利用邻近结扎测定法在人类胰腺β细胞中原位内源性米托巴结物的可视化

胰腺β细胞产生维持正常葡萄糖平衡所需的胰岛素,其失败导致所有形式的糖尿病的发展。Β细胞保持强大的线粒体能力,以产生将葡萄糖代谢与胰岛素释放耦合所需的能量。最近,很明显,维持功能线粒体质量对于最佳β细胞功能1,2,3至关重要。为了维持功能线粒体质量,β细胞依靠质量控制机制来去除功能失调、受损或老化的线粒体4。我们和其他人以前已经证明,β细胞依靠一种特殊形式的线粒体周转,称为线粒体自噬(或线粒体),以保持线粒体质量控制在啮齿动物和人类胰^{岛1, 2,5}.然而,不幸的是,在人类胰腺β细胞中,没有简单的方法来检测米托巴细胞或内分泌的米托巴细胞成分。

我们最近已经表明,β细胞中米托巴的上游调节依赖于形成一种蛋白质复合物,包括E3利气CLEC16A和NRDP1和二苯基酸酶USP8^1。NRDP1和USP8已经独立显示,通过行动对关键的米托巴沙第6,7影响米托巴吉。NRDP1的目标是PARKIN的泛化和降解关闭米托巴希6,和USP8专门二苯基丁基丁K6链接的PARKIN,以促进其易位线粒体7。接近结扎测定(PLA)技术是蛋白质相互作用生物学^领域的一个最新进展,允许在单个细胞中原位实现内源性蛋白质相互作用的可视化,不受稀缺样品材料的限制。这种方法对人类小岛/β细胞生物学特别诱人,因为样品可用性的稀疏性,加上需要了解异质细胞类型中生理相关的蛋白质复合物。

利用PLA方法,我们能够观察原发性人类胰腺β细胞和神经元细胞系中的关键内源性米托巴细胞复合物,并演示糖尿病环境对米托巴病^途径1的影响。总之,该协议的首要目标是分析缺乏丰富物质的组织中的特定米托巴状蛋白复合物,或者无法进行常规蛋白质相互作用研究。

使用已识别的捐赠者人类胰腺胰岛是通过机构审查委员会(IRB)豁免,并符合密歇根大学IRB政策。人类胰腺胰岛由NIH/NIDDK赞助的综合胰岛分布方案(IIDP)提供。

1. 人类小岛样品制备

1. 单细胞分离
   1. 培养人类胰岛样品(4000~6000胰岛当量/10 mL介质),在胰腺胰岛介质(PIM(S))介质中至少1天,辅以1 mM谷氨酰胺(PIM(G))、100单位/mL抗霉菌抗生素、1mM丙酸钠和10%胎儿牛血清(FBS)或人AB血清。
   2. 使用3倍放大倍率的解剖光学显微镜从文化中计算单个人类胰岛。在胰岛介质中,将40个胰岛按治疗/感兴趣的条件(如葡狼疮毒性)挑入1.5 mL管中。
   3. 在400 x g下将小岛在10°C下向沉淀物旋转1分钟。
   4. 洗涤样品,在室温下通过管短暂反转,用含有50μM PR619(一种二甲基基辛酶抑制剂;以保留泛性依属蛋白相互作用)的1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)两次,每次洗涤时离心,每次洗涤400次x g在 10 °C 下 1 分钟。
   5. 将胰岛分离成单个细胞,125 μL的0.25%胰蛋白酶含有50μM PR619,用胰岛颗粒孵育预热胰蛋白酶(37°C)3分钟。在此期间,使用 200 μL 移液器定期温和移液,轻轻分散胰岛。
   6. 用含有50μM PR619的1mL加热(37°C)PIM(S)介质对胰蛋白酶进行淬火,然后通过400 x g离心1分钟来沉淀细胞。
   7. 用PBS + 50 μM PR619在400 x g下离心洗涤细胞1分钟,两次。
   8. 最后,在含有50μM PR619的150μL PBS中重新悬浮细胞。
2. 单细胞粘附和固定
   1. 重新悬浮后,使用28 x g的细胞离心器将细胞溶液旋转到结霜、带电的显微镜幻灯片上10分钟。
   2. 细胞离心后,用疏水笔(见材料表)勾勒出细胞区域,以尽量减少所需的抗体/PLA溶液体积。在室温下,将4%的甲醛在PBS中固定15分钟。
      注意:PFA 是危险的,必须小心处理。
   3. 为获得最佳效果,立即进行染色/PLA,或在 24 小时内进行染色。如有必要,将样品储存在PBS4°C,直到染色不超过48小时。

