Method Article

使用基于化学探针的免疫测定直接测量KDM1A目标参与

DOI:

10.3791/59390

⸱

June 13th, 2019

 ,  , 
1Oryzon Genomics

In This Article

Summary

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在这里,我们提出一个协议,以测量KDM1A靶向在使用KDM1A抑制剂处理的人或动物细胞、组织或血液样本中的参与度。该协议采用自由KDM1A酶的化学探针标记,并使用基于化学探针的免疫测定直接定量目标职业,可用于临床前和临床研究。

Abstract

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对靶向参与的评估,即药物与其设计的蛋白质相互作用,是解释药物开发或基础研究项目中任何化合物的生物活性的基本要求。在表观遗传学中,目标参与度通常通过分析代理标记而不是测量化合物与目标的结合来评估。已分析的下游生物读出包括组蛋白标记调制或基因表达变化。KDM1A是一种以源脱甲基酶,从单甲基和二甲基化H3K4中去除甲基组,这是一种与基因表达沉默相关的修饰。代理标记的调制取决于被调查细胞的细胞类型和功能,这使得解释和交叉案例比较相当困难。为了规避这些问题,提出了一个通用的协议,以评估直接KDM1A目标参与的剂量效应和动态。所述测定利用KDM1A化学探针捕获和量化无抑制酶,可广泛应用于细胞或组织样本,无需基因改造,具有极好的检测窗口,可用于基础研究临床样本分析。

Introduction

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莱辛特异性脱甲基酶1(KDM1A)1是一种参与控制基因转录的脱甲基酶。这种蛋白质已成为肿瘤学的候选药理靶点2;包括急性骨髓性白血病3(AML),骨髓增生综合征(MDS)4,骨髓纤维化(MF)5,6,小细胞肺癌(SCLC)7;在病变细胞病(SCD)8,9,和在中枢神经系统疾病,包括阿尔茨海默氏病(AD),多发性硬化症(MS);并在侵略10。

临床开发中的大多数KDM1A抑制化合物是环丙胺衍生物,通过共价结合其片苷二核苷酸(FAD)联因子11来抑制蛋白质。KDM1A的抑制诱导基因表达变化,但这些变化在组织、细胞类型或疾病病例之间变化很大。抑制KDM1A也改变组蛋白标记12,但这些变化一般在基因组的特定部位本地产生,并再次是高度组织和细胞特异性。

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Protocol

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根据西班牙立法(第1716/2011年《生物资源研究法》)并经当地道德委员会批准,从圣保生物库研究所获得血液样本。动物组织研究是根据动物实验伦理委员会制定的关于护理和使用实验室动物的机构准则(欧洲共同体理事会第86/609/EEC号指令)进行的。普拉-多氯联苯。

1. 制备用于检测的生物样本。

注意:本协议涉及操纵可能受职业安全与健康管理局 (OSHA) 血液传播病原体标准 (29 CFR 1910.1030)、 欧洲议会指令 2000/54/EC 和2000年9月18日理事会或同等条例。此外,生物样品可能含有生物活性研究性化合物的痕迹,该议定书可能涉及进一步操作此类化合物。查看实验开始前使用的化合物的安全数据表 (SDS),并严格遵守研究中心制定的所有适用安全措施,包括使用适当的个人防护设备 (PPE)。在实验过程中,请穿适当的防护服并使用适当的屏蔽。丢弃适当废物容器中的残留物(生物/细胞毒性废物)。

注:本协议从使用KDM1A抑制剂治疗的受试者的细胞或样本及其未经治疗或车辆/安慰剂处理对照组3开始。

  1. 在体外用车辆或KDM1A抑制剂处理的细胞
    1. 对于在悬浮液中生长的细胞,作为10 mL培养,将悬浮液转移到干净的15 mL锥形管中,然后转到1.1.3。
      2. ....

