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方法文章

测量超极化[1-13C]丙酮酸的自旋-晶格弛豫磁化率随磁场的变化

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DOI：

10.3791/59399

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2019年9月13日

 ,  , 
1Department of Medical Biophysics, Western University, 2Imaging Research Laboratory, Robarts Research Institute, Western University, 3Ontario Institute for Cancer Research

本文内容

摘要

我们介绍了一种利用快速变场弛豫测量法测定通过动态核极化实现超极化的13C富集化合物的自旋-晶格弛豫时间随磁场变化的实验方案。具体而言，我们以[1-13C]丙酮酸为例进行了演示，但该方案可推广至其他超极化底物。

摘要

基本极限 体内 超极化成像应用 13C标记化合物的自旋-晶格弛豫时间有限，这是影响其性能的关键因素。多种因素会影响弛豫速率，例如缓冲液组成、溶液pH值、温度和磁场强度。就磁场而言，可在临床磁共振成像场强下测量自旋-晶格弛豫时间；但在较低磁场下，当这些化合物从极化器中释放并被输送至磁共振成像设备时，弛豫过程更快且难以测量。为了更准确地了解输送过程中磁化强度的损失量，我们采用了快速变场弛豫测量法，并结合磁共振检测技术 13在约0.75 T条件下对C核进行核磁共振，以测量超极化[1-13C]丙酮酸。采用溶解动态核极化技术制备浓度为80 mmol/L、生理pH值（约7.8）的超极化丙酮酸样品。将这些溶液迅速转移至快速场循环弛豫仪中，利用已校准的小翻转角（3°–5°）测量样品磁化弛豫随时间的变化。以实现对 T1 通过记录丙酮酸C-1在0.237 mT至0.705 T不同弛豫场强下的数据，我们确定了一个经验方程，用于估算该磁场范围内超极化底物的自旋-晶格弛豫。这些结果可用于预测运输过程中磁化强度的损失量，并优化实验设计以最大限度减少信号衰减。

引言

磁共振波谱成像（MRSI）能够生成通过波谱成像检测到的代谢物的空间分布图，但其实际应用常受限于相对较低的灵敏度。这种体内磁共振成像和波谱方法的低灵敏度源于在体温和合理磁场强度下所能达到的核磁化程度较小。然而，通过使用动态核极化（DNP）技术，可显著增强液体底物在体外的磁化水平，随后将其注入体内，结合MRSI用于探测体内代谢过程1,2,3,4。DNP能够增强大多数具有非零核自旋的原子核的磁化，已被用于将13C富集化合物（如丙酮酸5,6、碳酸氢盐7,8、延胡索酸9、乳酸10、谷氨酰胺11等）的体内MRSI灵敏度提高四个数量级以上12。其应用包括血管疾病成像13,14,15、器官灌注13,16,17,18、癌症检测1,19,20,21,22、肿瘤分期23,24以及治疗反应的定量评估2,6,23,24,25,26。

慢的自旋-晶格弛豫对于使用磁共振波谱成像（MRSI）进行活体检测至关重要。在溶液中的小分子内，具有低旋磁比的原子核其自旋-晶格弛豫时间（T1）可长达数十秒。多种物理因素会影响核自旋跃迁与其周围环境（晶格）之间的能量传递，从而导致弛豫，包括磁场强度、温度和分子构象27。在不含直接连接质子的碳位点上，分子内的偶极弛豫会减弱，而溶解介质的氘代可进一步降低分子间偶极弛豫。然而，氘代溶剂在延长活体弛豫方面作用有限。在高磁场强度下，由于化学位移各向异性，羰基或羧酸基团（如丙酮酸）可能发生更快的弛豫。在极化后的溶解过程中，若流体通路中存在顺磁性杂质，会导致快速弛豫，因此需避免此类杂质，或使用螯合剂将其去除。

