通过无节制的乳腺造影获得衰老小鼠呼吸模式的方法

摘要

无节制的大气胸膜术用于量化清醒小鼠的呼吸模式。我们显示，在标准化协议下，15 个片段显示的值与延长的安静呼吸持续时间相似。这种方法还允许在造型室的第一个小时内量化呼吸暂停和增强呼吸。

摘要

无节制的大气胸膜（UBP）是一种量化小鼠呼吸模式的方法，经常报告小鼠的呼吸频率、潮汐体积和分钟通气。此外，还可以收集有关呼吸的神经输出的信息，包括中央呼吸暂停和增强呼吸的存在。UBP 的一个重要考虑因素是获得一个呼吸段，对焦虑或主动行为的影响最小，以阐明对呼吸挑战的反应。在这里，我们提出了一个协议，允许在老年小鼠中获得短而安静的基线，相当于等待更长的安静呼吸。使用较短的时间段是有价值的，因为一些小鼠菌株可能越来越兴奋或焦虑，并且较长的安静呼吸时间可能无法在合理的时间范围内实现。我们在UBP室放置了22个月大的小鼠，并将4个15分钟的安静呼吸段在60-120分钟之间与长达10分钟的安静呼吸周期进行了比较，这些呼吸时间需要2~3小时才能获得。在30分钟的熟悉期之后，我们还获得了在静默呼吸段之前的中枢呼吸暂停和增强呼吸计数。我们表明，10分钟的安静呼吸相当于使用更短的15秒的持续时间。此外，导致这15个安静呼吸段的时间可用于收集有关中心来源的呼吸暂停的数据。该协议允许调查人员在一定时间内收集呼吸模式数据，并使小鼠的安静基线测量成为可能，这些小鼠的兴奋行为可能会增加。UBP 方法本身提供了一种收集呼吸模式数据的有用和非侵入性方法，并允许在多个时间点对小鼠进行测试。

引言

^,UBP是评估呼吸模式^{1、2、3、42,3}的常用技术。¹⁴在这种方法中，小鼠被放置在一个封闭的腔室中，其中主室（动物所在的位置）和参考室之间的压力差异通过肺气管仪进行过滤，以获得值。由此产生的UBP设置是非侵入性和无拘无束的，并允许在不需要麻醉或手术的情况下评估呼吸措施。此外，该技术适用于需要随着时间的推移在同一鼠标中进行多次测量的研究。在单个试验或多次试验中，可以使用此方法量化呼吸频率、潮汐体积和分钟通气等变量。全身UBP还提供峰值流量和呼吸周期持续时间的测量。这些参数一起量化了呼吸模式。记录的呼吸痕迹还使得可以查看数据并计算给定时间段内显示的中央呼吸暂停数。此计数可用于分析潮汐体积和吸气时间，以测量呼吸模式的其他变化。

虽然存在几种非侵入性胸膜技术，用于直接评估肺生理参数，但全身UBP允许一种以最小的过度压力筛选呼吸功能的方法。头出胸膜，它利用潮汐中流测量，也是非侵入性的，依赖于约束，像许多其他类型的胸膜术（例如，双室胸膜）。虽然这些方法已用于啮齿动物模型测量气道响应^能力5，使用颈领或小约束管可能会使小鼠（与其他物种）更长的时间适应，并返回到休息水平。

获得最佳空气呼吸段是基线比较的重要考虑因素。随着商业上可用胸膜系统的使用增加，许多实验室都能够收集呼吸模式数据。重要的是，在整个收集期间，呼吸模式是可变的，尤其是对于小鼠。话虽如此，有必要将基线分析标准化，作为确保实验者培训水平不混淆结果的手段。收集空气呼吸段的方法有很多种，作为实验设计之间的一个变化区域。一个例子包括根据之前定义的一组时间在室¹中平均最后10-30分钟的数据，而另一种方法包括等待鼠标明显平静5~10分钟^6。后者可能需要 2⁄3 小时才能实现，在某些情况下，如果鼠标不够平静，则可能需要放弃试验。这种担心是观察行为更焦虑^和兴奋的小鼠菌株的一个特别重要的考虑因素。这些小鼠可能需要更长的时间来适应腔室环境，并且只保持平静的时间很短。限制用于基线收集的时间会标准化每个鼠标的室时间。

实验者获得适当的基线，包括鼠标中的静止行为值，但也及时发生，这一点至关重要。因此，本报告的目的是提供用于获取小鼠呼吸参数的短静基线值的方法的描述。此外，我们报告说，呼吸暂停和增强呼吸可以在室内的第一个小时量化。

