本方案描述了生成具有自发性自身免疫生发中心的混合型小鼠骨髓嵌合体的方法，其中自身反应性淋巴细胞携带一种光激活型绿色荧光蛋白（PA-GFP）报告基因。该系统能够将组织中细胞的定位与后续的分子及功能分析相联系。
本文内容
摘要
摘要
自身免疫性疾病带来了重大的健康负担。关于自身免疫性疾病的发病机制与进展过程，仍有许多基本问题尚未解答。要深入理解疾病背后的机制和细胞动态，一个关键需求是能够将特定细胞亚群的微解剖定位与后续的分子或功能分析精确关联起来；而这一目标在传统上难以实现。近年来，稳定的光激活生物荧光探针的开发及其在报告基因小鼠品系中的应用，使得在小鼠模型中对特定细胞亚群进行精确的微解剖标记与追踪成为可能。本文中，我们以一种新型嵌合型自身免疫模型与光激活报告系统相结合为例，阐述如何通过分析单个生发中心来源的自身反应性淋巴细胞，为自身免疫研究提供新的见解。我们展示了一种构建混合嵌合小鼠的方法，这些小鼠可自发形成由携带光激活绿色荧光蛋白报告基因的淋巴细胞组成的生发中心。利用体内标记策略，可在离体淋巴组织中可视化单个生发中心，并通过双光子显微镜对其中的细胞成分进行光激活。来自单个生发中心的光激活淋巴细胞随后可被流式细胞术分析或分选，既可作为单细胞，也可批量处理，并可用于进一步的分子与功能分析。该方法可直接应用于自身免疫研究领域，为该领域带来新的认识；同时，骨髓嵌合小鼠的构建方法以及光激活操作流程也可广泛应用于感染性疾病和肿瘤转移等研究领域。
引言
过去几十年中，自身免疫性疾病的发病率迅速上升，尤其是在西方社会。如今，自身免疫性疾病在西方世界最常见致病和致死原因中位列第三1。关于自身免疫性疾病的发生与发展，许多基本问题仍未得到解答。要深入理解疾病的潜在机制和细胞动态，一个关键要求是将细胞亚群的微解剖学定位与下游的分子或功能分析精确关联起来。在过去十年中，一系列稳定的光转化、光激活或光切换生物荧光探针被开发出来，并被整合到报告基因小鼠品系中，从而实现了在小鼠模型中对特定细胞亚群进行精确的微解剖学标记与追踪。
Kaede 是一种来源于石珊瑚的光转化荧光蛋白，在暴露于紫光或紫外光后，会不可逆地从绿色荧光转变为红色荧光2。最初被用于追踪发育中器官型脑切片中单个细胞的动态行为3，随后构建的Kaede基因敲入小鼠使得在活体内监测细胞运动成为可能，该系统已被应用于分析免疫细胞向淋巴结的迁移及其离开过程4。此后，该方法通过第二代报告系统得到了进一步优化5。另一种类似的报告蛋白是Dendra6，最近已被用于在活体内追踪淋巴结转移7。
首个开发出的光激活蛋白是一种经过单点突变（T203H）改造的绿色荧光蛋白（GFP），其在450至550 nm波长范围内的吸收能力极低8。经紫光照射激活后，该光激活绿色荧光蛋白（PA-GFP）的吸收峰从约400 nm转变为约500 nm，在488 nm波长激发下荧光强度提升约100倍。通过构建所有造血细胞均表达PA-GFP的转基因小鼠，首次实现了对生发中心解剖结构明确的明区与暗区中B细胞筛选过程的深入分析9。
光激活是从非荧光状态不可逆地转变为荧光状态的过程，而光转化则是从一种波长向另一种波长的单向转变。 光控开关蛋白能够在两种条件下穿梭10这一能力最近被用于实现对蛋白质活性的光学调控11.