在低磁场下，含13C 化合物的弛豫数据极为有限，而在此条件下自旋-晶格弛豫可能显著加快。然而，测量低场下的T1值对于理解用于活体成像的造影剂在制备过程中的弛豫行为至关重要，因为超极化对比剂通常是在接近或处于地磁场条件下从动态核极化（DNP）装置中释放的。其他物理因素，如13C富集底物浓度、溶液 pH 值、缓冲体系和温度，也会影响弛豫过程，从而影响造影剂的配方设计。所有这些因素在优化 DNP 溶解过程的关键参数确定中均起着重要作用，同时也关系到从 DNP 装置将样品转运至成像磁体过程中信号损失程度的计算。

核磁共振色散（NMRD）测量，即作为磁场函数的 T1 测量，通常使用核磁共振波谱仪进行。为了获取这些测量数据，可采用一种穿梭方法：首先将样品移出波谱仪，在由磁体边缘磁场决定的某一磁场中进行弛豫28,29,30，然后迅速将其转移回核磁共振磁体中，以测量其剩余磁化强度。通过在相同磁场位置重复此过程但逐渐延长弛豫时间，可以获得一条弛豫曲线，进而分析该曲线以估算 T1。

我们采用一种称为快速场循环弛豫测量法的替代技术31,32,33 以获取我们的NMRD数据。我们对一台商用场循环弛豫仪进行了改装（见 材料表），用于 T1 含有超极化物质的溶液的测量 13C核。与穿梭法相比，场循环技术使该弛豫仪能够在较窄的磁场范围内（0.25 mT至1 T）系统地获取NMRD数据。这是通过快速改变磁场本身而非样品在磁场中的位置来实现的。因此，样品可在高磁场强度下磁化， "在较低磁场强度下使样品“弛豫”，然后在固定磁场（及拉莫尔频率）下通过采集自由感应衰减信号来检测，以最大化信号强度。这意味着可在测量过程中控制样品温度，且无需在每个弛豫磁场下重新调节核磁共振探头，从而实现整个磁场范围内数据的自动采集。

本文聚焦于在低磁场条件下分配和运输超极化溶液的影响，提出了一种利用快速变场弛豫仪测量超极化13C-丙酮酸在0.237 mT至0.705 T磁场范围内自旋-晶格弛豫时间的详细方法。该方法的主要研究成果此前已应用于[1-13C]丙酮酸34以及13C富集的碳酸氢钠和碳酸氢铯35，并在这些研究中探讨了自由基浓度和溶解pH等其他因素的影响。

