利用邻近连接技术原位可视化人胰岛β细胞中的内源性线粒体自噬复合物

摘要

本方案概述了一种针对人原代胰岛样本中β细胞的线粒体自噬蛋白复合物形成进行定量分析的方法。该技术因而能够利用有限的生物材料进行线粒体自噬分析，这对于珍贵的人胰腺β细胞样本至关重要。

摘要

线粒体自噬是一种重要的线粒体质量控制通路，对胰岛β细胞的生物能量学至关重要，可为葡萄糖刺激的胰岛素分泌提供能量支持。评估线粒体自噬具有挑战性，通常需要遗传报告系统或多种互补技术，而这些技术难以应用于组织样本，例如原代人胰岛。本文中，我们展示了一种可靠的方法，用于在原代人胰岛中可视化并定量关键内源性线粒体自噬复合物的形成。通过利用灵敏的邻近连接技术检测线粒体自噬调控因子NRDP1与USP8之间的相互作用，我们能够原位特异性地定量关键线粒体自噬复合物的形成。将该方法与转录因子PDX1的复染相结合，可实现对β细胞内线粒体自噬复合物及其潜在抑制因素的特异性定量。本方法避免了其他蛋白质-蛋白质相互作用研究（如免疫共沉淀（IP）或质谱分析）所需的大量细胞提取物，特别适用于珍贵的人胰岛 样本——这类样本通常数量有限，难以满足上述技术的需求。此外，该方法无需通过流式分选技术从异质性胰岛细胞群中纯化β细胞，即可进行后续蛋白质分析。因此，我们描述了一种极具应用价值的线粒体自噬可视化方案，非常适合用于异质性且数量有限的细胞群体研究。

引言

胰腺β细胞产生维持正常葡萄糖稳态所必需的胰岛素，其功能障碍会导致所有类型的糖尿病。β细胞具有强大的线粒体功能，能够生成将葡萄糖代谢与胰岛素分泌相偶联所需的能量。近年来，研究发现维持功能性线粒体数量对β细胞的最佳功能至关重要^1,2,3。为了维持功能性线粒体数量，β细胞依赖质量控制机制来清除功能失调、受损或衰老的线粒体⁴。我们及其他研究团队此前已证实，β细胞依赖一种特殊的线粒体更新方式——线粒体自噬（mitophagy）——来维持啮齿类动物和人类胰岛中线粒体的质量控制^1,2,5。然而，遗憾的是，此前尚无简单方法可用于检测人类胰腺β细胞中的线粒体自噬过程或内源性表达的线粒体自噬相关组分。

我们最近发现，β细胞中线粒体自噬的上游调控依赖于由E3泛素连接酶CLEC16A和NRDP1以及去泛素化酶USP8组成的蛋白复合物的形成¹。已有研究分别表明，NRDP1和USP8通过作用于关键的线粒体自噬启动因子PARKIN来影响线粒体自噬^6,7。NRDP1介导PARKIN的泛素化和降解，从而关闭线粒体自噬⁶，而USP8则特异性地去除PARKIN上K6位连接的泛素链，促进其向线粒体的转位⁷。邻近连接实验（PLA）技术是蛋白质相互作用生物学领域的一项最新进展⁸，可在单细胞中原位可视化内源性蛋白质相互作用，且不受样本量稀少的限制。由于人胰岛/β细胞样本获取困难，同时又需要在异质性细胞类型中理解生理相关的蛋白质复合物，该方法在人胰岛/β细胞生物学研究中具有特别重要的意义。

利用PLA方法，我们能够在原代人胰岛β细胞和 神经元细胞系中观察关键的内源性线粒体自噬复合物，并展示致糖尿病环境对线粒体自噬通路的影响¹。总之，本方案的总体目标是分析那些缺乏充足材料或无法进行常规蛋白质相互作用研究的组织中的特定线粒体自噬蛋白复合物。

方案

使用去标识化的供体人胰岛经机构审查委员会（IRB）豁免批准，并符合密歇根大学IRB政策。人胰岛由美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIH/NIDDK）资助的整合胰岛分配项目（Integrated Islet Distribution Program, IIDP）提供。