2. 免疫性化学

1. 阻塞
   1. 在室温下用1x PBS清洗细胞两次5分钟。
   2. 块细胞溶液,以消除背景染色,在室温下,在PBS中含有0.3%洗涤剂(见材料表)10%的驴血清。
2. 染色
   1. 用原小鼠或兔子抗体孵育细胞,分别针对USP8(1:250)和NRDP1(1:250)(见材料表),用洗涤剂在磷酸盐缓冲盐水中稀释(PBT,见材料表),在4°C过夜,以通过解放军检测米托巴吉复杂信号。
   2. 用一种标记共同孵化细胞,该标记专门用于β细胞识别,该标记在小鼠或兔子中未升高,以便不干扰PLA信号。在这种情况下,在PBT中孵育具有抗山羊PDX1(1:500)的细胞。在4°C下孵育所有原抗体过夜,在溶液顶部使用塑料薄膜防止蒸发。

3. 接近结扎测定

1. PLA 探头和反印
   1. 根据制造商的说明准备 PLA 探针溶液,即,通过在 PBT 中制备抗小鼠和防兔子探针溶液的最终浓度为 1:5 溶液,并在室内孵育 20 分钟,使每个样品的探针溶液达到 20 μL温度。
   2. 过夜孵育后,用1xPBS在摇杆上洗涤细胞两次,每次5分钟。
   3. 在用探针液孵育之前,在探针溶液中加入最终浓度为1:600的抗山羊Cy5二级(用于检测内源性PDX1)。在每个细胞状况中加入20μL探针溶液,用塑料薄膜轻轻覆盖,并在37°C孵育1小时。
2. 结扎
   1. 在室温下用缓冲器A(参见配方的材料表)在摇杆上洗涤细胞两次,每次5分钟。
   2. 根据制造商的说明制备结扎溶液(检测试剂的一部分,参见材料表)。为此,稀释结扎库存(5x)1:5在二乙基热盐(DEPC)处理的水。孵育前立即加入0.025 U/mL连带。向细胞添加20μL结扎溶液。用塑料薄膜盖住,在37°C孵育30分钟。
3. 放大
   1. 在室温下用缓冲器A洗涤细胞两次,每次2分钟。
   2. 根据制造商的说明制作扩增溶液(检测试剂的一部分,参见材料表)。稀释扩增缓冲液(5x)1:5在DEPC处理的水,并保持在黑暗中,直到使用。在将溶液添加到细胞之前,在溶液中加入1:80稀释聚合酶(检测试剂的一部分,见材料表)。
   3. 向细胞中加入20μL的扩增溶液。用塑料薄膜盖住,在37°C的黑暗中放置1小时40分钟至2小时,以获得最佳信号。
4. 成像准备
   1. 用缓冲器 B(参见配方材料表)在室温下在摇杆上清洗细胞两次(参见配方材料表)。10分钟。
   2. 最后,在0.01x缓冲液B中洗涤细胞一次,在室温下在摇杆上洗涤2分钟。
   3. 通过添加含有 4°,6-二甲苯-2-苯胺(DAPI)的安装介质来安装样品,并使用手术刀将任何气泡压出样品上的盖玻片。密封盖玻片,在边缘周围使用透明指甲油。
   4. 显微镜上能够捕获多个焦平面的图像样本,如激光扫描共聚焦显微镜或具有反卷积功能的倒置荧光显微镜,可拍摄至少 9 种不同的焦平面图像。
      1. 以 100 倍放大倍率拍摄图像,约 0.45 mm z 堆栈高度。以550纳米激发、570nm发射捕获PLA;650 nm 激发时的反污渍,670 nm 发射;和 DAPI 在 405 nm 激发,450 nm 发射。
   5. 为了确保荧光图像背景信号和杂散光最小化,以便对 PLA 事件进行下游分析(特别是在宽场显微镜上),使用二维反卷积(最近邻)算法处理图像。标准图像处理软件的选择。
      注:对于奥林巴斯使用CellSens,尼康使用NIS元素,莱卡使用LAS X,蔡司+ ZEN,变形,MATLAB,惠更斯软件,以及几个插件可以通过图像-J。为了进行分析,应使用 Image-J 软件分析所有 z 堆栈上的交互总数,确保仅分析 Pdx-1 阳性单元(第 3.5 节)。
5. 解放军互动的量化
   1. 打开免费的Image-J软件应用程序,并打开解放军图像。从第一个尖锐的聚焦的解放军形象开始。
   2. 单击图像选项卡,然后选择调整,然后选择阈值(图 1A)。调整阈值以删除所有非特定 PLA 信号,记下阈值调整,并尝试在整个分析过程中保持一致。
   3. 单击进程选项卡,然后选择二进制,然后制作二进制(图 1B)。使用二进制图像测量粒子,通过单击"分析"选项卡并按分析粒子(图1C)。
   4. 为了进行分析,请确保设置如下:大小= 0=无穷大,循环度= 0=1.0,显示= 轮廓,显示结果复选框,以及清除结果(图 1D)。单击"确定"。记下在表示样本的电子表格中分析的粒子数和 z 堆栈位置。
   5. 重复步骤 3.5.2~3.5.4,直到分析样品的所有聚焦 z 堆栈。将电子表格中样本的粒子总数相和,以量化交互的总数。

