一种轻柔触动力加载装置由人发刷、机械臂和控制器构成。装置上的机械臂驱动发刷，使其周期性运动，对植物施加触动力。该机械装置产生的发刷触动力与人工施加的触动力相当。
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摘要
摘要
植物在响应细胞内和细胞外的机械刺激（或力信号）时会产生特殊的形态变化，这一过程称为接触形态发生（thigmomorphogenesis）。在过去几十年中，已有多个信号组分被鉴定并报道参与了机械信号转导过程（例如钙离子结合蛋白和茉莉酸生物合成酶）。然而，力信号或接触形态发生研究进展相对缓慢，主要原因有两个：一是诱导接触形态发生依赖费力的人工手动触摸操作，二是人为触摸施加的力强度存在误差。为了提高对植物施加外力的效率，研究人员研制了一种自动触发力加载装置。该装置由机械臂驱动毛刷进行接触操作，可实现省力、易于重复的触发力模拟，支持无限次重复触摸，并可调节触摸强度。这种毛发触发力加载装置既可用于大规模筛选触发力信号突变体，也可用于植物接触形态发生的表型组学研究。此外，触摸材料（如人发）可替换为其他天然材料，例如动物毛发、丝线和棉纤维。该装置上的自动化移动臂还可配备喷水喷嘴和吹风装置，分别模拟自然条件下的雨滴和风力。通过将这种自动毛发触发力加载装置与手动棉签触摸相结合，我们研究了两个力信号突变体MAP KINASE KINASE 1（MKK1）和MKK2植株的触碰响应。对施加触发力后的野生型植株及两种突变体的表型组进行了统计学评估，结果显示它们在触碰响应方面表现出显著差异。
引言
植物感震形态建成（thigmomorphogenesis）这一术语由 Jaffe, MJ 于1973年提出1。它属于植物向性运动的一种，但不同于由阳光或重力刺激引起的常见向光性或向重力性2,3。该过程描述了植物在周期性机械刺激下发生的表型变化，此类现象早先已被植物学家多次观察到4,5。雨滴、风力、植物、动物和人类的接触，甚至动物啃咬，均被视为可触发植物中力信号传导的不同类型机械刺激4,5。植物感震形态建成的特征包括抽薹延迟、草本植物茎秆变短、莲座叶或叶片尺寸减小，以及木本植物茎秆增粗6,7,8。这与含羞草（Mimosa）或其他对机械刺激敏感的藤本植物中常见的感震运动（thigmonastic）或向触性（thigmotropic）反应不同，后者的快速触碰反应更容易被观察到1,9,10。相比之下，由于感震形态建成表现为缓慢的生长响应，因此较难被察觉。通常需要持续数周甚至数年的力学加载刺激后才能观察到该现象。这种独特的植物触觉响应特性使得利用人工手触刺激进行正向遗传筛选，以稳定分离出对触发力信号不敏感的突变体变得十分困难。
阐明力信号转导通路及触形态发生背后的分子机制6,11，过去已进行过分子与细胞生物学实验6,12,13,14这些研究提出，植物的力学信号受体主要由机械敏感性离子通道（MSC）以及由跨膜蛋白多聚复合物组成的锚定型MSC复合物构成。11,14,15细胞质中的Ca2+ 初始接触后数秒内产生的瞬时电信号。风、雨或重力刺激可能与下游的钙传感器相互作用，将力学信号转导为细胞核事件14,16,17,18除了分子和细胞水平的研究外，通过人工手指触碰植物的正向遗传筛选发现，植物激素和次生代谢物参与了触碰力加载后触碰诱导型（TCH）基因的表达13,19例如， aos 和 opr320 迄今为止，遗传学研究已鉴定出一些突变体。然而，正向遗传学在触感形态建成研究中应用的主要问题，仍是定量测定大量遗传突变个体植株的触碰反应水平以及对这些植株进行人工触碰所耗费的大量人力。基于手工触碰的突变体筛选同样存在耗时费力的问题。14,20例如，完成一轮触力刺激需要对单株植物以每秒一次的频率触摸30至60次。为了获得足够数量的植株用于统计学表型分析，通常需要20至50株相同基因型的个体植株进行触力加载处理。这意味着操作者需对选定的某一基因型植株重复执行600至3,000次触摸。此类触摸通常每天需重复3至5轮，相当于每基因型植株每日需进行约1,800至15,000次手指或棉签触碰。通常需要经过良好训练的操作者，在一天内多次重复过程中持续保持每次触摸的力度和强度处于理想范围内，以避免力度差异过大。众所周知，感触形态发生是一种可饱和且剂量依赖的过程。6,21，触碰力度/强度对于成功触发植物的触碰反应至关重要。
