该调理吞噬杀伤试验用于比较吞噬性免疫细胞在不同处理和/或条件下对细菌的应答及杀伤能力。传统上，该试验作为评估针对细菌产生的抗体作为调理素时其效应功能的金 标准。
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摘要
摘要
宿主对细菌定植的免疫反应中一个关键环节是吞噬作用。吞噬细胞杀伤试验（OPKA）是一种实验方法，其中将吞噬细胞与细菌单元共同培养。免疫细胞会以补体依赖的方式吞噬并杀灭细菌培养物。免疫介导的细胞杀伤效率受多种因素影响，可用于比较不同细菌培养物在抵抗细胞死亡方面的差异。通过这种方法，可评估潜在免疫疗法针对特定细菌菌株和/或血清型的效果。在本方案中，我们描述了一种简化的OPKA方法，该方法利用基础培养条件和细胞计数，来测定在与处理条件及HL-60免疫细胞共培养后细菌细胞的存活能力。该方法已成功应用于多种不同的肺炎链球菌血清型、有荚膜和无荚膜菌株以及其他细菌种类。本OPKA方案的优点在于其操作简便、适用范围广（该试验不仅限于将抗体作为调理素），并且能够最大限度地减少时间和试剂消耗，以评估基本的实验组别。
引言
调理吞噬杀伤试验（OPKA）是一种关键工具，用于将细菌结构或功能的改变与随之发生的免疫反应及功能变化联系起来。因此，该试验常作为补充性检测方法，用于确定抗体治疗、疫苗候选物、酶优化等基于免疫的疗效。尽管体内试验对于确定细菌感染模型中的有效清除或保护作用是必需的，但OPKA可在最基本的组分层面上评估免疫对细菌细胞死亡的贡献：即细菌、免疫细胞和实验处理。先前的研究表明，OPKA可经过修改后适用于多种细菌及血清型，包括Streptococcus pneumoniae1、Staphylococcus aureus2、Pseudomonas aeruginosa3。此外，这些优化后的试验还可用于评估不同的实验处理，例如评估某种酶是否能增强细菌对补体介导免疫细胞的可及性4，以及抗体治疗是否可改善调理作用5。经典研究表明，OPKA试验在基础研究和临床研究环境中已被成功用作病原体特异性抗体诱导保护作用的有力指标6,7,8,
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方案
1. HL-60 细胞的培养、分化与鉴定
- 准备HL-60细胞培养基，包含500 mL含L-谷氨酰胺的RPMI培养基和50 mL热灭活的胎牛血清。不要添加抗生素，因为这可能影响HL-60细胞的分化。
- 为了传代/维持HL-60细胞，将5 × 106个细胞接种于10 mL HL-60细胞培养基中，置于75 cm2通气培养瓶内，在37 °C、5% CO2条件下培养。每3−4天传代一次，以维持最佳细胞浓度。
注意：细胞浓度不应超过5 × 106/mL。 - 通过将约1 × 106个细胞/mL的HL-60细胞分装至含10%二甲基亚砜（DMSO）的HL-60培养基中，并转移至1 mL冻存管，制备工作细胞库。
注意：工作细胞库可保存于-80 °C；主细胞库应保存于-120 °C。 - 将1.5 × 107个HL-60细胞接种于15 mL含0.6% N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的HL-60细胞培养基中，在37 °C、5% CO2条件下，使用无菌滤帽的75 cm2培养瓶培养3天，以诱导细胞分化，用于后续OPKA实验。
- 通过检测细胞活力和细胞表面标志物，并依据已建....
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结果
在开始 OPKA 之前，应验证 HL-60 细胞的分化情况。可通过流式细胞术检测细胞表面 CD11b、CD35、CD71 和 annexin V 的表达水平（图1）。也可使用碘化丙啶（propidium iodide）作为细胞活力标记物。经 DMF 处理 3 天后，CD35 的表达应升高（所有细胞中 ≥55%），CD71 的表达应降低（所有细胞中 ≤20%）。annexin V 阳性细胞与碘化丙啶（PI+）细胞的总比例应 <35%，以确保足够的细胞活力。若上述比例未达到最低要求，应按照讨论部分所述调整培养条件。
步骤 6.5 获得的菌落形成单位（CFU）数量可用于比较不同组别相对于未经处理的对照组（100% 细胞存活率）的细菌细胞存活情况，如图 2所示。例如，未接受处理但与 HL-60 细胞共培养的孔中获得的平均菌落数量，应与未接受处理且未与 HL-60 细胞共培养的细胞数量相近，这表明细胞存活率为 100%，即细胞死亡率为 0%。在有效处理条件下，HL-60 共.......
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讨论
OPKA 在评估疫苗诱导的抗体介导免疫反应中具有重要作用6,8。这种简化的 OPKA 的主要意义在于其可适应待测条件（如抗体、酶处理等）的灵活性。因此，该检测不仅可用于测试调理素（如抗体）在吞噬作用中的贡献，还可用于评估克服通常抑制吞噬通路的毒力因子（如荚膜多糖）的方法。通过减少多重 OPKA 中通常所需的步骤数量，可有效降低因技术误差影响实验结果的可能性，并减少为获得可用数据所需进行的故障排查和优化工作。由于本方案适用于多种处理条件的变化，因而具有很高的灵活性。
在进行OPKA实验之前，预先建立检测体系，包括HL-60细胞的培养以及细菌菌种的制备，对于避免实验过程中额外的优化步骤至关重要。必须投入足够时间确保所有试剂和细胞类型在实验开始前均已准备就绪并具备正常功能。这些准备工作包括：在培养条件下扩增HL-60细胞系（约两周时间），验证特定浓度的二甲基甲酰胺（DMF）能否有效诱导HL-60细胞分化（约一周时间），以及制备无污染且经优化的细菌菌液稀释液（约两周时间）。.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢阿拉巴马大学伯明翰分校的 Moon Nahm 博士在我们实验室建立 OPKA 检测方法过程中提供的宝贵帮助。本研究由美国国立卫生研究院基金 1R01AI123383-01A1 资助，项目负责人：FYA。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Annexin V（APC 标记） | BioLegend | 640919 | |
| 抗人 CD35 抗体（PE 标记） | BioLegend | 333405 | |
| 抗人 CD71 抗体（PE 标记） | BioLegend | 334105 | |
| 拟使用的细菌菌株（例如，Streptococcus pneumoniae, WU2） | 细菌呼吸道参考实验室（Moon Nahm 博士） | ||
| 血琼脂平板 | Hardy Diagnostic | A10 | |
| 胎牛克隆血清 | HyClone | SH30080.03 | |
| 甘油 | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 细胞 | ATCC | CCL-240 | |
| IgG 同型对照（PE 标记） | BioLegend | 400907 | |
| N,N-二甲基甲酰胺（DMF） | Fisher Chemical | UN2265 | |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4864 | |
| 含 L-谷氨酰胺的 RPMI 培养基 | Corning | 10-040-CV |
参考文献
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al.
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