利用邻近连接技术原位可视化人胰岛β细胞中的内源性线粒体自噬复合物

摘要

本方案概述了一种针对人原代胰岛样本中β细胞的线粒体自噬蛋白复合物形成进行定量分析的方法。该技术因而能够利用有限的生物材料进行线粒体自噬分析，这对于珍贵的人胰腺β细胞样本至关重要。

摘要

线粒体自噬是一种重要的线粒体质量控制通路，对胰岛β细胞的生物能量学至关重要，可为葡萄糖刺激的胰岛素分泌提供能量支持。评估线粒体自噬具有挑战性，通常需要遗传报告系统或多种互补技术，而这些技术难以应用于组织样本，例如原代人胰岛。本文中，我们展示了一种可靠的方法，用于在原代人胰岛中可视化并定量关键内源性线粒体自噬复合物的形成。通过利用灵敏的邻近连接技术检测线粒体自噬调控因子NRDP1与USP8之间的相互作用，我们能够原位特异性地定量关键线粒体自噬复合物的形成。将该方法与转录因子PDX1的复染相结合，可实现对β细胞内线粒体自噬复合物及其潜在抑制因素的特异性定量。本方法避免了其他蛋白质-蛋白质相互作用研究（如免疫共沉淀（IP）或质谱分析）所需的大量细胞提取物，特别适用于珍贵的人胰岛 样本——这类样本通常数量有限，难以满足上述技术的需求。此外，该方法无需通过流式分选技术从异质性胰岛细胞群中纯化β细胞，即可进行后续蛋白质分析。因此，我们描述了一种极具应用价值的线粒体自噬可视化方案，非常适合用于异质性且数量有限的细胞群体研究。

引言

胰腺β细胞产生维持正常葡萄糖稳态所必需的胰岛素，其功能障碍会导致所有类型的糖尿病。β细胞具有强大的线粒体功能，能够生成将葡萄糖代谢与胰岛素分泌相偶联所需的能量。近年来，研究发现维持功能性线粒体数量对β细胞的最佳功能至关重要^1,2,3。为了维持功能性线粒体数量，β细胞依赖质量控制机制来清除功能失调、受损或衰老的线粒体⁴。我们及其他研究团队此前已证实，β细胞依赖一种特殊的线粒体更新方式——线粒体自噬（mitophagy）——来维持啮齿类动物和人类胰岛中线粒体的质量控制^1,2,5。然而，遗憾的是，此前尚无简单方法可用于检测人类胰腺β细胞中的线粒体自噬过程或内源性表达的线粒体自噬相关组分。

我们最近发现，β细胞中线粒体自噬的上游调控依赖于由E3泛素连接酶CLEC16A和NRDP1以及去泛素化酶USP8组成的蛋白复合物的形成¹。已有研究分别表明，NRDP1和USP8通过作用于关键的线粒体自噬启动因子PARKIN来影响线粒体....

方案

使用去标识化的供体人胰岛经机构审查委员会（IRB）豁免批准，并符合密歇根大学IRB政策。人胰岛由美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIH/NIDDK）资助的整合胰岛分配项目（Integrated Islet Distribution Program, IIDP）提供。

1. 人胰岛样本制备

1. 单细胞解离
   1. 在添加了1 mM谷氨酰胺（PIM(G)）、100单位/毫升抗真菌-抗生素、1 mM丙酮酸钠和10%胎牛血清（FBS）或人AB血清的胰岛培养基（PIM(S)）中，于37 °C培养人胰岛样本（4000–6000胰岛当量/10毫升培养基）至少1天。
   2. 使用解剖显微镜在3倍放大倍数下对培养的人胰岛进行单个计数。每种处理/实验条件（如糖脂毒性）下挑选40个胰岛，置于含有胰岛培养基的1.5 mL离心管中。
   3. 将胰岛在400 x g条件下离心 g 在10 °C下离心1分钟以沉淀。
   4. 用含 50 μM PR619（去泛素化酶抑制剂；用于维持泛素依赖性蛋白质相互作用）的 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下轻轻倒置混匀，洗涤样品两次，每次洗涤之间以 400 × g 离心 g 10 °C 下持续 1 分钟。
   5. 用预热至37 °C、含50 μM PR619的125 μL 0.25%....

