非约束性容积描记法用于量化清醒小鼠的呼吸模式。我们发现，在标准化方案下，15秒时间段的测量值与较长时间的安静呼吸阶段具有相似的结果。该方法还可用于量化小鼠进入测量舱后第一小时内发生的呼吸暂停和深大呼吸。
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摘要
摘要
非限制性容积描记法（UBP）是一种用于量化小鼠呼吸模式的方法，常规报告呼吸频率、潮气量和每分钟通气量。此外，还可收集有关呼吸神经输出的信息，包括中枢性呼吸暂停和增强呼吸的存在情况。进行UBP时一个重要考虑因素是获取受焦虑或活动行为影响最小的呼吸片段，以明确对呼吸挑战的反应。本文介绍了一种可在老年小鼠中获得短暂而安静的基础呼吸状态的实验方案，其效果可与等待较长时间的安静呼吸相媲美。采用较短时间片段具有重要价值，因为某些品系的小鼠可能更容易兴奋或焦虑，在合理的时间范围内难以实现长时间的安静呼吸。我们将22月龄的小鼠置于UBP舱内，比较了在第60至120分钟期间获取的四个15秒安静呼吸片段与一个耗时 2–3小时获得的10分钟安静呼吸时段的数据。同时，在30分钟适应期后、安静呼吸片段开始前，我们还记录了中枢性呼吸暂停和增强呼吸的发生次数。结果显示，10分钟的安静呼吸与使用短得多的15秒时段所获得的数据具有可比性。此外，这些15秒安静呼吸片段之前的时间段也可用于收集关于中枢性呼吸暂停的数据。本方案使研究人员能够在固定时间内采集呼吸模式数据，并使得对可能表现出更多兴奋行为的小鼠进行安静基础状态测量成为可行。UBP方法本身提供了一种有用且无创的方式用于采集呼吸模式数据，并允许对同一批小鼠在多个时间点进行重复测试。
引言
无创双腔法（UBP）是一种常用于评估呼吸模式的技术1,2,3,4。该方法将小鼠置于一个密闭的容器中，主腔室（容纳动物）与参考腔室之间的压力差通过流量计进行过滤，从而获得测量值。由此建立的UBP系统具有无创、无需束缚的优点，可在无需麻醉或手术的情况下实现呼吸参数的检测。此外，该技术适用于需要对同一只小鼠在不同时间点进行多次测量的研究。通过该方法，可在单次实验或多次实验中定量分析呼吸频率、潮气量和每分钟通气量等变量。全身体积描记UBP还可提供峰值流速和呼吸周期持续时间的测量数据。这些参数共同表征了呼吸模式的特征。记录的呼吸曲线还可用于回溯数据分析，并统计特定时间段内出现的中枢性呼吸暂停次数。该计数结果可结合潮气量和吸气时间的分析，用于评估呼吸模式的其他改变。
尽管已有多种非侵入性体积描记技术可用于直接评估肺部生理参数，但整体身体非限制性体积描记法（UBP）能够在对小鼠造成最小不必要应激的情况下，实现对呼吸功能的筛查。头部分离式体积描记法也是一种非侵入性方法，利用潮气期中呼气流量指标进行测量，但与其他多种体积描记法（例如双腔体积描记法）一样，需要对动物进行束缚。尽管这些方法已被用于啮齿类动物模型中气道反应性的测定5，但使用颈圈或小型束缚管可能使小鼠（相较于其他物种）需要更长时间才能适应，并使呼吸恢复至静息水平。