利用PA-GFP报告基因，我们最近在一种新型的自发性狼疮样自身免疫模型中表征了单个生发中心的B细胞受体库12。该模型基于混合嵌合体，其中1份骨髓携带针对核糖核蛋白复合物具有特异性的自身反应性B细胞受体基因敲入（564Igi13,14），另与2份来自任意所需供体的骨髓混合。在重建后约6周，机体达到稳态，此时脾脏和皮肤淋巴结中出现自发性自身反应性生发中心。值得注意的是，生发中心B细胞群体几乎完全（约95%）由非564Igi来源的细胞组成，而这些野生型来源的B细胞已转变为自身反应性。因此，该模型允许采用“即插即用”方式，结合各种转基因、基因敲除和报告系统，对自身反应性生发中心B细胞进行分析。本文中，我们描述了构建携带PA-GFP报告基因的混合嵌合体并诱导其形成自发性自身反应性生发中心的实验流程。通过体内标记策略，可在离体淋巴组织中可视化单个生发中心，并使用双光子显微镜对其中的细胞成分进行光激活。来自单个生发中心的光激活淋巴细胞可进一步通过流式细胞术进行分析，或通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分选，继而开展后续分子和功能分析。对单个生发中心来源的自身反应性淋巴细胞进行分析的能力，可直接应用于自身免疫疾病领域的深入研究，同时本文所述技术与方法也可拓展至感染性疾病和肿瘤转移研究的相关领域。
方案
所有动物使用均符合欧洲共同体指南，并已获得丹麦动物研究监察局批准（2017-15-0201-01348）。
1. 小鼠常规饲养管理及缓冲液与工具的准备
- 在特定病原体阴性（SPF）条件下饲养小鼠，并根据标准指南定期监测其健康状况。
- 可选：通过免疫荧光显微镜（检测生发中心结构的存在）或流式细胞术（检测生发中心B细胞的频率）验证 naïve 小鼠中不存在因未监测的偶然感染而自发形成的生发中心，方法如前所述12。
注意：雌性或雄性小鼠均可使用。通常建议供体与受体性别匹配，因为性别不匹配理论上可能导致雌性受体或供体对雄性Y抗原产生同种反应性15。 - 使用约6–10周龄的CD45.1受体小鼠（B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ）。使用6–12周龄的564Igi（B6.Cg-Ightm1(Igh564)TikIgktm1(Igk564)Tik/J）和PA-GFP（B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J）供体小鼠。
- 按照常规灭菌指南，通过高压灭菌法对手术器械（直头精细剪刀和Dumont #5及#7镊子）进行灭菌。
- 配制500 mL骨髓（BM）缓冲液，包含磷酸盐缓冲液（PBS）、2%胎牛血清（FBS）和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA），pH值为7.4。配制方法：将10 mL经热灭活（在56 °C水浴中加热1小时以灭活补体）的FBS和1.25 mL 400 mM EDTA溶液（调节至pH 7.4）加入500 mL pH 7.4的PBS中，充分混匀。使用0.2 µm滤器瓶过滤缓冲液。
- 通过将1 mL 10倍浓缩储存液用试剂级水稀释至总体积10 mL，配制10 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液（155 mM NH4Cl、12 mM NaHCO3、0.1 mM EDTA）。另配制50 mL含5 mM EDTA、pH 7.4的PBS。
2. 建立混合骨髓嵌合体
- 受体小鼠的照射（第0天）
- 将CD45.1骨髓受体置于适当的辐照容器中，在γ射线辐照仪中以1,100 Rad进行辐照。
注意：可使用其他辐照源。无论采用何种辐照源，均需优化剂量和时间，以在尽量减少对动物非靶组织损伤的前提下，达到最大的骨髓清除效果。 - 自由饮用含抗生素的水（每毫升饮用水中含1 mg磺胺嘧啶和0.2 mg甲氧苄啶）。
- 将CD45.1骨髓受体置于适当的辐照容器中，在γ射线辐照仪中以1,100 Rad进行辐照。
- 骨骼提取（第1天）
- 使用空气中持续通入4%异氟烷麻醉564Igi骨髓供体，随后通过颈椎脱位实施安乐死。用乙醇喷洒供体，并将其置于生物安全柜内的无菌手术垫上。操作过程中须维持无菌条件，使用无菌缓冲液和无菌器械。
- 为了取出股骨和胫骨，首先使用直头精细剪刀在踝关节周围做切口，并向上延伸至髋关节。使用重型镊子或拇指与食指将腿部皮肤向上朝向躯体方向拉下并剥离。同样地，将足部皮肤向下拉下并剥离。
- 抓住腿部的髋部，用力拉扯脚部，使膝关节和踝关节脱出。接着折断踝关节，在握住胫骨的同时将脚部向身体方向拉动，从而将肌腱和肌肉从胫骨上剥离。