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Results

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总和游免费 KDM1A 测定的线性度。

标准系列是编写步骤5.3.2.的,使用0至2500皮克的全长人体重组KDM1A酶。评估了总和自由 rKDM1A 的 RLU 值以验证线性度(图 2A和2B)。数据表示为 3 个实验的平均值,3 个技术复制 (n) = SD。在3个独立志愿者的血液中检测出人类PBMC中总和游离KDM1A的RLU值被叠加在图2C和2D的标准曲线上。根据西班牙立法(第1716/2011年《生物资源研究法》)并经当地道德委员会批准,从圣保生物库研究所获得血液样本。

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Discussion

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此处介绍的协议是使用基于新型 KDM1A 化学探针捕获的 ELISA 直接测量 KDM1A 目标参与度的。该方法已对培养的人类细胞系和来自人类、大鼠和小鼠和巨蜥(包括PBMC、肺、大脑、皮肤、肿瘤)的体外样本进行了验证,但可随时应用于KDM1A抗体靶向表位和催化的其他物种中心是保存的。由于OG-881是一种基于活性的化学探针,样品质量很重要,因此,特别是在协议的初始步骤中,应进行适当的操作和保护,以确保KDM1A活性得到保护。

通过共价FAD靶向抑制剂对目前的实验方案进行了优化,以分析KDM1A目标参与度。它还可用于可逆抑制剂,阻止对KDM1AFAD联因的接入。具有长时间停留的强效可逆抑制剂可采用未修改的协议。

OG-881化学探针可能不适合低效力可逆抑制剂的高离率。本手稿中使用的特定化学探针不是细胞渗透剂,因此对被分的样品进行活体分析。

该方法可在研究和分析实验室中广泛使用的仪器上运行;它不需要将基因修饰引入细胞,并且可以很容易地应用于不同的样本类型。另一个优点是,它可.......

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Disclosures

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作者塔玛拉·梅斯是执行董事和股东,作者克里斯蒂娜·马斯卡雷和拉奎尔·鲁伊斯·罗德里格斯是奥里松基因组学公司的员工,奥里松基因组学S.A.开发KDM1A抑制剂,并拥有涉及化合物和所用方法的专利在本文中。

Acknowledgements

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这项研究由奥里松基因组学资助。S.A.,霍夫曼-拉罗氏,部分支持CIIP-20152001和RETOS合作项目RTC-2015-3332-1。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% 胰蛋白酶-EDTA （1X）Thermo Scientific#25300-062
10 X 蛋白酶抑制剂片剂Roche#11836153001
96 深孔储存模块VWR#734-1679
96 孔 ELISA 板Nunc#436110
胶粘剂 黑色薄膜Perkin Elmer#6050173
胶粘剂透明薄膜VWR#60941-062
生物素化 KDM1A 探针 OG-881Oryzon Genomics S.A.
牛血清白蛋白Sigma# 3117057001
牛血清白蛋白标准Thermo Scientific#23208）
Bradford 蛋白测定BioRad#500-0001
细胞裂解缓冲液 10X细胞信号传导#9803
离心机，用于 96 孔板HettichRotina 420R
烧瓶Thermo Scientific#156499
全长、酶活性人重组 LSD1 / KDM1A活性基序#31426
Graphpad Prism 5 ProjectGraphPad 软件NA
Luminol-Enhacer 和过氧化物溶液（化学发光底物）Thermo Scientific#37074
微量离心Eppendorf5415 R
微孔板检测仪 Infinite 200-TecanTecanInfinite 200
小鼠单克隆捕获抗体 抗 KDM1A（N 末端表位）Abcam#ab53269
针 G18 规格平头BD#303129
ORY-1001 （iadademstat）Oryzon Genomics S.A.
PBMC 分离管 10 mlGreiner bio-one#163288
PBMC 分离管 50 mlGreiner bio-one#227288
PBS 1xSigma#D8537
板振荡器Heidolph InstrumentsRotamax 120
聚山梨酯 20Sigma#P7949
兔单克隆检测抗体 抗 KDM1A（C 端表位）细胞信号传导#672184BF-100
二抗 过氧化物酶偶联的驴抗兔 IgGThermo Scientific#31458
分光光度计 比色皿 1.5Deltalab#302100
分光光度计 比色皿GE HealthcareGeneQuant 1300
链霉亲和素Promega#Z704A
注射器BD#303172
Type 1 超纯水MilliporeMilli-Q Advantage A10
超声波清洗机VWRUSC200T
NA机 NA

References

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  1. Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
  2. Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
  3. Maes, T.

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KDM1A Target EngagementChemoprobe based ImmunoassayDirect MeasurementKDM1A ChemoprobeELISA ProtocolProtein ExtractionCell Lysis BufferStreptavidin CoatingAnti KDM1A AntibodyLuminescence Detection

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