获得最佳的自主呼吸阶段是进行基线比较的重要考虑因素。商用容积描记系统的日益普及，使得许多实验室能够采集呼吸模式数据。重要的是，在整个数据采集期间，呼吸模式存在波动，尤其是小鼠。因此，有必要对基线分析进行标准化，以确保实验人员的操作熟练程度不会对结果造成干扰。获取自主呼吸阶段的方法多种多样，这也是不同实验设计之间存在差异的一个方面。一种方法是在动物进入呼吸室后，根据预先设定的时间段，取最后10–30分钟的数据进行平均1；另一种方法则是等待小鼠在视觉上明显安静持续5–10分钟6。后者可能需要2–3小时才能实现，在某些情况下，如果小鼠未能持续足够长时间的安静状态，实验可能需要中止。这一问题在行为表现更为焦虑和兴奋的小鼠品系中尤为突出7。这类小鼠可能需要更长时间适应呼吸室环境，且仅能短暂地保持安静状态。限制基线数据采集的时间，有助于标准化每只小鼠在呼吸室内的停留时间。
实验人员获得一个合适的基线至关重要，该基线应包含小鼠的静息行为数值，同时需在合理的时间内完成。因此，本报告的目的是描述用于获取小鼠呼吸参数短期安静基线值的方法。此外，我们报告在放入检测舱后的第一小时内即可对呼吸暂停和增强呼吸进行定量分析。
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方案
所有实验程序均经 Le Moyne 学院机构动物护理与使用委员会批准。所有动物使用均符合《实验动物护理与使用指南》中所述政策8。
注意：（关键）实验前，必须获得动物使用所需的所有必要批准并完成相关培训。实验人员应熟悉小鼠的行为和活动水平，包括睡眠、痛苦和/或运动伪影与正常嗅探及呼吸的区分。
1. 全身体积描记法舱
- 阅读容积描记法测量舱的相应用户手册，包括连接器、O型圈等部件，并创建标准操作规程文件，以在软件中定义分析仪（如代谢分析仪）及相关参数。
- 确保所有软管和管道已连接至测量舱。将一条气体流入管（进气管）和一条真空管（出气管）直接连接到容积描记法测量舱。
注意：进气管必须连接至标记为 bias flow 的接口。 - 将CO2、O2和N2气瓶连接至气体混合器。实验前确保所有气瓶均处于开启状态。
2. 体积描记仪气压腔的校准
- 通过选择高流量和低流量气体进行校准 7700-放大器设置 在……之下 硬件 体积描记法软件的气压标签
- 根据实验设计设定适当的真空度（气流从腔室流出） 和气体分析仪（约0.1 L/min）。
注意： 校准和实验过程中，流出速率必须保持一致，以确保代谢记录的准确性。 - 通过将流量管从腔室中移除并关闭真空，来设置较低的气流。
- 通过输入记录零流量 0 到……中 低单位 细胞对应腔室。双击 低热量 细胞，将时间更改为3秒，然后点击 测量.
- 重新连接流管，通入气体（20.93% O₂）2，平衡的 N2通过气体混合器使气体流入容积描记室。
- 将流入量从升/分钟转换为毫升/秒。点击 高单位 细胞对应腔室，并输入以毫升/秒为单位的数值。双击 高钙，将时间更改为 3 s，然后单击 测量.