为了消除人为触发力加载的个体依赖性，并将机械施加力控制在可接受的误差范围内14，我们设计了一种自动触发力加载装置，以取代手工操作的触摸方式。该装置配备四个可移动臂，每个臂上安装有一把人发毛刷。此版本命名为K1型，以突出其采用人发进行触发力加载的特点。若使用一台设备对四种基因型植株的感震形态建成或触碰反应进行定量测量，每种基因型可测量40至48株个体。每轮触碰重复操作（每株植物触碰少于60次）通过可调节移动速度的机械臂在5分钟内完成。因此，K1型触碰装置上的植物每天可接受多轮机械刺激，刺激可按照初始编程设定，采用恒定的触发力加载或不同强度水平进行。
Arabidopsis thaliana 作为一种模式植物，因此被选为测试全自动触毛力加载装置应用的目标植物物种。由于可获取多种突变体种质资源的大型种子库，且拟南芥开花时植株大小适合安装 K1 型触碰装置的培养架空间，因此非常适合本实验条件。
Model K1 自动触碰装置由三个主要部件组成：（1）由两个皮带驱动的线性执行器构成的 H 形金属支架，（2）装有毛刷的机械金属臂，以及（3）控制器。对于定制的 Model K1 触碰装置，每个 X/Y 轴模块均由一个皮带驱动的导轨、两个滑块（红色）和一个 57 步进电机（预安装且可拆卸）组成（图 1A，B）。上方的水平执行器使机械金属臂能够水平左右移动，下方的垂直皮带驱动线性执行器使机械金属臂能够垂直上下移动（图 1B，图 2A）。在垂直执行器上安装了四个可拆卸的机械臂（图 1C，图 2B）。四把人毛刷分别固定在四个机械臂上（图 1C，图 2B）。构建 Model K1 触碰装置的所有机械部件在下文以粗体字体标出，并在图 1C中进行了标注（另见材料表）。
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方案
1. 种子准备
注意：所使用的野生型（Col-0）以及 mkk1 和 mkk2 功能缺失突变体的拟南芥种子均购自拟南芥生物资源中心（ABRC，https://www.arabidopsis.org，美国俄亥俄州哥伦布市）。
- 计算每种基因型需要使用的植物个体数量，以确保统计分析的可靠性。根据每个品系的发芽率，准备足够数量的种子，通常为实验所需数量的4-5倍。确保能够获得足够数量的健康且大小均一的植株用于触觉反应检测。根据本方案，每种基因型通常使用300-500粒种子，以获得80-90株大小相近的植株。
- 将种子浸入冷水中，并在4 °C条件下避光（用铝箔包裹）放置，以促进吸胀。吸胀处理5-7天后播种。
2. 植物生长
- 选择适合植物生长的土壤（参见材料表）。避免使用大块土团，并将其均匀混合。
- 准备24个塑料杯：每个杯子的容积为207 mL，上口直径为7.4 cm。在每个杯子底部钻三个圆形小孔，用于灌溉。
- 将混合好的土壤填入这些塑料杯中。使土壤堆积高度高出杯口1–2 cm，然后轻轻抚平土壤表面。
- 将24个杯子放入一个塑料托盘中（21英寸 × 10.8英寸 × 2.5英寸），并将托盘置于恒定光照条件下（见下文）。
- 在播种前两小时，向每个托盘中加入2.5 L水。让土壤通过杯底的小孔吸收水分，并等待土壤表面下降至与杯口齐平。
- 在每个杯子内选择4个均匀分布的位置，每个位置播种3–4粒种子。
- 在每个托盘上方覆盖一个透明塑料盖，使种子在其中萌发一周。随后移除塑料盖，让幼苗继续生长一周。
- 在播种后9–10天，通过间苗去除多余的植株，每杯保留4株大小相近的个体植株。
- 种子萌发后，每隔一天用1.5 L水灌溉一次。
3. 生长条件
- 将生长室的温度设置为 23.5 ± 1.5 °C，湿度设置在 35% 至 45% 之间。
- 将光照强度设置在 180 至 240 μE∙m-2∙s-1（使用国际光照公司 IL 1700 研究用辐射计测量）14。光合有效辐射为 90 至 120 μE∙m-2∙s-1。
- 设置光照条件为 24 小时持续光照。
4. 触发力加载装置的构建
注意：该机器人造毛发触发力加载装置（型号 K1）旨在用于触发力信号突变体筛选和植物触形态发生研究（图 1，图 2）。
- 预安装模块（可拆卸， 图1C)
- 安装两个 切片块 （I） 以及一个 57 步进电机 (II) 到 X/Y 轴导轨模块上 (III/V).