- 掰开膝关节以分离胫骨，同时握住股骨并将胫骨向身体方向牵拉，从而将肌腱和肌肉从股骨上剥离。在髋关节处做切口并切断肌腱，然后将股骨从髋臼中抽出。对对侧肢体重复步骤 2.2.2 至 2.2.4。
- 用粗纸巾轻轻擦拭骨骼，以彻底清除残留的肌肉和结缔组织。随后用冰冻的BM缓冲液冲洗，并使用Dumont #7镊子将骨骼转移至冰上盛有新鲜冷BM缓冲液的容器中。对携带PA-GFP报告基因的供体重复步骤2.2。
注意：单个供体的骨髓细胞数量因性别和年龄而异。应根据所需的骨髓输入比例、细胞数量以及受体数量调整供体数量。若供体有限，可额外取前肢进行骨髓提取，通常可多获得约1/3至 ½ 从后肢获取的细胞中，通常每个供体可回收5000万至2亿个细胞，具体数量取决于供体的年龄、性别、遗传背景以及是否仅包括后肢或同时包括前后肢。
- 骨髓细胞提取
- 用冰冻的BM缓冲液冲洗研钵以进行准备。弃去冲洗用的缓冲液，使用电动移液器配合10 mL移液管加入10 mL新鲜的冰冻BM缓冲液。
- 使用Dumont #7镊子将564Igi供体的骨骼转移至研钵中，用研杵碾碎并研磨骨骼以释放骨髓。用10 mL血清移液管吸取骨髓提取物，并通过70 μm细胞滤网过滤 µ将m细胞滤筛放入冰上的50 mL离心管中。
- 向研钵中再加入 10 mL 新鲜的冰冻 BM 缓冲液，重复操作以确保细胞完全回收。用纸巾将骨组织从研钵中移除，妥善丢弃，并用 70% 乙醇小心冲洗研钵，随后用 BM 缓冲液冲洗。对 PA-GFP 骨髓供体组重复步骤 2.3。
- 计数骨髓细胞
- 使用微量移液器，加入一滴含有40 µL红细胞裂解缓冲液置于一块塑料石蜡膜上。将564Igi骨髓管倒置数次，取出10 µ使用微量移液器吸取 L 等分试样，与 40 混合 µ红细胞裂解缓冲液1 L
- 随后加入50 µL 台盼蓝（0.4% 水溶液）加入液滴中。立即加载 10 µ使用血细胞计数板在显微镜下计数混合液的 L 体积。根据 10 倍的总稀释倍数计算每毫升的细胞数量。确认细胞活力符合要求。 >90%。对PA-GFP骨髓供体组重复步骤2.4。
- 制备供体细胞悬液
- 根据步骤 2.4 获得的计数结果以及所需受体数量，计算来自两个供体组的供体骨髓在供体混合管中混合时的体积。
注意：例如，设置一组比例为1:2的564Igi:PA-GFP混合嵌合体，共6只CD45.1受体小鼠：每只受体需要20 × 10⁶个来自564Igi供体的骨髓细胞和40 × 10⁶个来自PA-GFP供体的骨髓细胞6 供体细胞总数，1 份 564Igi 和 2 份 PA-GFP。因此，需要 6 × 1/3 × 20 × 106 = 40 × 106 564Igi 供体细胞和 6 × 2/3 × 20 × 106 = 80 × 106 PA-GFP 供体细胞 - 将适量的 PA-GFP 和 564lgi 供体骨髓混合于 50 mL 圆锥形离心管中。以 200 x g 和 4 °C，使用摆动桶转子离心10分钟。
- 弃去上清液，将细胞重悬于冰浴的 BM 缓冲液中，密度为 1 x 108 每毫升细胞。转移至预冷的1.5 mL微量离心管中，置于冰上。
- 根据步骤 2.4 获得的计数结果以及所需受体数量，计算来自两个供体组的供体骨髓在供体混合管中混合时的体积。
- 重建骨髓受体的供体骨髓
- 使用空气中持续气流的4%异氟烷进行诱导麻醉，随后以3.75%维持麻醉。通过脚趾夹捏反射消失确认麻醉深度充足。
- 轻轻弹击含有骨髓混合物的离心管，以充分重悬骨髓细胞，然后吸取200 µL 骨髓混合物（约 20 × 106 细胞），使用0.3 mL、30号针头的胰岛素注射器。
- 将受体小鼠侧放，轻轻拉伸眼周上下方的皮肤，使眼球略微外凸，然后将注射器尖端以约30度角轻轻插入° 以一定角度刺入眼眶前部，注意避开眼球及周围组织。当感觉到针尖触及眼眶下方的骨面时，稍向后退针（约0.5 mm），然后在稳定压力下缓慢注入供体骨髓。
注意：注射时不应出血，不应有液体渗漏，且眼球膨出应无或极轻微。 - 将小鼠放回笼中，给予随意饮用的抗生素水，并确认其术后立即恢复。对每只受体重复步骤2.6。
注意：尾静脉注射可替代眶后注射，且效果相似，但在我们操作中，其速度明显较慢，因此在处理大量受体动物时可能需要特别关注。 应避免让麻醉后的动物直接在细小直径的垫料上恢复，因为这会带来误吸和窒息风险
- 移除抗生素水（第14天）
- 将抗生素水从笼具中移除，并更换为新鲜的普通饮用水。
3. 检查重建是否成功并验证嵌合程度是否适当（第6周）
- 嵌合体小鼠及对照小鼠的眼后静脉采血
- 准备血液收集管：根据受体小鼠耳标编号标记1.5 mL微量离心管，并向每管中加入含5 mM EDTA的50 µL PBS。
注：需设置PA-GFP、CD45.1、CD45.2和9D11（独特型）的适当对照。可通过包括1只PA-GFP+小鼠、1只CD45.1小鼠、1只B6小鼠和1只564Igi小鼠来实现。 - 麻醉小鼠，并按照步骤2.6.1确认麻醉深度。将嵌合体小鼠侧放，轻柔拉伸眼睛上下方的皮肤，使眼球轻微突出。