- 离开 7700-放大器设置 打开标签以将代谢分析仪校准至容积描记软件。
3. 代谢分析仪校准
- 在气体混合器程序中，将气体混合器设置为释放含有 20.93% O2 和 79.07% N2 的气体流。
- 在代谢分析仪上，将 O2 校准水平设为 20.93%，CO2 设为 0%。输入适当数值后，将旋钮调回 Sample 位置。
- 设置高 O2 百分比。点击容积描记软件中的 ABCD-4 选项卡，然后在 C2 行的 High Unit 下输入 20.93。在 High Cal 下将时间更改为 3 秒，然后点击 Measure。
- 设置低 CO2 百分比。在 C3 行的 Low Cal 下输入 0，然后将时间更改为 3 秒，并点击 Low Cal 下的 Measure。
- 在气体混合器程序中，将 O2 值更改为 10%，CO2 值更改为 5%。等待数分钟，使气体流稳定达到这些设定值。在代谢分析仪上，调节校准旋钮，使 CO2 读数等于 5%。校准完成后，务必将旋钮调回 Sample 位置。
- 设置高 CO2 百分比。在将相应数值输入容积描记软件的 O2 和 CO2 参数前，确保分析仪读数已稳定。点击 C3 下的 High Unit 并输入 5。将 High Cal 时间改为 3 秒，然后点击 Measure。
- 设置低 O2 百分比。点击 C2 选项下的 Low Unit 并输入 10。点击 Low Cal，输入 3 秒，然后点击 Measure。
- 将气体混合器中的气体参数重新调回 20.93% O2 和 79.07% N2。等待数分钟，使舱内气体参数稳定。如果代谢分析仪未能自动显示 20.93% O2 和 0% CO2，请重复步骤 3.1–3.7 以确保正确校准。应定期使用经认证的标准气体钢瓶验证校准准确性。
- 重新检查连接至容积描记舱的流量计。调节进出舱体的空气流速至适合实验的速率（通常为 0.1–0.3 L/min）。
- 当所有设置均已应用于容积描记软件后，点击 OK 开始记录。
4. 无束缚体积描记法
- 记录小鼠的体重和初始体温。将小鼠放入代谢室前，先等待10分钟，以采集空室条件下的O2和CO2数据。实验应在小鼠熟悉的安静环境中进行，避免噪音和气味干扰数据采集。避免任何可能的干扰，包括开关门或人员进出数据采集室。
注意： 本具体实验方案使用了22月龄的雄性C57BL/6J小鼠。 - 在第一个小时内，记录小鼠的行为并详细记笔记，包括进出代谢室的气流具体数值。
- 经过60分钟的代谢室适应后，在接下来的60分钟内观察小鼠安静呼吸的时段。列出所有持续时间不少于15秒、且无嗅探和理毛行为的呼吸片段。若使用可植入设备，则每10分钟测量一次体温。
- 实验结束后，将小鼠从代谢室中取出并放回其笼中。所有设备应彻底清洁并擦拭干净。若仍有水滴残留，应使用加压空气将其吹干。
5. 呼吸模式与代谢的分析
- 打开体积描记法记录文件，并查阅目标动物的相关记录笔记。
- 在软件中打开 代谢（Metabolic） 面板，取舱内无动物时前 10 分钟的 O2 和 CO2 平均值。将这些数值记录为 FiO2 和 FiCO2。
- 查看体积描记法软件的 流量（Flow） 面板。右键点击 分析属性（Analyze Attributes） 并设置适当参数。在 Meta 1 选项卡下，输入步骤 5.2 中获得的 FiO2 和 FiCO2 值，并在 Meta 2 下输入进入舱内的气流速率，以计算 VO2 和 VCO2。
- 进行呼吸模式分析时，结合动物行为记录和流量面板的波形图，确认 15 秒安静呼吸的时间段。 在 数据解析器（Data Parser） 选项卡中，通过 打开数据解析对话框（Open Data Parser Dialogue） 输入这些 15 秒安静呼吸时间段。点击 解析视图模式（Parser View Mode），仅显示感兴趣的特定 15 秒片段。
- 点击 保存解析后的衍生数据（Save Parsed Derived Data）。在电子表格中打开数据文件以获取分段统计的数据。
6. 呼吸暂停与增强呼吸的分析
- 在打开的审阅文件中，退出解析器视图模式。进入设置 > P3 设置 下的图形设置选项，在类型中选择页面视图。将窗格数量设置为5。在标注为低值的输入框中输入-2，在标注为高值的输入框中输入2，用于表示流量测量值（单位为毫升/秒）。应用更改。
- 滚动至流量追踪面板上的30分钟标记处。
- 统计小鼠放入实验舱后30至60分钟期间的呼吸暂停次数和增强呼吸次数。将持续时间大于或等于0.5秒的呼吸暂停期进行量化，此类情况提示发生呼吸暂停。增强呼吸表现为呼吸轨迹迅速上升至1.25 mL/s以上，随后急剧下降至-0.75 mL/s以下。