方案

所有程序都得到勒莫恩学院机构动物护理和使用委员会的批准。所有使用动物都符合《实验室动物护理和使用指南^》8中所述的政策。

注:（关键）在实验前，获得动物使用所需的所有批准和培训。重要的是，实验者熟悉小鼠的行为和活动水平，包括睡眠、窘迫和/或运动伪影与正常嗅探和呼吸的迹象。

1. 全身胸腔室

1. 阅读大气测量胸膜室（包括连接器、O 形环等）的相应用户手册，并创建标准协议文件以定义分析器（例如代谢）和特定于软件的参数。
2. 确保所有软管和管都连接到造型室。将气体流管（流入）和真空管（流出）直接连接到大气测量胸膜室。
   注:流入必须连接到开口标记偏置流。
3. 将 CO_2、O2和 N₂气体罐连接到气体混合器。在试验之前，请确保所有储气罐都处于打开位置。

2. 大气胸腔室的校准

1. 通过在大气测量胸膜软件的硬件选项卡下选择7700-放大器设置，校准高流量和低气流。
2. 设置适合实验设计和气体分析仪（±0.1升/分钟）的真空（从腔室流出）。
   注:在整个校准和实验中，流出率必须保持不变，以便进行准确的代谢记录。
3. 通过从造型室中取出流管并关闭真空来设置低气流的空气流量。
4. 通过将0输入到相应腔室的低单位单元格中来记录零流量。双击低卡路里单元格，将时间更改为 3 s，然后点击"度量"。
5. 重新连接流管，让气体（20.93% O_2，平衡_N2）从气体混合器流经大气混合器的大气胸膜室。
6. 将从升/分钟到毫升/秒的流入转换为毫升/秒。单击相应腔室的"高单位"单元格，以毫升/秒为单位输入值。双击高 Cal，将时间更改为 3 s，然后单击"度量 "。
7. 保持7700-放大器设置选项卡打开，以校准代谢分析仪到大气胸膜扫描软件。

3. 代谢分析仪校准

1. 在气体混合器方案中，设置气体混合器释放含有20.93%O₂和79.07%N2的气体流₂。
2. 在代谢分析仪上，将 O₂校准级别设置为 20.93%，CO₂设置为 0%。输入相应值后，将拨号回采样。
3. 设置高 O₂百分比。单击大气测量胸腔扫描软件的ABCD-4选项卡，然后在 C2 线高单元下输入20.93。在高卡下，将时间更改为 3 s 并命中测量。
4. 设置较低的 CO₂百分比。在 C3 线的"低 Cal"下输入0，然后将时间更改为 3 s，然后单击"低 Cal" 下的度量。
5. 在气体混合器程序中，将 O₂值更改为 10%，将 CO₂值更改为 5%。等待几分钟，气体流量以调整到这些值。在代谢分析仪上，转动调节旋钮以校准等于 5% 的 CO_2。校准值后，请务必将拨号转回采样。
6. 设置高 CO₂百分比。在大气测量胸膜扫描软件上将适当的值插入 O₂和 CO₂之前，确保分析仪读数稳定。单击 C3 下的"高单位"并输入5。将高卡更改为 3 s 并命中度量。
7. 设置低 O₂百分比。单击 C2 选项下的"低单位"并输入10。单击"低 Cal"，输入 3，然后单击"度量"。
8. 将气体混合器上的气体值更改回 20.93% O₂和 79.07% N₂。等待几分钟，让造型室调整到这些值。如果代谢分析仪未自动读取 20.93% O₂和 0% CO_2，请重复步骤 3.1_u20123.7，以确保正确校准。定期通过认证的储气罐确认适当的校准。
9. 重新检查连接到大气胸膜室的流量计。调整进出腔室的空气流量，以适合实验的速率（通常为 0.1~0.3 升/分钟）。
10. 将所有设置应用于大气测量胸膜扫描软件后，单击"确定"开始录制。

4. 无节制胸腔

1. 记录鼠标的重量和初始体温。等待 10 分钟，然后将鼠标放入造型室，从空腔室收集 O₂和 CO₂数据。在老鼠熟悉的安静区域工作，因此噪音和气味不会干扰数据收集。避免任何可能的中断，包括门的打开和关闭或人员进出数据收集室。
   注:这一特定协议使用了22个月大的雄性C57BL/6J鼠标。
2. 在第一个小时内，记录鼠标的行为并记录详细的笔记，包括流入/流出腔室的特定值。
3. 60分钟后，注意以下60分钟的安静呼吸段。列出任何长度至少15秒的片段，无需嗅觉和梳理。使用植入式设备时，每 10 分钟测量一次体温。
4. 实验结束时，将鼠标从腔室中取出，放回笼子中。所有设备都应彻底清洁和擦拭。如果水滴仍然存在，请使用加压空气将其移除。