- 将一根聚对苯二甲酸乙二醇酯（BoPET）包裹的肝素化毛细管（内体积60 µL）以约40°角轻轻插入眼眶前部，注意避免损伤眼球及周围组织。轻轻扭转或旋转毛细管，直至其开始充盈血液。
- 让血液通过毛细作用被动填充毛细管，直至几乎完全充满后，撤出毛细管并立即将其放入相应预标记的收集管中，同时立即松开对眼部的压力，使眼球复位。出血应立即停止。
- 确保毛细管中的血液已完全排入收集管，随后将毛细管丢弃至锐器容器中。盖上收集管盖，倒置三次以确保与PBS/EDTA充分混匀。
- 将小鼠放回笼中，并观察其立即恢复情况。对每只实验小鼠及相应对照小鼠重复步骤3.1。
注：使用下颌静脉穿刺时需谨慎，因该方法在受照小鼠完全重建前可能带来更高的意外感染风险。此外，根据我们的经验，该方法采集的血量以及因过度出血导致的血液损失量更具变异性。这两点均需重视，因为骨髓嵌合体在重建阶段较为敏感，此时新骨髓尚未完全植入，造血功能也未恢复至正常水平。
- 准备血液收集管：根据受体小鼠耳标编号标记1.5 mL微量离心管，并向每管中加入含5 mM EDTA的50 µL PBS。
- 外周血单个核细胞（PBMC）纯化
- 完成采血后，将收集管在低速（<200 x g）下短暂离心（10秒），使稀释并稳定的血液沉降至管底。
- 用10 mL注射器吸取淋巴细胞分离液，并连接18 G针头。将针头插入第一管底部，沿管壁缓慢加入1 mL淋巴细胞分离液，形成下层。小心拔出针头，并用纸巾擦拭针头，防止后续样本交叉污染。
- 依次处理所有样本后，在室温下使用水平转子离心机以800 x g离心25分钟，离心机刹车设置为低速或关闭。
- 准备一组相应标记的1.5 mL微量离心管，每管中加入1 mL冰浴BM缓冲液。
- 离心结束后，用200 µL移液器进入每管上层（血浆层），吸取界面层上方的单个核细胞（MNC）层，转移至相应标记的含1 mL BM缓冲液的离心管中。盖紧管盖并倒置混匀。弃去含有淋巴细胞分离液的管子。
- 处理完所有样本后，在4 °C下以200 x g离心5分钟（使用水平转子）。吸除上清液并弃去，将沉淀重悬于200 µL冰浴BM缓冲液中。样本现可进行抗体染色及流式细胞术分析。
- 流式细胞术检测染色
注：推荐染色组合：CD45.1-FITC、B220-PerCP-Cy5.5、9D11-A568、CD45.2-APC。非激活态PA-GFP在Pacific Orange（或等效）通道中检测。由于淋巴细胞分离过程已去除死细胞，无需使用活率染料。- 使用移液器将每只嵌合体及对照样本的细胞悬液各100 µL加入96孔板的对应孔中。
- 对于3个非PA-GFP对照样本，将剩余的各100 µL样本混合（共300 µL）。取50 µL该混合液加入未染色对照孔和单染对照孔。对于PA-GFP单染对照孔，额外加入50 µL未染色的PA-GFP样本。
- 向各孔中加入100 µL缓冲液（未染色孔）、单一抗体（单染补偿对照孔，PA-GFP补偿对照除外）或抗体混合液（样本孔）。冰上孵育20分钟。
- 在4 °C下以200 x g离心5分钟。快速甩去上清液。每孔加入200 µL BM缓冲液，再次离心洗涤。甩去上清液后，将各孔细胞重悬于200 µL BM缓冲液中。样本现可用于流式细胞仪分析（图1）。
注：嵌合体中的生发中心反应可在6周及以后任意时间点进行分析。
4. 体内标记边缘区/被膜下窦以辅助识别单个生发中心
注意：本方案以足垫/踝关节（腘窝淋巴结）和静脉内（i.v.，脾脏）注射为例进行演示，但可根据靶部位进行调整。
- 双侧足垫注射以标记腘淋巴结
- 按照步骤 2.6.1 对小鼠进行麻醉。
- 在 1.5 mL 微离心管中，将 2 µL PE 标记的大鼠抗小鼠 CD169 抗体溶于 18 µL pH 7.4 的 PBS 中。取塑料封口膜，滴加两滴混合液，每滴 10 µL。使用带有 30 号针头的 0.3 mL 胰岛素注射器分别吸取每滴混合液。
- 将 10 µL 标记混合液注射至任一侧足垫（针头以 5–10° 角度刺入足垫中央区域，位置在脚趾起始处近端，针头插入深度约为向足跟方向的一半），或注射至踝关节（针头以 5–10° 角度刺入足跟上方，沿跟腱轴线朝向膝盖方向插入约一半针头长度）。注射后将小鼠放回笼中，静置约 15 分钟，再进行步骤 5。
- 静脉注射以标记脾脏
- 按照第 2.6.1 步对小鼠进行麻醉。
- 在 1.5 mL 微离心管中，将 10 µL PE 标记的大鼠抗小鼠 CD169 抗体溶于 90 µL PBS 中。用 0.3 mL 胰岛素注射器吸取混合液。
- 按照步骤 2.6 进行眶后静脉注射。注射后将小鼠放回笼中，静置约 15 分钟，再进行步骤 5。