- 安装两个 切片块（I） 到X/Y轴辅助梁上 (IV/VI).
- 其他机械部件的安装（图1C)
- 固定X轴导轨模块 （III） 和X轴辅助梁 (IV) 通过组装两块连接板将其连接在一起 （七） 导轨的两端。
- 固定 Y 轴导轨模块 (V) 置于两个载玻片的背面 （横轴） 通过组装两块连接板，使其呈交叉位置 （VIII） 在两者之间。
- 固定Y轴辅助梁 （VI） 到另外两个载玻片的背面 （x轴） 以交叉位置组装两块连接板 （VIII） 在两者之间。
- 组装机械臂支架 （IX） 到两个载玻片的前面 （纵轴） 交叉位置，使用连接板（图2A).
- 组装4把毛刷 (X) 到机器人手臂上 （IX） 用夹子（图2B).
5. 触发力加载装置设置
注意：在控制面板中设置 Model K1 触控机的所有控制参数（如下方加粗字体所示）均显示在图 2F中。
- 将触碰毛刷安装到机械臂上。使用一根330 mm长的钢尺作为固定支架，均匀固定一层人类毛发（每刷3,600–4,600根毛发）。毛发长度为126 mm（图1C）。
- 用两个金属夹将钢尺固定在机械臂上。
- 首先设置机械臂在垂直方向（Y轴）的高度。按Jog F+升高机械臂和毛刷，按Jog R-降低机械臂和毛刷，使毛刷尖端低于杯口边缘0.5 cm。按下ZERO set按钮归零。在正式实验前预运行1–2个周期，确保所有植株均能被触碰。在整个触碰实验期间，每天需调整并校准毛刷及毛发尖端，使其保持在同一高度。
- 使用电子天平测量触碰力（垂直载荷），并将触碰力维持在1–2 mN14。
- 手动设置机械臂在水平方向（X轴）的起始位置。使毛刷悬挂在每个托盘边缘，确保触碰实验开始前无植株被触碰。按Jog F+/Jog R-逐步水平移动机械臂，以设定起始位置。
- 按下Travel按钮，将毛刷在水平方向（X轴）的移动距离设为365 mm。按Inc. F+/Inc. R-移动机械臂，确保达到完整行程，并保证在整次触碰实验过程中所有处理植株均能被触碰。
- 按下Auto Speed按钮，将机械臂在X轴方向的移动速度设为5,000 mm/min。在整个触碰实验过程中保持相同移动速度。
- 按下Minor Cycle按钮，将触碰次数设为20次。在整个触碰实验过程中，每轮保持相同的触碰次数。
注：一个Minor Cycle等于两次Travel距离，即机械臂从起始位置移动至终点位置，再返回起始位置。一个Minor Cycle产生两次触碰。20次试验中共触碰植株40次（2次触碰 × 20次试验 = 40次触碰）。将40次触碰定义为一轮触碰力加载。 - 按下Major Period按钮，将每轮触碰的重复间隔设为每天480分钟。在整个触碰实验过程中保持相同的触碰轮次频率。
注：此设置使毛刷每天对植株进行3轮触碰，每轮间隔480分钟（8小时）。显示的蓝色数字表示每轮触碰的间隔时间。当倒计时（红色数字）归零时，机器将自动开始新一轮触碰。 - 将Major Cycle设为12次，表示机器将在4天内自动完成12轮触碰。该设置用于避免因人为疏忽而遗漏某天的触碰操作。
- 按下start按钮，启动预设程序。Model K1触碰装置将根据设定自动执行触碰力加载。
6. 生理数据的采集与分析
- 抽薹天数：在触碰实验中，分别记录每株植物的抽薹日期。抽薹是植物从营养生长期转入生殖生长期的标志。在拟南芥中，抽薹日定义为植株的第一花序茎长度达到1 cm所需的天数。
注意：在上述生长条件下，野生型植株通常在播种后19至23天开始抽薹，于28至32天结束。 - 莲座叶半径：测量从莲座中心到最长叶片尖端的距离。
- 从正上方拍摄整个托盘的照片，分别拍摄对照组和触碰处理组的照片。
- 下载合适的软件，例如免费软件 ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/download.html）。
- 打开照片文件，使用缩放功能将图像调整至合适大小。
- 选择 直线（Straight） 工具，在莲座中心与最长叶片尖端之间画一条直线，以测量莲座叶半径。
- 选择一株植物，按住鼠标左键，从莲座中心向最长叶片尖端画一条直线。
- 选择 分析-测量（Analyze-Measure） 功能，或按下 Ctrl + M，以分析该直线的距离。
- 选择一个培养杯，重复前两个步骤，同时测量每个塑料杯的直径，并利用这些数据进行校正计算，以消除拍照过程中可能产生的偏差。
注意：计算公式为：
Ra/Da = Rm/Dm
（Ra，植株实际莲座叶半径；Da，塑料杯的实际直径；Rm，通过软件测得的同一植株的莲座叶半径；Dm，用于培养该植株的塑料杯的测量直径）
- 莲座叶面积：测量莲座叶的水平二维表面积。
- 去除花序，同时不干扰其余莲座器官。
