非约束性容积描记法用于量化清醒小鼠的呼吸模式。我们发现，在标准化方案下，15秒时间段的测量值与较长时间的安静呼吸阶段具有相似的结果。该方法还可用于量化小鼠进入测量舱后第一小时内发生的呼吸暂停和深大呼吸。
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摘要
摘要
非限制性容积描记法（UBP）是一种用于量化小鼠呼吸模式的方法，常规报告呼吸频率、潮气量和每分钟通气量。此外，还可收集有关呼吸神经输出的信息，包括中枢性呼吸暂停和增强呼吸的存在情况。进行UBP时一个重要考虑因素是获取受焦虑或活动行为影响最小的呼吸片段，以明确对呼吸挑战的反应。本文介绍了一种可在老年小鼠中获得短暂而安静的基础呼吸状态的实验方案，其效果可与等待较长时间的安静呼吸相媲美。采用较短时间片段具有重要价值，因为某些品系的小鼠可能更容易兴奋或焦虑，在合理的时间范围内难以实现长时间的安静呼吸。我们将22月龄的小鼠置于UBP舱内，比较了在第60至120分钟期间获取的四个15秒安静呼吸片段与一个耗时 2–3小时获得的10分钟安静呼吸时段的数据。同时，在30分钟适应期后、安静呼吸片段开始前，我们还记录了中枢性呼吸暂停和增强呼吸的发生次数。结果显示，10分钟的安静呼吸与使用短得多的15秒时段所获得的数据具有可比性。此外，这些15秒安静呼吸片段之前的时间段也可用于收集关于中枢性呼吸暂停的数据。本方案使研究人员能够在固定时间内采集呼吸模式数据，并使得对可能表现出更多兴奋行为的小鼠进行安静基础状态测量成为可行。UBP方法本身提供了一种有用且无创的方式用于采集呼吸模式数据，并允许对同一批小鼠在多个时间点进行重复测试。
引言
无创双腔法（UBP）是一种常用于评估呼吸模式的技术1,2,3,4。该方法将小鼠置于一个密闭的容器中，主腔室（容纳动物）与参考腔室之间的压力差通过流量计进行过滤，从而获得测量值。由此建立的UBP系统具有无创、无需束缚的优点，可在无需麻醉或手术的情况下实现呼吸参数的检测。此外，该技术适用于需要对同一只小鼠在不同时间点进行多次测量的研究。通过该方法，可在单次实验或多次实验中定量分析呼吸频率、潮气量和每分钟通气量等变量。全身体积描记UBP还可提供峰值流速和呼吸周期持续时间的测量数据。这些参数共同表征了呼吸模式的特征。记录的呼吸曲线还可用于回溯数据分析，并统计特定时间段内出现的中枢性呼吸暂停次数。该计数结果可结合潮气量和吸气时间的分析，用于评估呼吸模式的其他改变。
尽管已有多种非侵入性体积描记技术可用于直接评估肺部生理参数，但整体身体非限制性体积描记法（UBP）能够在对小鼠造成最小不必要应激的情况下，实现对呼吸功能的筛查。头部分离式体积描记法也是一种非侵入性方法，利用潮气期中呼气流量指标进行测量，但与其他多种体积描记法（例如双腔体积描记法）一样，需要对动物进行束缚。尽管这些方法已被用于啮齿类动物模型中气道反应性的测定
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方案
所有实验程序均经 Le Moyne 学院机构动物护理与使用委员会批准。所有动物使用均符合《实验动物护理与使用指南》中所述政策8。
注意：（关键）实验前，必须获得动物使用所需的所有必要批准并完成相关培训。实验人员应熟悉小鼠的行为和活动水平，包括睡眠、痛苦和/或运动伪影与正常嗅探及呼吸的区分。
1. 全身体积描记法舱
- 阅读容积描记法测量舱的相应用户手册，包括连接器、O型圈等部件，并创建标准操作规程文件，以在软件中定义分析仪（如代谢分析仪）及相关参数。
- 确保所有软管和管道已连接至测量舱。将一条气体流入管（进气管）和一条真空管（出气管）直接连接到容积描记法测量舱。
注意：进气管必须连接至标记为 bias flow 的接口。 - 将CO2、O2和N2气瓶连接至气体混合器。实验前确保所有气瓶均处于开启状态。
2. 体积描记仪气压腔的校准
- 通过选择高流量和低流量气体进行校准 7700-放大器设置 在……之下
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结果