1. 人胰岛样本制备

1. 单细胞解离
   1. 在添加了1 mM谷氨酰胺（PIM(G)）、100单位/毫升抗真菌-抗生素、1 mM丙酮酸钠和10%胎牛血清（FBS）或人AB血清的胰岛培养基（PIM(S)）中，于37 °C培养人胰岛样本（4000–6000胰岛当量/10毫升培养基）至少1天。
   2. 使用解剖显微镜在3倍放大倍数下对培养的人胰岛进行单个计数。每种处理/实验条件（如糖脂毒性）下挑选40个胰岛，置于含有胰岛培养基的1.5 mL离心管中。
   3. 将胰岛在400 x g条件下离心 g 在10 °C下离心1分钟以沉淀。
   4. 用含 50 μM PR619（去泛素化酶抑制剂；用于维持泛素依赖性蛋白质相互作用）的 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下轻轻倒置混匀，洗涤样品两次，每次洗涤之间以 400 × g 离心 g 10 °C 下持续 1 分钟。
   5. 用预热至37 °C、含50 μM PR619的125 μL 0.25%胰蛋白酶处理胰岛团块，37 °C孵育3 min，将胰岛解离为单细胞。孵育期间使用200 μL移液枪定期轻柔吹打，使胰岛充分分散。
   6. 用 1 mL 预热（37 °C）的含 50 μM PR619 的 PIM(S) 培养基终止胰蛋白酶反应，然后在 400 x g 条件下离心沉淀细胞 g 1 分钟。
   7. 通过在 400 x g 条件下离心洗涤细胞 g 1 分钟，重复两次，使用 PBS + 50 μM PR619。
   8. 最后，将细胞重悬于含有50 μM PR619的150 μL PBS中。
2. 单细胞黏附与固定
   1. 重悬后，使用细胞离心机在28 × g条件下离心10分钟，将细胞悬液甩至带磨砂面的带电显微镜载玻片上。
   2. 细胞离心后，使用疏水笔标记细胞区域（参见 材料表) 以尽量减少所需的抗体/PLA 溶液体积。用含 4% 多聚甲醛的 PBS 在室温下固定细胞 15 分钟。
      警告：PFA 具有危害性，必须小心操作。
   3. 为获得最佳结果，应立即或在24小时内进行染色/PLA操作。如有必要，可将样品置于4 °C的PBS中保存，但不得超过48小时。

2. 免疫组织化学

1. 封闭
   1. 用1×PBS在室温下洗涤细胞2次，每次5分钟。
   2. 用含 0.3% 去垢剂的 PBS 配制 10% 驴血清封闭液，以消除背景染色（参见 材料表室温下孵育1小时。
2. 染色
   1. 分别加入抗USP8（1:250）和NRDP1（1:250）的一抗（小鼠或兔来源），孵育细胞（参见 材料表) 用含去垢剂的磷酸盐缓冲液（PBT，见 材料表），4 °C 过夜孵育，通过邻近连接实验（PLA）检测线粒体自噬复合物信号。
   2. 将细胞与一种非鼠源或兔源的、用于β细胞鉴定的特异性标记物共同孵育，以避免干扰PLA信号。本实验中，使用抗山羊PDX1抗体（1:500）在PBT缓冲液中孵育细胞。所有一抗均在4 °C下孵育过夜，并在溶液表面覆盖塑料封口膜以防止蒸发。