注意：除异氟烷外，也可使用注射类麻醉剂如氯胺酮/赛拉嗪混合液；但此类麻醉剂通常导致恢复时间较长。由于淋巴引流通常受骨骼肌运动影响，因此预计会延长引流时间。
5. 脾脏和淋巴结的离体及光激活前准备
- 制备双面成像与光激活腔室
- 从20 mL注射器中取出活塞，并通过将真空润滑脂管的喷嘴插入其中，从后端装填真空润滑脂。然后从5 mL注射器中取出活塞，并使用20 mL注射器将真空润滑脂从后端装入5 mL注射器中。
- 使用装有真空润滑脂的5 mL注射器制备成像与光激活腔室：将一方形盖玻片置于平坦表面，沿盖玻片边缘（距边缘约1–2 mm处）用真空润滑脂描边。
注意：务必避免真空润滑脂污染后续会接触显微镜物镜的任何表面，因为乳化在浸没水中的微小润滑脂液滴可能污染物镜。 - 用冰冻的BM缓冲液填充盖玻片-真空润滑脂腔室，并将其放置于冰冷的平面上。
- 收获淋巴结与脾脏
- 按照步骤2.2.1处死待分析的体内标记嵌合小鼠，并用70%乙醇喷洒尸体。
- 为暴露腘窝淋巴结，使用直头精细剪刀在膝窝下方皮肤处做切口，并沿腿后侧肌腱线向上延伸切口，直至接近髋关节。使用Dumont #5或#7镊子将暴露的皮肤瓣向外牵拉，以显露腘窝区域组织（图2A）。
- 使用一对Dumont #5镊子，小心地从腘静脉内侧进入腘窝区域，沿腿部轴向开合镊子插入并分离脂肪组织，以暴露其下方的腘淋巴结。
- 用拇指和食指从膝盖前方近端捏压股四头肌，将淋巴结从窝中挤出（图2B）。用镊子从下方夹住淋巴结，将其从周围组织中游离（图2C），然后放入步骤5.1中制备好的真空润滑脂腔室内。
- 对对侧重复步骤5.2.2–5.2.4。如需要，多个淋巴结可置于同一腔室内。
- 最后，将第二片盖玻片置于真空润滑脂边缘上方，轻轻按压以封闭腔室，注意排除所有气泡。
注意：部分缓冲液可能被挤出，但真空润滑脂应形成紧密密封，防止液体泄漏（图2D）。此时淋巴结已处于双面成像腔室中。 - 为暴露脾脏，使用一对直头精细剪刀在小鼠左侧腹壁、前正中线近端、肋弓下方做切口，并环绕身体延伸至腋后线。此时应可见脾脏尖端（图3A）。
- 用一对Dumont #7镊子拉出脾脏，并剪断其腹侧粘连组织以完全游离。使用直头精细剪刀将脾脏切成约2 mm厚的横截面薄片。
- 将切片放入步骤5.1中制备的真空润滑脂腔室内。如需要，多个脾脏切片可置于同一腔室内。
- 最后，将第二片盖玻片置于真空润滑脂边缘上方，轻轻按压以封闭腔室，注意排除所有气泡。所有成像腔室在非成像与非光激活期间均需始终置于冰上。
注意：部分缓冲液可能被挤出，但真空润滑脂应形成紧密密封，防止液体泄漏。此时脾脏切片已处于双面成像腔室中（图3B）。
6. 光激活
- 识别单个生发中心
注意：本方案以脾脏为例进行描述，但同样适用于淋巴结。- 将成像腔室置于显微镜载物台上。使用3.5 mL塑料移液管，在上层盖玻片表面滴加一滴蒸馏水，并将物镜缓慢下降至接触液滴。使用透射光对准组织表面进行聚焦。
- 切换至暗场模式并启用双光子激发，将激光波长调至940 nm。
注意：在配备适当滤光片组的情况下，该波长可用于激发并检测富含胶原的结构（如主要血管和支架结构）产生的二次谐波信号，以及步骤4.2中注射的CD169-PE信号，后者用于标记边缘区。然而，940 nm激发不会激活PA-GFP。 - 在组织表面附近，定位由CD169-PE染色界定的单个白髓区域，并通过中央动脉相关的二次谐波信号识别动脉周围淋巴鞘（PALS，T细胞区）。在PALS与边缘区之间的区域，寻找高度自发荧光的活化巨噬细胞（即吞噬细胞碎屑的巨噬细胞），其特征为在所有通道中均显示强自发荧光信号，形态呈团块状，内部含有暗色空泡（图4A）。
注意：若因组织方向不理想而需要调整，可翻转成像腔室，从相反方向进行成像。 - 根据步骤6.1.3中识别的特征，划定一个感兴趣区域以标识单个生发中心区域。设置Z轴扫描范围，深度约为100–150 µm，起始于组织表面，步长约为3 µm。
- 切换至830 nm激发波长。关闭或调暗所有检测通道，以防止探测器受到光损伤（因该波长下的激光功率和发射荧光通常显著增强），然后对Z轴堆栈进行“成像”操作。
注意：具体参数设置（如激光功率和像素驻留时间）取决于组织深度、所用组织类型及成像系统。每种应用均需针对所使用的成像系统进行优化。在确保整个Z轴范围内实现高效光激活的同时，应注意避免对细胞造成光损伤。 - 切换回940 nm激发波长，并重新打开各检测通道。扫描整个Z轴堆栈，确认光激活效率（图4B），并检查是否存在光损伤迹象（如弥散性、非细胞边界限制的PA-GFP信号，暗斑或光激活区域出现高强度自发荧光）。
- 继续对成像腔室中所有相关组织进行光激活，完成后立即将腔室放回冰上，直至后续处理。随后对其他成像腔室重复光激活操作。
注意：组织离体、固定及特别是光激活过程耗时较长，但总操作时间应控制在4–6小时内，以避免细胞活力显著下降。