报告了在正常空气气体环境（20.93% O2，其余为N2）下对16只老年（22月龄）小鼠进行无创性整体体积描记法（UBP）评估呼吸模式的结果。分析首先比较了一个较长的10分钟安静呼吸片段（获取该片段耗时超过2小时）与四个较短的15秒片段的平均值（量化时间为第60至120分钟之间）。图1A提供了典型的安静呼吸流量轨迹，其中呼吸稳定，无主动呼吸行为。当从动物收集到类似的轨迹时，软件应接受100%的呼吸周期。然而，图1B代表了一个更活跃阶段的呼吸，此时小鼠正在探索箱体、嗅闻和/或理毛。类似于图1B所示的轨迹较难被软件完全接受，因此不适合本方法所采用和解释的呼吸数据采集类型。为评估两个时间点之间可能存在的呼吸模式差异，所选参数包括呼吸频率（图2A
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讨论
该方案提供了关于小鼠安静呼吸基线的信息，以及中枢性呼吸暂停和增强呼吸的数据采集方法。代表性结果表明，老年小鼠群体的10分钟安静基线呼吸模式与四次15秒片段的平均值相似。重要的是，这些15秒片段之间在统计学上无显著差异，且使用Levene检验发现这些组之间的变异程度亦无差异。这些数据表明，即使单次短暂的记录也足以用于监测安静呼吸。然而，也有可能在单只小鼠内比较15秒与10分钟时间段的个体变异时会得出不同的结果，因为10分钟片段可能包含少量嗅探和理毛活动。但使用Levene检验对单只小鼠的基线片段进行比较，其分析方法不同于本方案中所描述的方法。总体而言，本方法的设计采用在放入呼吸室后60至120分钟期间获取的15秒呼吸片段，而无需等待每只小鼠达到更长时间的安静基线状态。
较短的基线采集时间使得能够对更易焦虑或躁动的小鼠品系进行安静呼吸的检测。若采用较长的呼吸片段（例如10分钟或2分钟），会延长实验流程，可能导致在3小时内小鼠未能表现出安静呼吸曲线时不得不中止试验。由于许多实验设计还需包含呼吸挑战（例如低氧），为其他气体测试预留的额外时间进一步凸显了基线采集时间标准化的重要性。采用单次1.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Angela Le、Sarah Ruby和Marisa Mickey在维持动物种群方面所做的工作。本研究由1R15 HD076379（L.R.D.）、3R15 HD076379（L.R.D.资助CNR）以及McDevitt自然科学本科生研究奖学金（BEE）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二氧化碳分析仪 | AEI Technologies | CD-3A | |
| 二氧化碳传感器 | AEI Technologies | P-61B | |
| 计算机 | 必须符合 Ponemah 软件的要求 | ||
| 干燥剂珠（Drierite） | PermaPure LLC | DM-AR | |
| 流量控制装置 | AEI Technologies | R-1 | 真空用 |
| 流量计 | TSI | 4100 | 每个腔室需配备一个，另需一个用于真空系统 |
| 气体混合器 | MCQ Instruments | GB-103 | |
| 气体钢瓶 | Haun | 100% 氧气、100% 二氧化碳、100% 氮气——食品级，或预先混合的室内空气及实验用气体钢瓶 | |
| 氧气分析仪 | AEI Technologies | S-3A | |
| 氧气传感器 | AEI Technologies | N-22M | |
| 聚氨酯管路 | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah 软件 | DSI | ||
| 小型啮齿类动物腔室 | Buxco/DSI | ||
| 体温计（LifeChip 系统） | Destron-Fearing | 任何可准确测量体温的体温计均可使用，但植入式芯片可在动物仍处于全身体积描记腔室（UBP chamber）中时多次测量体温，且对动物干扰最小 | |
| 换能器 | Validyne | DP45 | 每个腔室需配备一个 |
| 全身体积描记系统 | Data Science International (DSI) | 包含 ACQ-7700、压力/温度探头等 |
参考文献
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al.
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重印与许可