- 从上方拍摄每株植物的照片，同时在附近放置标尺。
- 使用 ImageJ 的一个免费插件 Rosette Tracker，并遵循先前发表的实验方案22。
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结果
自动毛刷触力加载装置
为了观察植物形态变化，可重复的生长条件和处理方法是获得可重复结果的关键。本研究通过新构建的毛刷触力加载装置（型号K1）实现了高通量、自动化的触力信号突变体筛选（图1，图2）。该装置的毛刷可同时接触最多4个植物培养托盘。每个托盘放置24个育苗杯，每组使用12个育苗杯的植株，分别作为对照组和处理组（图2C,D）。每个育苗杯种植4株植物，同一毛刷可接触48株或更少的植株个体，以确保后续统计分析有足够的样本量。一台型号K1触力装置可同时对最多4种基因型的植物进行触力处理。其中关键的一点是触力装置机械臂/毛刷高度的设定，因为感震形态建成具有剂量依赖性6,21。毛刷相对于植株莲座叶位置的不同高度会产生不同的触力，可能导致完全不同的感震形态建成结果。在本实验中，...
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讨论
接触形态发生（thigmomorphogenesis）是植物对机械扰动产生的一种复杂生长反应，涉及细胞信号网络及植物激素的作用，是植物为适应不利环境条件而进化出的适应性结果25,26。在以往的接触形态发生研究中，通常选择机械接触方式，特别是人类手指接触和手持棉签接触，以研究此类形态变化14,20。这种简化的触发力加载方式更易于控制和实施。此外，此类触发力加载方法在一定程度上可模拟自然环境中风力和雨滴刺激所产生的力信号19。触发力能够引发钙离子振荡，诱导蛋白质磷酸化14，并激活介导接触反应的下游基因表达19。类似地，安装在自动移动臂上的人类毛发刷也可通过模拟人工手动接触来诱导植物接触反应。为进一步丰富施力方式，还可将喷水喷嘴和/或吹风机安装于机器的机械臂上，用于开展...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到以下基金资助：31370315、31570187、31870231（国家自然科学基金）、16100318、661613、16101114、16103615、16103817、AoE/M-403/16（香港研究资助局）。作者谨此感谢居丰精密自动化科技有限公司（中国深圳）提供 图1 中展示的若干示意图。
作者还要感谢 S. K. Cheung 和 W. C. Lee 在触力加载装置开发过程中所做的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4 把毛刷 | 定制 | ||
| 带一个夹持器的 4 个机械臂 | 定制 | 1000 mm 长的夹持器和 560 mm 长的机械臂 | |
| 57 步进电机 | 57HS22-A | ||
| 通用型盆栽土 | Plantmate，中国香港 | ||
| 拟南芥植物种子 | 拟南芥生物资源中心，美国俄亥俄州哥伦布市 | 用于购买拟南芥种子 | |
| BIO-MIX 盆栽基质 | Jiffy Products International BV，荷兰 | 1000682050 | 将两种土壤混合用于拟南芥种植，通用型盆栽土与 BIO-MIX 的混合比例为 1:2 |
| IL 1700 研究用辐射计 | International Light，美国马萨诸塞州纽伯里波特 | 可测量全波长光强和光合有效辐射强度 | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | 可免费下载的软件 | |
| 巨丰精密与自动化科技有限公司 | 中国深圳 | 用于购买同步带驱动的直线执行器及其他机械模块 | |
| 滑块连接板 | 用于将 Y 轴导轨模块或 Y 轴辅助梁固定在滑块背面 | ||
| X 轴模块连接板 | 定制 | 用于连接 X 轴导轨模块和 X 轴辅助梁 | |
| 滑块 | |||
| WDT4045 X 轴导轨模块 | 843 mm，定制 | 预装有两个滑块和一个 57 步进电机 | |
| WDT4045 Y 轴导轨模块 | 1038 mm，定制 | 预装有两个滑块和一个 57 步进电机 | |
| X 轴辅助梁 | 843 mm，定制 | 预装有两个滑块 | |
| Y 轴辅助梁 | 1038 mm，定制 | 预装有两个滑块 |
参考文献
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