本文介绍了一种用于检测经KDM1A抑制剂处理的人或动物细胞、组织及血液样本中KDM1A靶点结合情况的实验方案。该方案利用化学探针标记游离的KDM1A酶，并通过基于化学探针的免疫检测方法直接定量靶点占据率，可用于临床前及临床研究。
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本文内容
摘要
摘要
靶点结合（即药物与其设计靶向的蛋白质之间的相互作用）的评估，是解释药物研发或基础研究项目中任何化合物生物学活性的基本要求。在表观遗传学领域，靶点结合通常通过分析替代标志物来评估，而非直接测量化合物与靶点的结合。已分析的下游生物学读数包括组蛋白修饰变化或基因表达改变。KDM1A 是一种赖氨酸去甲基化酶，可去除H3K4单甲基化和二甲基化上的甲基基团，该修饰与基因表达沉默相关。替代标志物的变化依赖于所研究细胞的细胞类型及其基因构成的功能，这使得结果解释和跨案例比较变得相当困难。为克服这些问题，本文提出了一种通用的实验方案，用于评估KDM1A直接靶点结合的剂量效应和动态变化。所述检测方法利用KDM1A化学探针捕获并定量未受抑制的酶，可广泛应用于细胞或组织样本，无需进行基因改造，具有优异的检测窗口，既可用于基础研究，也可用于临床样本分析。
引言
赖氨酸特异性去甲基化酶1（KDM1A）1是一种参与基因转录调控的去甲基化酶。该蛋白已成为肿瘤学领域潜在的药物靶点2，包括急性髓系白血病3（AML）、骨髓增生异常综合征（MDS）4、骨髓纤维化（MF）5,6、小细胞肺癌（SCLC）7；在镰状细胞病（SCD）8,9以及中枢神经系统疾病（如阿尔茨海默病（AD）、多发性硬化症（MS））和攻击行为10中也具有研究价值。
目前处于临床研发阶段的大多数KDM1A抑制剂均为环丙胺类衍生物，通过与黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子发生共价结合来抑制该蛋白活性11。KDM1A的抑制可引发基因表达的改变，但这些改变在不同组织、细胞类型或疾病状态下差异极大。KDM1A的抑制还可改变组蛋白修饰12，然而这些修饰通常仅在基因组的特定局部位点产生，....
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方案
血样根据西班牙法规（生物库皇家法令 1716/2011）并经当地伦理委员会批准，由Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau生物样本库提供。动物组织相关研究均依照PRAAL-PCB动物实验伦理委员会制定的实验室动物护理与使用机构指南（欧洲共同体理事会指令86/609/EEC）进行。
1. 准备检测用的生物样本。
警告：本实验方案涉及生物样本的操作，可能受美国职业安全与健康管理局（OSHA）血源性病原体标准（29 CFR 1910.1030）、欧洲议会与理事会2000年9月18日第2000/54/EC号指令或类似法规的约束。此外，生物样本可能含有生物活性试验性化学化合物的残留物，且本方案可能涉及对这类化合物的进一步操作。实验开始前，应查阅所用化合物的安全数据表（SDS），并严格遵守研究机构制定的所有适用安全措施，包括使用适当的个人防护装备（PPE）。实验过程中须穿戴合适的防护服，并采取适当的屏蔽措施。残余物应丢弃于指定的废弃物容器中（生物危害/细胞毒性废物容器）。
注意：本方案从经 KDM1A 抑制剂处理的受试者细胞或样本及其未经处理或经载体/安慰剂处理的对照样本开始3。
- 经溶剂或KDM1A抑制剂体外处理的细胞
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结果
总KDM1A和游离KDM1A检测的线性关系。
标准品系列按照步骤5.3.2所述方法制备，使用0至2500 pg的全长人源重组KDM1A酶。通过检测总rKDM1A和游离rKDM1A的RLU值以验证其线性关系（图2A 和 2B）。数据表示为3次独立实验、每次3个技术重复（n）的平均值±标准差（SD）。在3名独立志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）中检测到的总KDM1A和游离KDM1A的RLU值叠加于 图2C 和 2D 的标准曲线中。血液样本来自西班牙生物银行法规（Real Decreto de Biobancos 1716/2011）及当地伦理委员会批准的Instituto de Investigación Biomédica S.......