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方案

1. 样品制备

注意：步骤 1.1-1.8 仅执行一次

  1. 制备1 mL储备液 13C-标记的丙酮酸溶液，广泛用于 体内 研究1,2,5,6，由15 mmol/L的三芳基甲基自由基溶解于[1-13C]丙酮酸（参见 材料表). 将从此储备液中取等分试样，用于各个单独极化的样品，并在不同磁场下进行弛豫测量。[1-13C]丙酮酸分子如图所示 图1.
  2. 在动态核极化仪软件界面上（参见 材料表），点击 冷却 按钮用于降低可变温度插件（VTI）的温度至1.4 K。
  3. 当DNP达到设定温度后，取10 µL储备液加入样品杯中，打开转塔门，使用专为此操作设计的插入棒将样品杯置入VTI中。
  4. 随后，迅速抽出探杆并确保样品杯已释放。然后关闭转塔门，在VTI温度恢复至1.4 K的同时，继续执行后续步骤。
  5. 准备DNP以进行微波扫描，从而确定用于对储备溶液进行超极化的最佳射频频率。
    1. 在控制波谱仪（DNP 系统的一部分）的计算机上，通过双击已预先配置好适当串行通信参数的 HyperTerminal 图标，建立波谱仪与 DNP 控制软件之间的通信。
    2. 通信建立后，启动 RINMR 软件，在其命令行中输入 .HYPERSENSENMR，然后按压 进入.
    3. 随后，屏幕上将显示一个新窗口，在该窗口中输入数字1（1） 配置编号 领域。然后，点击 选择配置 按钮。
    4. 点击按钮 进行微波扫描将启动一个带有倒计时秒数的小窗口，表明光谱仪已准备就绪，并等待来自DNP控制软件的周期性触发信号以采样极化。
    5. 在DNP控制软件中，选择 校准 标签，然后单击 生成 按钮。
    6. 在校准设置窗口中输入以下信息：起始频率 = 94.117 GHz，终止频率 = 94.137 GHz，步长 = 1 MHz，每步持续时间 = 300 s，功率 = 50 mW，液氦液位 = 65%，温度 = 1.4 K。
    7. 点击按钮 生成，这将关闭设置窗口并返回到 校准 将显示执行所需微波扫描的步骤数和所需时间的选项卡。
    8. 当达到所需的VTI温度后，单击 启用 按钮，然后 开始 启动微波扫描过程。     
  6. 微波扫频结束后，回收样品并记录实现最大极化的最佳频率。该最佳频率定义为可提供最大极化的极化频率，如图所示 图2该频率将用于对该特定批号的丙酮酸储备液所获得的所有等分试样进行超极化。
  7. 使用去离子水配制 250 mL 储备溶解介质，其中含 40 mmol/L Tris 碱、50 mmol/L 氯化钠和 80 mmol/L 氢氧化钠。加入乙二胺四乙酸（EDTA），使其终浓度为 100 mg/L，以螯合可能存在的金属离子污染。与丙酮酸钠储备溶液类似，该溶解介质将用于所有待极化的不同样品。参见 材料表 有关所用化学品的更详细信息。
  8. 同时，配制500 mL储备清洗液，其中含100 mg/L EDTA溶于去离子水中。每次极化后，约使用10 mL该清洗液清洗DNP的溶出通路。
    注意：步骤 1.9–1.27 需对每个单独样品分别进行。
  9. 将DNP装置冷却至1.4 K，以准备对[1-13C]丙酮酸样品，通过按压 冷却 DNP 主窗口中的按钮
  10. 如果用于光谱仪的软件已处于运行状态并完成配置 1 已选择，则继续执行以下步骤；否则，先执行步骤 1.5.1 至 1.5.3，然后继续执行以下步骤。
  11. 在确认配置后 1 在控制DNP波谱仪的窗口中选择，然后单击 固体堆积 按钮
  12. 输入文件名 SSBuilupXXX，其中“XXX”为存储累积数据文件序列中的编号，该编号由软件自动递增。然后点击 好的与微波扫描情况类似，将弹出一个带有倒计时秒数的小窗口，表明波谱仪已准备就绪，并正在等待来自DNP控制软件的周期性触发信号，以采样极化信号。
  13. 使用步骤1.1中配制的丙酮酸-OX063储备溶液，在样品杯中称取30 mg。
  14. 当达到目标 VTI 温度（1.4 K）时，点击 插入样本，然后选择 正常样本 然后点击 下一步按照屏幕上显示的安全注意事项，使用专为此任务设计的长柄工具将样品杯插入低温DNP设备中。
  15. 杯子插入、探头移除且DNP舱门关闭后，点击 下一步 然后 完成此时，超极化系统将样品杯降至部分充满（65%）液氦的辐照室中。
  16. 等待温度回升至1.4 K，然后点击 极化样品 按钮。
  17. 在新弹出的窗口中，将频率值设置为步骤1.6中微波扫描获得的数值。在同一窗口中，将功率设置为50 mW，采样时间设置为300 s。点击 下一步，检查 启用积聚监测 盒，然后单击 完成.
    注意：一旦极化开始，DNP 控制软件每 300 秒生成一次触发信号，指示波谱仪使用小翻转角采样极化状态。通过这种方式，波谱仪软件会向固态磁化曲线添加一个采样点，该曲线当前同时在波谱仪软件以及 DNP 控制软件的标签页中显示 偏振建立在第4个样本及之后的每个样本中，光谱仪软件将曲线拟合为指数增长函数，其形式为：