5. 呼吸和代谢模式分析

1. 打开大气胸膜检查文件，并查阅感兴趣的动物的记录。
2. 打开软件中的代谢面板，取取 O₂和 CO₂的前 10 分钟平均值，当腔室为空时。将这些值记录为 FiO₂和 FiCO₂。
3. 查看大气胸膜扫描软件的"流动"面板。右键单击"分析属性"并设置适当的参数。在Meta 1选项卡下，从步骤 5.2 输入 FiO₂和 FiCO_2，以及流入 Meta 2下的腔室，以计算 VO₂和 VCO₂。
4. 对于呼吸分析模式，使用动物行为和流板跟踪的注释确认 15 秒安静呼吸的时间。从"数据分析器"选项卡输入"打开数据分析器对话"下 15 秒的安静呼吸间隔的时间。单击"分析器视图模式"仅显示特定 15 秒感兴趣的片段。
5. 单击"保存已分析的派生数据"。打开电子表格中的数据文件以获取装箱数据。

6. 呼吸与增强呼吸分析

1. 在打开的审阅文件中，退出分析器视图模式。转到"设置+gt; P3 设置"下的图形设置选项，并在"类型"下选择页面视图。为窗格数选择5。将-2输入标记为"低"的框中，将2输入标记为"高"的包装盒中，以毫升/秒为单位进行流量测量。应用更改。
2. 滚动到流跟踪面板上的 30 分钟标记。
3. 在将鼠标放入室后 30-60 分钟内数出呼吸暂停和增强的呼吸。量化持续超过或等于0.5s的暂停呼吸周期，表示呼吸暂停。增强的呼吸是由呼吸痕迹急剧上升超过1.25 mL/s，然后急剧下降低于-0.75 mL/s。

结果

报告UBP的结果是评估在正常空气气体下进行的16岁（22个月大）小鼠的呼吸模式（20.93%O_2，平衡_N2）。分析首先包括将长 10 分钟的安静呼吸段（需要 2 小时以上才能获得）与 4 个短 15 秒段（在 60–120 分钟内量化）的平均值进行比较。图1A提供了具有代表性的静呼吸流量跟踪，其中呼吸与无活动呼吸行为一致。当从动物身上收集类似的追踪时，软件应该接受100%的呼吸。然而，图 1B表示从更活跃的部分呼吸，其中小鼠正在探索腔室、嗅探和/或梳理。与图 1B所示类似的跟踪不太可能被软件接受，并且对于此方法使用和解释的呼吸收集类型并不适合。用于评估两个时间点之间可能的呼吸模式差异的参数是呼吸频率（图 2A）、潮汐量 （V...

讨论

该协议提供有关小鼠安静呼吸基线的信息，以及收集有关中央呼吸暂停和增强呼吸的数据。代表性的结果显示，与一群老老鼠平均4个15秒的呼吸模式相比，10分钟的安静基线具有相似的呼吸模式。重要的是，15回合在统计上没有区别，这些组也没有差异的变化，使用Levene的测试。这些数据表明，即使是短暂的回合也足以监测安静的呼吸。然而，完全有可能，在15秒和10分钟时分析小鼠体内的个体变异可能会导致不同的发现，因为10分钟的回合可能包括最小的嗅探和梳理活动。但是，使用 Levene 的测试比较单个鼠标基线段可提供不同于该协议中描述的分析。总体而言，此方法的设计使用 15 秒的呼吸段，可在室内 60-120 分钟内获取，而必须等待每只鼠标实现更长的安静基线持续时间。

基线所需的较短持续时间允许对更多焦虑/激动的小鼠菌株进行静呼吸测试。使用较长的呼吸段（即10或2分钟）延长了协议持续时间，如果小鼠在3小时内没有显示安静的呼吸痕迹，可能需要放弃试验。由于许多实验设计也包含呼吸挑战（即缺氧），分配给其他气体的延长时间突出表明基线收集时间需要标准化。使用一次15s的安静呼吸有助于缓解与小鼠（和小鼠菌株）一起工...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二氧化碳分析仪	AEI Technologies	CD-3A
二氧化碳传感器	AEI Technologies	P-61B
计算机			必须符合 Ponemah 要求
Drierite 珠子	PermaPure LLC	DM-AR
流量控制	AEI Technologies	R-1	真空
流量计	TSI	4100	每个腔室需要一个，一个用于真空
气体混配器	MCQ 仪器	GB-103
气体罐	100		% 氧气、100% 二氧化碳、100% 氮气 - 食品级或预混合罐，用于普通室内空气和气体挑战
氧气分析仪	AEI Technologies	S-3A
氧气传感器	AEI Technologies	N-22M
聚氨酯管	SMC	TUS 0604 Y-20
Ponemah 软件	DSI
小型啮齿动物室	Buxco/DSI
温度计（LifeChip 系统）	Destron-担心		任何类型的温度计来测量准确的体温都是合适的，但使用植入式芯片可以最大限度地减少对动物的干扰当动物仍在 UBP 室中时进行多次体温测量
传感器	Validyne	DP45	每个腔室需要一个
全身体积脉搏波系统	Data Science International （DSI）		包括 ACQ-7700、压力/温度探头等。