3. 邻近连接实验

1. PLA探针与复染
   1. 根据制造商说明书配制PLA探针溶液，即每份样品用PBT缓冲液将抗小鼠和抗兔探针溶液均稀释至1:5的终浓度，配制成20 μL探针溶液，并在室温下孵育20分钟。
   2. 过夜孵育后，在摇床上用1×PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。
   3. 在加入探针溶液前，将抗山羊Cy5二抗以1:600的终浓度加入探针溶液中（用于检测内源性PDX1）。向每种细胞样本中加入20 μL探针溶液，轻轻覆盖塑料封膜，在37 °C孵育1小时。
2. 连接反应
   1. 在摇床上用Buffer A（配方见材料表）于室温洗涤细胞两次，每次5分钟。
   2. 根据制造商说明书配制连接反应溶液（属于检测试剂的一部分，见材料表）。将5×连接反应原液用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水按1:5稀释。在即将孵育前，向溶液中加入终浓度为0.025 U/mL的连接酶。向细胞中加入20 μL连接反应溶液，覆盖塑料封膜，在37 °C孵育30分钟。
3. 扩增反应
   1. 在室温下用Buffer A洗涤细胞两次，每次2分钟。
   2. 根据制造商说明书配制扩增反应溶液（属于检测试剂的一部分，见材料表）。将5×扩增缓冲液用DEPC处理水按1:5稀释，并避光保存至使用。在加入细胞前立即向溶液中加入1:80稀释的聚合酶（属于检测试剂的一部分，见材料表）。
   3. 向细胞中加入20 μL扩增反应溶液，覆盖塑料封膜，置于37 °C避光孵育1小时40分钟至2小时，以获得最大信号。
4. 成像前准备
   1. 在摇床上用Buffer B（配方见材料表）于室温洗涤细胞两次，每次10分钟。
   2. 最后在摇床上用0.01×Buffer B于室温洗涤细胞一次，持续2分钟。
   3. 加入含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂一滴，用手术刀片小心盖上盖玻片，压出形成的气泡。用透明指甲油沿边缘密封盖玻片。
   4. 在具备多焦平面成像能力的显微镜上对样本进行成像，例如激光扫描共聚焦显微镜或具有去卷积功能的倒置荧光显微镜，至少采集9个不同焦平面的图像。
      1. 以100倍放大倍数采集图像，z轴步进高度约为0.45 μm。PLA信号激发波长为550 nm，发射波长为570 nm；复染信号激发波长为650 nm，发射波长为670 nm；DAPI激发波长为405 nm，发射波长为450 nm。
   5. 为确保后续PLA事件分析中荧光背景信号和杂散光最小化（尤其在宽场显微镜上），应使用标准图像处理软件中的二维去卷积（最近邻）算法处理图像。
      注：Olympus系统使用CellSens软件，Nikon系统使用NIS-Elements软件，Leica系统使用LAS X软件，Zeiss系统使用ZEN软件，也可使用Metamorph、MATLAB、Huygens软件，以及Image-J平台提供的多种插件。分析时应使用Image-J软件统计所有z轴层面上的相互作用总数，并确保仅分析Pdx-1阳性细胞（见第3.5节）。
5. PLA相互作用的定量分析
   1. 打开免费的Image-J软件，载入PLA图像。从第一个清晰对焦的PLA图像开始分析。
   2. 点击图像选项卡，选择调整，然后选择阈值（图1A）。调整阈值以去除所有非特异性PLA信号，记录所用阈值参数，并在整个分析过程中保持一致。
   3. 点击处理选项卡，选择二值化，然后选择制作二值图像（图1B）。使用该二值图像进行颗粒分析：点击“分析”选项卡，选择分析颗粒（图1C）。
   4. 分析时确保设置如下：大小 = 0–无穷大，圆度 = 0–1.0，显示 = 轮廓，勾选显示结果和清除结果（图1D）。点击确定。在电子表格中记录样本名称、z轴层面位置及分析得到的颗粒数量。
   5. 重复步骤3.5.2–3.5.4，直至完成该样本所有清晰对焦z层面的分析。在电子表格中汇总该样本所有层面的颗粒总数，以量化总的相互作用数量。

结果

我们在 MIN6 胰岛β细胞系和 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞系中进行了初步实验，以优化并验证抗体的特异性以及所观察到的蛋白质相互作用。将 MIN6 细胞以每毫升 30,000 个细胞的密度接种于盖玻片上，贴壁培养 48 小时；SH-SY5Y 细胞以每毫升 15,000 个细胞的密度接种于盖玻片上，贴壁培养 24 小时。随后按照上述 PLA 实验方案，从步骤 1.2.3 开始进行。为确保 PLA 信号的特异性，我们首先在以下条件下进行了该实验：(i) 不加一抗（图 2A，图 3A）；(ii) 仅加入 NRDP1 抗体（图 2B，图 3B）；(iii) 仅加入 USP8 抗体（图 2C，图 3C）；以及 (iv) 同...