    S = A *exp(-t/Tp) + y0

    其中 A 为偏振幅度，单位为任意单位， t 是采样时间， Tp 是极化时间常数（单位均为秒），且 y0 是一个偏移量。根据拟合参数，软件还会计算至此时刻为止所达到的极化百分比，该数值同样显示在 DNP 的极化状态选项卡中。
  18. 极化至固态磁化强度达到最大值的至少95%（约一小时）。
  19. 在样品极化的同时，按照下文第2节所述准备快速场循环弛豫仪。
  20. 当达到所需的偏振状态时，单击 运行溶出度测试 以及在……之下 方法，选择 丙酮酸测试然后，单击 下一步.
  21. 根据屏幕上的指示，打开DNP转塔门，将1.5节中配制的溶出介质约4.55 mL加入仪器顶部的加热加压室中，使样品溶解后形成浓度为80 mmol/L丙酮酸盐的溶液，pH约为7.75，温度约为37 °C。
  22. 将回收棒置于正确位置，关闭炮塔门，然后在计算机上点击 下一步 然后在 完成此时，溶解介质将被过热，直至压力达到10 bar。
  23. 当达到10 bar压力后，冷冻且超极化的丙酮酸盐会自动从液氦浴中升起，迅速与过热的溶解液混合并融化，随后通过毛细管被喷射至梨形瓶中。在超极化丙酮酸盐与溶解液混合物喷射过程中，应持续旋转摇动梨形瓶，以确保混合均匀。
  24. 当所有混合物被完全推出后，迅速用注射器吸取1.1 mL液体，转移至预热（37 °C）的10 mm直径核磁共振管中，并快速送至场循环弛豫仪（见步骤2.2.12）。
  25. 将每份丙酮酸溶解液的剩余等分试样加入0.55-T台式核磁共振波谱仪中（参见 材料表以检测可能存在的系统性实验效应。
  26. 立即使用干净的溶出介质清洗DNP流路，随后用乙醇冲洗。通入氦气吹扫流路，以去除残留的清洗液并排除流路中的氧气。清洗所有玻璃器皿。
  27. 每次测量后，记录台式光谱仪和现场循环弛豫仪所测样品的 pH 值。
    注意：每个 T1 测量过程是从DNP装置中独立进行的超极化溶解，因此必须注意确保样品成分在不同测量之间的可重复性。这通过使用0.1 mg的精度称量所有试剂和溶剂来实现，以保证最终超极化溶液制备的准确性和可重复性。

