anti-KDM1A（N 端表位） | Abcam | #ab53269 | |
| 18 号钝头针 | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC 分离管 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC 分离管 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| 板式振荡器 | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| 聚山梨酯 20 | Sigma | #P7949 | |
| 兔单克隆检测抗体 Anti-KDM1A（C 端表位） | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| 二抗 辣根过氧化物酶标记驴抗兔 IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| 比色皿光度计 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| 比色皿用分光光度计 | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| 链霉亲和素 | Promega | #Z704A | |
| 注射器 | BD | #303172 | |
| 1 型超纯水 | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| 超声波清洗器 | VWR | USC200T |
参考文献
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