讨论

本文介绍了一种简单且高效的方法，利用NRDP1:USP8邻近连接技术（PLA）在特定组织或细胞中定量检测上游线粒体自噬复合物的形成。我们此前已通过多种方法（包括共免疫沉淀实验、无细胞相互作用研究以及体外和基于细胞的泛素化检测）证实了CLEC16A-NRDP1-USP8线粒体自噬复合物在胰腺β细胞中的形成，并阐明了该复合物如何调控线粒体自噬流^1,15。本文所报告和描述的PLA研究可快速、定量地以细胞特异性方式观察线粒体自噬通路，且该方法高度适用于人原代β细胞。此外，我们还证明NRDP1:USP8 PLA技术可拓展应用于β细胞生物学以外的体系，如SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞，表明该技术在神经元系统中监测线粒体自噬复合物同样具有潜在可行性。

PLA 是一种简单直接的方法；然而，该实验方案中的某些步骤对于获得清晰且特异的结果至关重要。这些步骤包括：（1）确保人胰岛的分散处理过程足够温和，以避免细胞裂解或损伤，从而优化成像效果；（2）在固定前以及洗涤过程中立即加入去泛素化酶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 1X	Life Technologies	25200-056
抗生素-抗真菌剂	Life Technologies	15240-062
封闭液	自制		使用 1X PBS，加入 10% 驴血清和 0.3% Triton X-100 去垢剂。
缓冲液 A	自制		配制 1L：将 8.8g NaCl、1.2g Tris 碱、500μL Tween-20 与 750mL ddH₂O 混合，用 HCl 调 pH 至 7.5，定容至 1L。过滤溶液后于 4°C 保存。实验前恢复至室温。
缓冲液 B	自制		配制 1L：将 5.84g NaCl、4.24g Tris 碱、26g Tris-HCl 溶于 500mL ddH₂O 中，调 pH 至 7.5，定容至 1L。过滤溶液后于 4°C 保存。实验前恢复至室温。
Cy5 标记的驴抗山羊二抗	Jackson Labs	705-175-147
检测试剂红	Sigma-Aldrich	DU092008-100RXN	试剂盒包含：连接反应液原液（5X）、连接酶、扩增反应液原液（5X）和聚合酶。
DuoLink PLA 探针 抗小鼠 MINUS	Sigma-Aldrich	DU092004-100RXN
DuoLink PLA 探针 抗兔 PLUS	Sigma-Aldrich	DU092002-100RXN
胎牛血清
山羊多克隆抗 PDX1 抗体（克隆 A17）	Santa Cruz	SC-14664	RRID: AB_2162373
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MIN6 胰腺细胞系	D. Stoffers 惠赠		小鼠胰岛素瘤细胞系，用于基于细胞的检测。
小鼠单克隆抗 USP8 抗体（克隆 US872）	Sigma-Aldrich	SAB200527
Pap-pen	Research Products International	195505
Parafilm 封口膜			用于密封细胞上的抗体和探针溶液，防止使用小体积溶液时发生蒸发。
PBT（含 Triton 的磷酸盐缓冲液）	自制		配制 50mL：43.5mL ddH₂O、5mL 10X PBS、0.5mL 10X BSA（100mg/mL 溶液）、1mL 10% Triton X-100 溶液（溶于 ddH₂O）
青霉素-链霉素（100X）	Life Technologies	15140-122
磷酸盐缓冲液，10X	Fisher Scientific	BP399-20
PIM(ABS) 人 AB 型血清	Prodo Labs	PIM-ABS001GMP
PIM(G)（谷氨酰胺）	Prodo Labs	PIM-G001GMP
PIM(S) 培养基	Prodo Labs	PIM-S001GMP
PR619	Apex Bio	A812
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂	Life Technologies (Molecular Probes)	P36935
兔多克隆抗 FLRF/RNF41（Nrdp1）抗体	Bethyl Laboratories	A300-049A	RRID: AB_2181251
SH-SY5Y 细胞	L. Satin 惠赠		人神经母细胞瘤细胞系，用于基于细胞的检测。
丙酮酸钠（100X）	Life Technologies	11360-070
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
用于 RNA 实验的水（DEPC 处理水）	Fisher Scientific	BP361-1L