2. 弛豫测量

注意：请参见表1，以更好地理解后续步骤中所述不同参数的选择与使用。在溶解前，必须计算弛豫仪的翻转角，并设置好弛豫仪，使其处于可测量超极化溶液的状态（见下文）。

  1. 翻转角校准
    1. 在核磁共振管中准备1 mL纯的[1-13C]丙酮酸，并加入钆对比剂，以将13C核的T1弛豫时间缩短至小于200 ms但大于50 ms的范围内。
    2. 密封核磁共振管，以便可多次用作校准标准品。
    3. 使用弛豫仪的深度规，调节核磁共振管的插入深度，使其样品位于弛豫仪射频线圈的中心位置。
    4. 用胶带标记13C丙酮酸校准标准品的插入深度，以确保重复性。
    5. 将深度限位器置于核磁共振管上由胶带标示的位置，并将该校准标准品插入场循环弛豫仪的孔道中。使用重物固定核磁共振管的位置。
    6. 打开仪器气阀，并通过弛豫仪前面板将温度控制器设置为37 °C。实验过程中将利用加热空气维持样品温度在37°C（±0.5°C）。
    7. 设置场循环弛豫仪硬件以采集13C核信号。包括安装并激活外部匀场线圈（参见材料表），将射频线圈调谐和匹配至8 MHz（约对应13C核的0.75 T磁场），并使用合适的λ/4电缆。
    8. 在仪器软件中执行以下步骤：
      1. 选择主参数标签页
      2. 点击标签实验旁边的单元格，在弹出窗口中向下滚动并选择脉冲序列“13CANGLE.FFC”。
      3. 设置以下采集参数：RFA = 5；SWT = 0.005，RD = 0.5，BPOL = 30 MHz，TPOL = 0.5。
      4. 选择采集参数标签页，然后选择基本子标签页。
      5. 点击标签核种旁边的单元格，在弹出窗口中向下滚动并选择13C。
      6. 然后设置以下参数：SF = 8 MHz，SW = 1000000，BS = 652，FLTR = 100000，MS = 32。
      7. 选择配置子标签页。
      8. 设置以下参数：RINH = 25，ACQD = 25。
      9. 选择nDim子标签页
      10. 设置NBLK = 32，BINI = 2，BEND = 62。
      11. 选择评估标签页，然后选择参数子标签页。
      12. 设置以下参数：EWIP = 10，EWEP = 128，EWIB = 1，EWEB = 32。
      13. 然后点击开始采集图标以运行脉冲序列。
    9. 采集完成后，保存数据，选择评估对话框图标，并从分析菜单中选择WAM窗口：绝对幅值。然后选择报告表、图表和导出文件，最后点击执行。
    10. 在报告窗口中找到提供最大幅值的射频脉冲宽度，并借助显示图中光标对该值进行微调，该图类似于图3底行所示的曲线图。此脉冲宽度将用于后续实验的PW90参数。
    11. 点击F1图标以调整弛豫仪的频率偏移。
      注：WAM窗口：绝对幅值是一种积分单次或一系列自由感应衰减（FID）信号幅值的程序，积分范围从由EWIP定义的点到由EWEP指定的点，以及从由EWIB定义的块到由EWEB指定的块。
  2. T1测量
    1. 确保外部匀场线圈已安装并通电。
    2. 在仪器软件中执行以下步骤：
      1. 选择主参数标签页
      2. 点击标签实验旁边的单元格，在弹出窗口中向下滚动并选择脉冲序列HPUB/S，如图4所示。
      3. 设置以下采集参数：RFA = 25，T1MX = 3至5之间的值；SWT = 0.2，RD = 0，BRLX = 所需的弛豫场（以MHz表示，即质子拉莫尔频率）。
      4. 选择采集参数标签页，然后选择基本子标签页。
      5. 点击标签核种旁边的单元格，在弹出窗口中向下滚动并选择13C。
      6. 然后设置以下参数：SF = 8 MHz，SW = 1000000，BS = 652，FLTR = 50000。
      7. 选择配置子标签页。
      8. 设置以下参数：PW90等于步骤2.1.10中确定的值，RINH = 25，ACQD = 25。
      9. 选择脉冲子标签页并设置PW = 5。
      10. 选择nDim子标签页并设置NBLK = 100。
      11. 等待并准备接收超极化溶液以启动数据采集。
      12. 在将样品插入弛豫仪之前，立即从控制台手动启动脉冲序列，以避免将样品插入零磁场中。因此，在数据分析时必须忽略第一个自由感应衰减（FID）信号。
      13. 采集完成后，点击保存按钮保存数据。
    3. 使用分析软件对每个FID信号的幅值进行积分，生成一组随时间变化的样品磁化强度数据序列。
    4. 采用商业分析软件中实现的标准非线性最小二乘拟合算法（参见材料表），假设所有数据点权重相等，根据三参数指数模型提取自旋-晶格弛豫时间：
      核磁共振波谱分析信号方程，公式包含指数衰减和三角函数项。
      其中A为初始信号幅值（y轴截距），T1为自旋-晶格弛豫时间，TR为重复时间（已知值），y0为信号偏移量，cos(n-1)(α)为第n次测量时翻转角α引起的纵向磁化损失的校正项。

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结果

图2展示了丙酮酸的高分辨率全范围微波扫描示例。在本示例中，最佳微波频率为94.128 GHz，图中插图部分已对此进行标示。我们的DNP系统通常可在93.750 GHz至94.241 GHz范围内工作，步长为1 MHz，极化时间最长可达600 s，功率最高为100 mW。全频率范围的扫描仅针对新型底物进行。然而，基于以往对13C-丙酮酸的经验，我们预计最佳频率约为94.127 GHz。因此，通常采用94.117 GHz至94.137 GHz的扫描范围，步长为1 MHz，采样时间为300 s，功率为50 mW。