结果

我们在 MIN6 胰腺β细胞系和 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞系中进行了初步实验，以优化并验证抗体的特异性以及所观察到的蛋白质相互作用。将 MIN6 细胞以 30,000 个细胞/mL 的密度接种到盖玻片上，贴壁培养 48 小时；SH-SY5Y 细胞以 15,000 个细胞/mL 的密度接种到盖玻片上，贴壁培养 24 小时。随后按照上述 PLA 实验方案，从第 1.2.3 步开始进行。为确保 PLA 信号的特异性，我们首先在以下条件下进行了该实验：(i) 不加一抗（图 2A，图 3A）；(ii) 仅加入 NRDP1 抗体（图 2B，图 3B）；(iii) 仅加入 USP8 抗体（图 2C，图 3C）；以及 (iv).......

讨论

本文介绍了一种简单且高效的方法，利用NRDP1:USP8邻近连接技术（PLA）在特定组织或细胞中定量检测上游线粒体自噬复合物的形成。我们此前已通过多种方法（包括共免疫沉淀实验、无细胞相互作用研究以及体外和基于细胞的泛素化检测）证实了CLEC16A-NRDP1-USP8线粒体自噬复合物在胰腺β细胞中的形成，并阐明了该复合物如何调控线粒体自噬流^1,15。本文所报告和描述的PLA研究可快速、定量地以细胞特异性方式观察线粒体自噬通路，且该方法高度适用于人原代β细胞。此外，我们还证明NRDP1:USP8 PLA技术可拓展应用于β细胞生物学以外的体系，如SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞，表明该技术在神经元系统中监测线粒体自噬复合物同样具有潜在可行性。

PLA 是一种简单直接的方法；然而，该实验方案中的某些步骤对于获得清晰且特异的结果至关重要。这些步骤包括：（1）确保人胰岛的分散处理过程足够温和，以避免细胞裂解或损伤，从而优化成像效果；（2）在固定前以及洗涤过程中立即加入去泛素化酶.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 1X	Life Technologies	25200-056
抗生素-抗真菌剂	Life Technologies	15240-062
封闭液	自制		使用 1X PBS，加入 10% 驴血清和 0.3% Triton X-100 去垢剂。
缓冲液 A	自制		配制 1L：将 8.8g NaCl、1.2g Tris 碱、500μL Tween-20 与 750mL ddH₂O 混合，用 HCl 调 pH 至 7.5，定容至 1L。过滤溶液后于 4°C 保存。实验前恢复至室温。
缓冲液 B	自制		配制 1L：将 5.84g NaCl、4.24g Tris 碱、26g Tris-HCl 溶于 500mL ddH₂O 中，调 pH 至 7.5，定容至 1L。过滤溶液后于 4°C 保存。实验前恢复至室温。
Cy5 标记的驴抗山羊二抗	Jackson Labs	705-175-147
检测试剂红	Sigma-Aldrich	DU092008-100RXN	试剂盒包含：连接反应液原液（5X）、连接酶、扩增反应液原液（5X）和聚合酶。
DuoLink PLA 探针 抗小鼠 MINUS	Sigma-Aldrich	DU092004-100RXN
DuoLink PLA 探针 抗兔 PLUS	Sigma-Aldrich	DU092002-100RXN
胎牛血清
山羊多克隆抗 PDX1 抗体（克隆 A17）	Santa Cruz	SC-14664	RRID: AB_2162373
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MIN6 胰腺细胞系	D. Stoffers 惠赠		小鼠胰岛素瘤细胞系，用于基于细胞的检测。
小鼠单克隆抗 USP8 抗体（克隆 US872）	Sigma-Aldrich	SAB200527
Pap-pen	Research Products International	195505
Parafilm 封口膜			用于密封细胞上的抗体和探针溶液，防止使用小体积溶液时发生蒸发。
PBT（含 Triton 的磷酸盐缓冲液）	自制		配制 50mL：43.5mL ddH₂O、5mL 10X PBS、0.5mL 10X BSA（100mg/mL 溶液）、1mL 10% Triton X-100 溶液（溶于 ddH₂O）
青霉素-链霉素（100X）	Life Technologies	15140-122
磷酸盐缓冲液，10X	Fisher Scientific	BP399-20
PIM(ABS) 人 AB 型血清	Prodo Labs	PIM-ABS001GMP
PIM(G)（谷氨酰胺）	Prodo Labs	PIM-G001GMP
PIM(S) 培养基	Prodo Labs	PIM-S001GMP
PR619	Apex Bio	A812
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂	Life Technologies (Molecular Probes)	P36935
兔多克隆抗 FLRF/RNF41（Nrdp1）抗体	Bethyl Laboratories	A300-049A	RRID: AB_2181251
SH-SY5Y 细胞	L. Satin 惠赠		人神经母细胞瘤细胞系，用于基于细胞的检测。
丙酮酸钠（100X）	Life Technologies	11360-070
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
用于 RNA 实验的水（DEPC 处理水）	Fisher Scientific	BP361-1L