7. 光激活细胞的回收与分析
- 从淋巴结和脾脏中提取淋巴细胞
- 针对每个光激活样本，在冰上准备相应标记的1.5 mL微量离心管，每管加入500 µL BM缓冲液。同时包括非光激活PA-GFP对照样本和未激活的PA-GFP小鼠样本。可通过纳入一只B6对照小鼠和一只PA-GFP对照小鼠来实现。
- 小心移除成像腔室的上层盖玻片，注意保持样本位置（若单个腔室内含多个样本），并将每个样本分别放入对应的样本管中。
- 使用研磨杵匀浆器，在管中挤压组织并旋转研磨杵以释放淋巴细胞。用移液器吸取裂解物，并通过70 µm细胞筛过滤至新的预冷1.5 mL微量离心管中。对于淋巴结样本，直接跳至步骤7.1.5。
- 对于脾脏样本，在4 °C下以200 × g离心5分钟（摆桶转子）。弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL红细胞裂解缓冲液中。室温孵育5分钟，然后加入800 µL冰冻BM缓冲液，继续进行步骤7.1.5。
- 在4 °C下以200 × g离心5分钟（摆桶转子）。弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL冰冻BM缓冲液中。样本现可用于流式细胞术检测和分选（如需要）。
- 流式细胞术检测染色
注：建议染色方案：CD169-PE、B220-PerCP-Cy5.5、9D11-A647、CD38-PE-Cy7、可固定活力染料Efluor-780、GL7-太平洋蓝。未激活的PA-GFP在太平洋橙（或等效）通道中检测。光激活的PA-GFP在GFP通道中检测。任何共纯化的巨噬细胞（可能已或未在体内用CD169-PE标记）可通过CD169-PE染色并将其设为排除门（dump gate）加以排除。- 使用移液器将每只嵌合体及对照样本的细胞悬液各100 µL加入96孔板的对应孔中。
- 对于B6对照样本，分别向未染色对照孔和单染对照孔各加入50 µL上述细胞悬液。对于未激活PA-GFP单染对照孔，额外加入50 µL未染色的未激活PA-GFP样本。对于已激活PA-GFP单染对照孔，汇集所有光激活样本的剩余材料。
- 向每孔加入100 µL缓冲液（未染色和PA-GFP补偿对照）、单一抗体（单染补偿对照）或 抗体混合物（光激活样本）。冰上孵育20分钟。
- 在4 °C下以200 × g离心5分钟。快速甩去上清液。每孔加入200 µL BM缓冲液，再次离心洗涤。甩去上清液，将每孔细胞重悬于200 µL BM缓冲液中。样本现可进行流式细胞仪或分选仪分析（代表性结果见图5）。
结果
混合骨髓嵌合体的制备
本方案可稳定地获得混合骨髓嵌合小鼠，B细胞区室的嵌合程度接近完全，代表性结果如图1所示（统计学显著性请参见12）。血清分型显示，重建6周后B细胞数量恢复正常（图1A），来源于564Igi区室的循环B细胞中，9D11（独特型）阳性细胞频率较低（图1B）。在总淋巴细胞门控范围内，残留的受体来源细胞频率较低，约为6% CD45.1（Q1），表明整体嵌合程度约为94%（图1C）。在供体区室（CD45.1-，Q4+Q3）中，564Igi（Q4）与PA-GFP（Q3）的比例约为23%比77%。该比例略低于输入时的33%比66%，原因在于来源于564Igi区室的B细胞经历了强烈的阴性选择12。如图1D所示，B细胞区室几乎完全嵌合（99.9% CD45.1-），且以PA-GFP骨髓来源的B细胞（Q3）为主，这是由于564Igi来源的B细胞受到强烈阴性选择所致。
组织的收获、处理及流式细胞术分析
图2 和 图3 展示了新鲜分离的淋巴结和脾脏切片的离体操作流程及结果。图4 展示了在离体脾切片中对单个生发中心区域进行活体标记和光激活的代表性结果。如图所示（图4A），使用 CD169-PE 进行的活体标记有效地标记了边缘区（红色，标示为“MZ”）。二次谐波信号出现在含胶原的结构成分和主要血管（蓝色）中，包括动脉周围淋巴鞘（PALS）的中央小动脉。具有强自发荧光的活化吞噬细胞样巨噬细胞与生发中心活动相关（箭头所示）。综上所述，通过识别边缘区、PALS 和吞噬细胞样巨噬细胞，可确定一个可能包含单个生发中心的兴趣区域。该兴趣区域的光激活过程如 图4B 所示。结果表明，光激活在微解剖学上具有高度精确性9，可产生明确的激活区域。所展示的结果还进一步证实了在重建的嵌合体中存在高密度的 PA-GFP+ 淋巴细胞以及自发形成的生发中心。后续流式细胞术分析进一步验证了B细胞区室数量的正常化（图5D）、自发生发中心细胞群的存在（图5E），以及存在已被光激活的生发中心B细胞亚群（图5F）。
因此，本方案提供了一种稳健的方法，用于制备含有自发性自身反应性生发中心的混合骨髓嵌合体，其中生发中心主要由携带光激活报告基因的野生型来源B细胞构成。这继而允许对单个生发中心进行后续分析（图示概览见 图6).