左栏 图3 呈现了[1-13C]丙酮酸，该过程涉及获取一系列信号测量值，这些测量值随线性变化的射频脉冲持续时间而变化，以确定对应于90°和180°翻转角的脉冲宽度 13C核。产生最大振幅的脉冲宽度对应90°翻转角，而零交叉点对应180°翻转角。这两个脉冲宽度之间的关系应为两倍。

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讨论

使用动态核极化（DNP）增强信号采集，是针对动物注射所用的低浓度13C核磁共振信号不足问题的一种技术解决方案，但同时也带来了其他实验挑战。每项如图7所示的弛豫时间测量均来自一个独立制备的样品，因为样品在溶解后无法再次极化以进行重复测量。这不可避免地导致实验变异性，其来源包括样品称量和溶解介质配制过程中的微小差异，或溶解过程本身的波动，例如样品未能完全提取或与溶解介质混合不充分。这种变异性可通过在弛豫测量后测定每份丙酮酸溶液的pH值进行部分评估。尽管在将丙酮酸/自由基混合物和溶解介质装入DNP装置前，我们已将其称量精度控制在优于1毫克的水平，但在实验中测得的pH值仍介于5.5至8.3之间。因此，我们选择舍弃pH值不在7.6至8.0范围内的所有T1数据。

如上所述，每个样品的固态极化水平至少达到95%，该水平约在1小时内获得。未对每个样品的液态极化水平进行单独测定；然而，使用相同样品制备方法对DNP系统进行的定期质量保证测试显示，液态极化水平约为15%。

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致谢

作者感谢安大略癌症研究所影像转化项目以及加拿大自然科学与工程研究理事会对本研究的资金支持。我们还感谢与加拿大安大略省通用电气医疗集团的Albert Chen、意大利Stelar s.r.l.公司的Gianni Ferrante以及英国Oxford Instruments公司的William Mander进行的有益讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
[1-13C]丙酮酸Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA677175
10 mm NMR 管Norell, Inc., Morganton NC, USA1001-8
去离子水
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAE5134
HyperSense 动态核极化仪Oxford Instruments, Abingdon, UK包含以下组件："DNP-NMR Polarizer" 软件，用于控制和监控整个 DNP 极化仪；"RINMR" 软件，用于监测固态极化水平；"HyperTerminal" 软件，用于实现 DNP 软件与监测固态极化水平的 RINMR 软件之间的通信。还包括 MQC 台式波谱仪，配合其自身的 RINMR 软件用于监测液态极化状态
MATLAB R2017bMathWorks, Natick, MA包含用于对随时间变化的磁化衰减进行非线性拟合以及对超极化丙酮酸进行 T1 NMRD 分析的脚本
OX063 三芳基甲基自由基Oxford Instruments, Abingdon, UK
pH 计 - SympHanyVWR International, Mississauga, ON., CanadaSB70P
ProHanceBracco Diagnostics Inc.钆特醇（Gadoteridol），Gd-HP-DO3A
纯乙醇（100% 纯度）Commercial Alcohols, Toronto, ON, CanadaP016EAAN
匀场线圈自主研发
氯化钠Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAS7653
氢氧化钠Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAS8045 
SpinMaster FFC2000 1T C/DCStelar s.r.l., Mede (PV) Italy包含软件 "AcqNMR"，用于设定实验参数、监测射频线圈的调谐与匹配、加载不同脉冲序列、校准翻转角、数据采集和曲线拟合等其他功能。还包括一个深度计、若干配重和一个深度限位器
Trizma 预设晶体（pH 7.6）Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAT7943

参考文献

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13 T1 DNP
测量超极化[1-13C]丙酮酸的自旋-晶格弛豫磁化率随磁场的变化
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