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结果
报告了在正常空气气体环境（20.93% O2，其余为N2）下对16只老年（22月龄）小鼠进行无创性整体体积描记法（UBP）评估呼吸模式的结果。分析首先比较了一个较长的10分钟安静呼吸片段（获取该片段耗时超过2小时）与四个较短的15秒片段的平均值（量化时间为第60至120分钟之间）。图1A提供了典型的安静呼吸流量轨迹，其中呼吸稳定，无主动呼吸行为。当从动物收集到类似的轨迹时，软件应接受100%的呼吸周期。然而，图1B代表了一个更活跃阶段的呼吸，此时小鼠正在探索箱体、嗅闻和/或理毛。类似于图1B所示的轨迹较难被软件完全接受，因此不适合本方法所采用和解释的呼吸数据采集类型。为评估两个时间点之间可能存在的呼吸模式差异，所选参数包括呼吸频率（图2A
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讨论
该方案提供了关于小鼠安静呼吸基线的信息，以及中枢性呼吸暂停和增强呼吸的数据采集方法。代表性结果表明，老年小鼠群体的10分钟安静基线呼吸模式与四次15秒片段的平均值相似。重要的是，这些15秒片段之间在统计学上无显著差异，且使用Levene检验发现这些组之间的变异程度亦无差异。这些数据表明，即使单次短暂的记录也足以用于监测安静呼吸。然而，也有可能在单只小鼠内比较15秒与10分钟时间段的个体变异时会得出不同的结果，因为10分钟片段可能包含少量嗅探和理毛活动。但使用Levene检验对单只小鼠的基线片段进行比较，其分析方法不同于本方案中所描述的方法。总体而言，本方法的设计采用在放入呼吸室后60至120分钟期间获取的15秒呼吸片段，而无需等待每只小鼠达到更长时间的安静基线状态。
较短的基线采集时间使得能够对更易焦虑或躁动的小鼠品系进行安静呼吸的检测。若采用较长的呼吸片段（例如10分钟或2分钟），会延长实验流程，可能导致在3小时内小鼠未能表现出安静呼吸曲线时不得不中止试验。由于许多实验设计还需包含呼吸挑战（例如低氧），为其他气体测试预留的额外时间进一步凸显了基线采集时间标准化的重要性。采用单次1...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Angela Le、Sarah Ruby和Marisa Mickey在维持动物种群方面所做的工作。本研究由1R15 HD076379（L.R.D.）、3R15 HD076379（L.R.D.资助CNR）以及McDevitt自然科学本科生研究奖学金（BEE）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二氧化碳分析仪 | AEI Technologies | CD-3A | |
| 二氧化碳传感器 | AEI Technologies | P-61B | |
| 计算机 | 必须符合 Ponemah 软件的要求 | ||
| 干燥剂珠（Drierite） | PermaPure LLC | DM-AR | |
| 流量控制装置 | AEI Technologies | R-1 | 真空用 |
| 流量计 | TSI | 4100 | 每个腔室需配备一个，另需一个用于真空系统 |
| 气体混合器 | MCQ Instruments | GB-103 | |
| 气体钢瓶 | Haun | 100% 氧气、100% 二氧化碳、100% 氮气——食品级，或预先混合的室内空气及实验用气体钢瓶 | |
| 氧气分析仪 | AEI Technologies | S-3A | |
| 氧气传感器 | AEI Technologies | N-22M | |
| 聚氨酯管路 | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah 软件 | DSI | ||
| 小型啮齿类动物腔室 | Buxco/DSI | ||
| 体温计（LifeChip 系统） | Destron-Fearing | 任何可准确测量体温的体温计均可使用，但植入式芯片可在动物仍处于全身体积描记腔室（UBP chamber）中时多次测量体温，且对动物干扰最小 | |
| 换能器 | Validyne | DP45 | 每个腔室需配备一个 |
| 全身体积描记系统 | Data Science International (DSI) | 包含 ACQ-7700、压力/温度探头等 |
参考文献
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