图1： 致死剂量照射的CD45.1受体小鼠（CD45.1+，PA-GFP−）在接受564Igi（CD45.1−，PA-GFP−）:PA-GFP（CD45.1−，PA-GFP+）混合嵌合体移植后6周，外周血嵌合程度的流式细胞术分析。 A) 对单个淋巴细胞进行预设门控后，显示B220+ B细胞的设门图。 B) 来自图A的子门控图，显示B细胞群体中9D11+（独特型）的比例。 C) 对单个淋巴细胞进行预设门控后，PA-GFP与CD45.1的散点图。 D) 来自图A中B细胞子门的PA-GFP与CD45.1散点图。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 2： 用于成像和光激活的腘淋巴结采集与安装操作流程。 A) 在膝关节下方做切口，并向上延伸至髋关节，将切口边缘向两侧拉开，以暴露腘窝（箭头所示）。 B) 打开覆盖的脂肪垫，暴露腘淋巴结（箭头所示）。 C) 从窝内取出腘淋巴结。 D) 对对侧重复该操作，并将两个淋巴结置于双面盖玻片/真空润滑脂腔室中，腔室内充满 BM 缓冲液。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：用于成像和光激活的脾脏采集与安装操作流程。A) 在肋骨下方的前正中线处做一开口，并沿身体延伸至后腋线，牵开切口边缘以暴露脾脏尖端（箭头所示）。B) 牵出脾脏并将其切除，切成薄片（1–2 mm），然后置于双面盖玻片/真空油脂腔室内，腔室内已加入 BM 缓冲液。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4： 光激活。A) 脾脏中生发中心在光激活前的双光子显微图像。在脾脏收获前，通过体内标记抗CD169-PE对边缘区进行染色（红色，以“MZ”标示）。含有胶原的结构（与被膜和主要血管相关）显示出明显的二次谐波信号（蓝色）。箭头标示出具有高度自发荧光的、与生发中心活动相关的吞噬细胞碎片巨噬细胞。成像使用940 nm激发光进行。左上角的比例尺表示200 µm。B) 与A相同，但在830 nm下进行光激活后。现在可在由边缘区界定并包含先前所识别的吞噬细胞碎片巨噬细胞的兴趣区域内观察到光激活的细胞（绿色）。请点击此处查看该图的高清版本。
图5： 光激活生发中心B细胞的流式细胞术分析。 A) 淋巴细胞门的前向散射与侧向散射图。 B) 在淋巴细胞门内，前向散射面积相对于前向散射高度的图，以及由此确定的单细胞门。 C) 在单细胞门内基于活力染料排除法的图，以及由此确定的活细胞门。 D) B220+ B细胞的设门。 E) 生发中心B细胞的设门，定义为B220+门内CD38lo GL7hi的细胞。 F) 在生发中心B细胞群体中光激活细胞的设门，定义为共表达非激活态与光激活态PA-GFP的细胞亚群。 请点击此处查看本图的放大版本。
图6：实验方案的图形化概述。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
目前已建立大量小鼠自身免疫疾病模型，其中许多模型会自发形成生发中心16。然而，现有许多模型具有复杂的遗传背景，或存在淋巴细胞增殖或活化关键调控因子的突变，因而难以与报告基因小鼠品系进行杂交，也不适合用于研究自身免疫状态下正常淋巴细胞的行为。相比之下，本模型可“即插即用”地深入分析源自野生型的自身反应性生发中心B细胞，可灵活结合任何所需的转基因、基因敲除和报告基因系统，本文中以光激活型GFP为例。通过体内标记策略，可在离体淋巴组织中可视化单个生发中心，并利用双光子显微镜对其中的细胞成分进行光激活。随后，可对来自单个生发中心的光激活淋巴细胞进行流式细胞术分析或分选，既可作为单细胞，也可进行群体分析。这些细胞可进一步开展分子和功能层面的下游实验，为自身免疫研究领域提供新的见解。
该实验操作的成功实施包含若干关键步骤。如代表性结果所示，通过照射（1,100 Rad）及供体骨髓重建，可有效替换受体的骨髓成分，从而在B细胞区室中实现接近完全的嵌合状态。这一点至关重要，因为残留的受体来源B细胞将导致生发中心群体中的一部分细胞呈现“暗区”特征。无论采用何种照射源，均需优化照射剂量和时间，以在对动物造成最小附带组织损伤的前提下，达到最大程度的骨髓清除效果。在重建过程中，采用骨粉碎法并移植总计2000万供体细胞，已被证实可稳定获得较高的重建效率。骨髓提取过程中保持无菌和低温（冰上操作），有助于维持供体骨髓细胞的高存活率。为获得目标供体骨髓比例，在对细胞进行分装计数时必须格外谨慎，包括计数操作本身以及取样用于计数的骨髓细胞亚群。将不同供体骨髓混合后共同离心沉淀，而非分别离心重悬后再混合，有助于防止细胞计数后供体比例发生偏移。
本方案中的混合骨髓嵌合体构建方法可独立使用，能够生成携带任何所需报告基因、转基因或基因敲除的自身反应性生发中心嵌合体。然而，该方法的一个局限性在于必须使用组织相容性匹配的供体。564Igi 小鼠品系处于 C57Bl/6J 近交系遗传背景上，因此其他供体和受体应具有 H-2b 近交系背景（或者 alternatively，可将 564Igi 品系回交至目标品系，并在新的遗传背景下验证其自身免疫表型）。辐射处理过程倾向于形成耐受性免疫环境17，某些次要组织相容性抗原的不匹配可能被耐受。然而，这一因素应充分考虑，尤其是在混合使用雄性和雌性供体和/或受体时，因为雌性可能对雄性限制性 Y 抗原产生免疫反应。
类似地，该实验方案中的光激活部分也可独立使用，并适用于多种不同场景。然而，目前PA-GFP报告基因仅与UBC启动子联用，该启动子在所有造血系细胞中具有活性，但在基质细胞中无活性。如引言部分所述，其他可光激活、可光转换或可光转化的报告基因品系也已存在，可根据实验条件的适当调整，替代PA-GFP使用。
在成像过程中，应确保激光波长远高于900 nm，以避免非目标区域的意外光激活，因为该波长不会激发PA-GFP。对于光激活本身，具体的参数设置（如激光功率和像素驻留时间）将取决于组织深度、所用的具体组织类型以及成像系统，每种应用都必须针对所使用的特定成像系统进行优化。操作时应注意避免对细胞造成光损伤，但同时必须确保在整个成像层中实现高效的光激活，以便为后续分析提供足够数量的已激活细胞。生发中心B细胞通常占脾脏或皮肤淋巴结B细胞总数的0.5%至约2%，从代表性结果（图5）可以看出，被光激活的单个生发中心B细胞可能占单个脾组织切片中总B细胞群体的约1%。因此，若要成功分析或分选大量细胞，需要处理大量的事件样本。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
SE Degn 是 Lundbeckfonden 会士和 Carlsberg 基金会杰出会士。本工作部分额外得到了 NNF 生物医学资助（SE Degn）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗体，9D11-A568 | 本实验室制备 | 9D11 杂交瘤细胞系，由 MC Carroll 惠赠，使用 Biotium 92255 试剂盒标记 | |
| 抗体，9D11-A647 | 本实验室制备 | 9D11 杂交瘤细胞系，由 MC Carroll 惠赠，使用 Nordic Biosite ABD-1031 试剂盒标记 | |
| 抗体，FITC 标记抗小鼠 CD45.1 | Biolegend | 110705 | |