我们在MIN6胰腺β细胞系和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y进行了初步实验,以优化和确认抗体的特异性和可视化的蛋白质相互作用。MIN6细胞以30,000个细胞/mL镀在盖玻片上,并留下粘附48小时,SH-SY5Y细胞以15,000个细胞/mL镀在盖玻片上,然后留在附着24小时。然后,从步骤 1.2.3 开始,遵循了上述 PLA 协议。为了确保PLA信号的特异性,我们首先在(i)没有原抗体(图2A,图3A),(二)仅NRDP1抗体(图2B,图3B),(三)USP8抗体(图2C,图3C和(iv)NRDP1和USP8抗体(图2D,图3D)。为了便于设置示例,表 1表示如何正确布局实验控件。值得注意的是,我们在单原抗体或无原抗体控制条件下观察无单斑PLA信号,从而确认在MIN6和MIN6和MIN6和MIN6和SH-SY5Y 细胞。

接下来,我们调整了这种方法,以便与人类胰岛一起分析在原代人类β细胞内的米托巴细胞复杂相互作用。人类胰岛由功能不同的细胞组成的异质群体,包括α、β、增量和PP细胞9。与β细胞占胰岛质量+80%的小鼠胰岛相比,β细胞在人类胰岛内(在28-75%之间)中构成比例较小的范围,10、11、12。因此,我们试图利用PLA技术来观察NRDP1-USP8米托巴细胞复合物的存在,特别是贝塔细胞中的存在,并确保我们没有看到来自其他小岛细胞类型的混杂观测物(这可能来自小岛分泌物的共同免疫沉淀研究)。因此,必须确保充分和均匀的岛分散到这样的水平,使单个细胞很容易被区分和进一步分析。如图4所示,分散协议(第1节)在确保显微镜视野中的单个细胞进行下游分析方面非常有效。为了识别β细胞,我们在PLA过程中与PDX1特异性抗血清进行了共染色。PDX1是一种重要的β细胞特异性转录因子,主要存在于成熟的胰岛素生成β细胞中,主要在细胞核13内。PDX1 染色在 NRDP1:USP8 PLA 在主要人类小岛中保留(图 4)。重要的是,我们使用山羊PDX1抗血清,以避免与PLA使用的主要抗体交叉反应(兔子抗NRDP1和小鼠抗USP8,分别)。因此,添加PDX1反染色允许对原生人类β细胞内的内源性核糖核糖核化复合物进行具体评估。