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讨论
本方案旨在利用一种新型的基于KDM1A化学探针捕获的ELISA方法，直接测量KDM1A的靶点结合情况。该方法已在培养的人源细胞系以及人、大鼠、小鼠和狒狒的离体样本（包括外周血单个核细胞、肺、脑、皮肤和肿瘤组织）中得到验证，也可便捷地应用于其他KDM1A抗体靶向表位及催化中心保守的物种。由于OG-881是一种基于活性的化学探针，因此样本质量至关重要，在实验流程的初始步骤中尤其需要规范操作和妥善保存样本，以确保KDM1A的酶活性得以维持。
本实验方案已优化，用于分析共价靶向FAD的抑制剂对KDM1A的靶点结合情况。该方案也可用于阻断KDM1A辅因子FAD结合位点的可逆性抑制剂。对于具有长停留时间的强效可逆性抑制剂，可直接采用未经修改的实验方案。
OG-881 化学探针可能不适用于具有高解离速率的低效价可逆性抑制剂。本研究中使用的特定化学探针不具备细胞膜穿透能力，因此分析需在体外对裂解样品进行。
该方法可在科研和分析实验室中广泛配备的仪器上运行；无需对细胞引入基因修饰，且可轻松.......
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披露
作者 Tamara Maes 是 Oryzon Genomics S.A. 的执行董事和股东，作者 Cristina Mascaró 和 Raquel Ruiz Rodriguez 是 Oryzon Genomics S.A. 的员工。Oryzon Genomics S.A. 正在开发 KDM1A 抑制剂，并拥有涵盖本文所用化合物和方法的专利。
致谢
本研究由 Oryzon Genomics S.A. 和 Hoffman-La Roche 资助，并得到 CIIP-20152001 及 RETOS 合作项目 RTC-2015-3332-1 的部分支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X 蛋白酶抑制剂片剂 | Roche | #11836153001 | |
| 96 孔深孔储存板 | VWR | #734-1679 | |
| 96 孔 ELISA 板 | Nunc | #436110 | |
| 黑色粘性膜 | Perkin Elmer | #6050173 | |
| 透明粘性膜 | VWR | #60941-062 | |
| 生物素标记的 KDM1A 探针 OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | # 3117057001 | |
| 牛血清白蛋白标准品 | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford 蛋白检测试剂盒 | BioRad | #500-0001 | |
| 细胞裂解缓冲液 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| 适用于 96 孔板的离心机 | Hettich | Rotina 420R | |
| 烧瓶 | Thermo Scientific | #156499 | |
| 全长、酶活性人源重组 LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 项目 | GraphPad Software | NA | |
| 鲁米诺增强剂和过氧化物溶液（化学发光底物） | Thermo Scientific | #37074 | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5415 R | |
| 无限 200-Tecan 微孔板读数仪 | Tecan | Infinite 200 | |
| 小鼠单克隆捕获抗体 Anti-KDM1A（N 端表位） | Abcam | #ab53269 | |
| 18 号钝头针 | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC 分离管 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC 分离管 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| 板式振荡器 | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| 聚山梨酯 20 | Sigma | #P7949 | |
| 兔单克隆检测抗体 Anti-KDM1A（C 端表位） | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| 二抗 辣根过氧化物酶标记驴抗兔 IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| 比色皿光度计 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| 比色皿用分光光度计 | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| 链霉亲和素 | Promega | #Z704A | |
| 注射器 | BD | #303172 | |
| 1 型超纯水 | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| 超声波清洗器 | VWR | USC200T |
参考文献
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T.
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