| 抗体，Pacific Blue 标记抗小鼠/人 GL7 抗原（T 和 B 细胞活化标志物） | Biolegend | 144613 | |
| 抗体，PE 标记抗小鼠 CD169（Siglec-1） | Biolegend | 102703 | |
| 抗体，PE/Cy7 标记抗小鼠 CD38 | Biolegend | 102717 | |
| 抗体，PerCP/Cy5.5 标记抗小鼠/人 CD45R/B220 | Biolegend | 103235 | |
| 毛细管，Mylar 包裹，肝素化 | Fisher Scientific | 211766 | |
| 细胞筛，70 µm | Falcon | 352350 | |
| 锥形管，50 mL | Falcon | 352235 | |
| 盖玻片，方形，22×22 mm，厚度 0.13–0.17 mm | Thermo Fisher Scientific | 22X22-1 | |
| EDTA | Merck | 1,084,180,250 | |
| 乙醇，70% | VWR | 8301.360 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10270106 | |
| 流式细胞仪，FACS Canto II | BD Biosciences | 338962 | |
| 流式细胞仪，LSRFortessa SORP | BD Biosciences | - | 特殊订制产品，配备 4 个激光器（405 nm、488 nm、561 nm 和 640 nm） |
| 润滑脂，高真空级，Dow Corning | VWR | DOWC1597418 | |
| 血细胞计数板，Burker-Tük | VWR | 630-1544 | |
| 异氟烷，IsoFlo vet. | Orion Pharma | 9658 | |
| 淋巴细胞分离液（Lympholyte-M 细胞分离介质） | Cedarlane | CL5035 | |
| 微量离心管，1.5 mL（Eppendorf） | Sarstedt | 72.690.550 | |
| 显微镜，双光子 | Prairie Technologies（现为 Bruker） | - | 特殊订制 Ultima In Vivo 双光子显微镜 |
| 研钵，带嘴，未上釉，75 ml | VWR | 410-0110 | |
| NaHCO3 | Merck | 1063290500 | |
| 针头，18 号 | BD Medical | 304622 | |
| NH4Cl | VWR | 87,769,290 | |
| PBS | Sigma | d8537 | |
| 研杵式匀浆器 | VWR | 47747-358 | |
| 研杵，未上釉，175 mm | VWR | 410-0122 | |
| 移液管，刻度，10 ml | VWR | 612-3700 | |
| 移液器，塑料转移头 | Sarstedt | 861,172,001 | |
| 塑料石蜡膜（Parafilm M） | Bemis | PM996 | |
| 板，96 孔 | Falcon | 353910 | |
| 手术镊，Student Dumont #5 镊子 | FST - Fine Science Tools | 91150-20 | |
| 手术镊，Student Dumont #7 镊子 | FST - Fine Science Tools | 91197-00 | |
| 手术剪，Student 细剪，直型 | FST - Fine Science Tools | 91460-11 | |
| 注射器，10 mL | Terumo | SS-10ES1 | |
| 注射器，20 mL | Terumo | SS-20ES1 | |
| 注射器，5 mL | Terumo | SS-05S1 | |
| 胰岛素注射器，0.3 cc | BD Medical | 324827 | |
| Tribrissen vet. 24% 注射液，每毫升含 200 mg 磺胺嘧啶和 40 mg 甲氧苄啶 | MSD Animal Health | 431577 | |
| 台盼蓝溶液，0.4% | VWR | K940-100ML | |
| 活率染料，eBioscience 可固定活率染料 eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 |
参考文献
- Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing. International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede. Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).
- Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030(2014).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Habuchi, S., et al. Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).
- Degn, S. E., et al. Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers. Cell. 170 (5), 913-926 (2017).
- Berland, R., et al. Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice. Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).
- Chatterjee, P., et al. Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner. European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).
- Toubai, T., et al. Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells. Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).
- Luzina, I. G., et al. Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice. Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).
- Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529(2014).
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