利用这些方法,我们可以编译NRDP1:USP8米托巴结物复合物的保留快照,以推断β细胞内米托巴细胞通路的能力。为了扩大这种方法,在环境条件下使用模仿2型糖尿病14,我们治疗β细胞系和原人胰岛与棕榈状和高葡萄糖诱导葡萄糖毒性。事实上,我们发现,在48小时接触棕榈菌和高葡萄糖后,NRDP1和USP8的相互作用在PLA的β细胞系以及原发性人β细胞中减少(图5和参考1)。这一结果强调了该测定在诊断刺激后评估关键内源性米托巴细胞因子的可行性。

图1:图像J分析的工作流,用于解放军相互作用的量化。此处将突出显示分析的重要步骤。(A) 调整图像阈值,以确保具体的 PLA 信号分析。(B) 将图像转换为二进制数据,以便轻松量化。(C-D)如何通过分析ImageJ软件识别的粒子来完成分析。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:NRDP1和USP8在胰腺β细胞中专门相互作用。显示小鼠胰腺细胞系(MIN6)的高放大倍率(100倍)图像。(A-D)NRDP1:USP8交互的PLA信号以红色显示,核由DAPI以蓝色描述。(A-C)如果在PLA过程中省略了主要蛋白抗体的两个(A)或一个(B、C)的两个(B、C),则不显示NRDP1:USP8相互作用的特定信号。然而,当两种抗体都包括在内时,PLA在胰腺β细胞(D)中可以看到两种蛋白质的相互作用。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:NRDP1和USP8在神经母细胞中专门相互作用。显示人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y的高倍率(100x)图像。(A-D)NRDP1:USP8交互的PLA信号以红色显示,核由DAPI以蓝色描述。(A-C)如果在PLA过程中省略了主要蛋白抗体的两个(A)或一个(B、C)的两个(B、C),则不显示NRDP1:USP8相互作用的特定信号。然而,当两种抗体都包括在内时,PLA (D) 可以看到这两种蛋白质的相互作用.请点击此处查看此图的较大版本。

图4:由解放军在原位原位的主要人类胰腺胰岛中识别β细胞性血小体复合物。显示分散的人类胰岛的高放大倍率(100倍)图像。单细胞通过核染色与DAPI(蓝色)进行划定,β细胞用PDX1染色(品红色)观察到,在β细胞和非β细胞(红色)中都可以看到米托巴结物复合物。请点击此处查看此图的较大版本。

图5:NRDP1:USP8米毒复合物在β细胞中受到葡血毒性破坏。
显示使用控制(25 mM 葡萄糖 + 0.82% BSA)或高葡萄糖 + 棕榈石 (25 mM 葡萄糖 = 0.4m 棕榈石/0.82% BSA) 处理 48 h 的 MIN6 细胞的高放大倍率 (100x) 图像。(A-B)PLA (NRDP1:USP8) 信号在两个治疗组中可见。与对照组 (A ) 相比,在葡药毒性 (B)后,MIN6 β细胞的 PLA 信号减少。请点击此处查看此图的较大版本。

表1:实验设计设置示例。

作者没有什么可透露的。