该调理吞噬杀伤试验用于比较吞噬性免疫细胞在不同处理和/或条件下对细菌的应答及杀伤能力。传统上，该试验作为评估针对细菌产生的抗体作为调理素时其效应功能的金 标准。
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摘要
摘要
宿主对细菌定植的免疫反应中一个关键环节是吞噬作用。吞噬细胞杀伤试验（OPKA）是一种实验方法，其中将吞噬细胞与细菌单元共同培养。免疫细胞会以补体依赖的方式吞噬并杀灭细菌培养物。免疫介导的细胞杀伤效率受多种因素影响，可用于比较不同细菌培养物在抵抗细胞死亡方面的差异。通过这种方法，可评估潜在免疫疗法针对特定细菌菌株和/或血清型的效果。在本方案中，我们描述了一种简化的OPKA方法，该方法利用基础培养条件和细胞计数，来测定在与处理条件及HL-60免疫细胞共培养后细菌细胞的存活能力。该方法已成功应用于多种不同的肺炎链球菌血清型、有荚膜和无荚膜菌株以及其他细菌种类。本OPKA方案的优点在于其操作简便、适用范围广（该试验不仅限于将抗体作为调理素），并且能够最大限度地减少时间和试剂消耗，以评估基本的实验组别。
引言
调理吞噬杀伤试验（OPKA）是一种关键工具，用于将细菌结构或功能的改变与随之发生的免疫反应及功能变化联系起来。因此，该试验常作为补充性检测方法，用于确定抗体治疗、疫苗候选物、酶优化等基于免疫的疗效。尽管体内试验对于确定细菌感染模型中的有效清除或保护作用是必需的，但OPKA可在最基本的组分层面上评估免疫对细菌细胞死亡的贡献：即细菌、免疫细胞和实验处理。先前的研究表明，OPKA可经过修改后适用于多种细菌及血清型，包括Streptococcus pneumoniae1、Staphylococcus aureus2、Pseudomonas aeruginosa3。此外，这些优化后的试验还可用于评估不同的实验处理，例如评估某种酶是否能增强细菌对补体介导免疫细胞的可及性4，以及抗体治疗是否可改善调理作用5。经典研究表明，OPKA试验在基础研究和临床研究环境中已被成功用作病原体特异性抗体诱导保护作用的有力指标6,7,8,9。
可用于评估调理吞噬杀伤作用的免疫细胞类型有多种。其中一种常用的吞噬细胞群体是HL-60人白血病细胞系。该细胞系在培养中可维持为未活化的早幼粒细胞状态；然而，通过不同药物处理可将其诱导分化为多种活化状态10,11。使用N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide）处理HL-60细胞，可使其分化为具有强吞噬活性的活化中性粒细胞11。尽管HL-60细胞已被优化并常用于此类吞噬实验10，但也可使用其他原代多形核白细胞作为实验中的免疫效应细胞12。
此外，这些检测方法可以简化13或进行多重化14，以同时检测多种耐抗生素的细菌菌株。随着能够高效计数琼脂平板上每个点的细菌菌落形成单位（CFUs）的软件的开发，多重化方法已变得更加可行15。本文中，我们描述了一种简化的实验方法，使用一种细菌菌株、HL-60 细胞、幼兔补体和血琼脂平板。利用该方法，可快速评估多种处理条件，从而回答有关如何调控针对细菌感染的先天免疫反应的具体研究问题。
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方案
1. HL-60 细胞的培养、分化与鉴定
- 准备HL-60细胞培养基，包含500 mL含L-谷氨酰胺的RPMI培养基和50 mL热灭活的胎牛血清。不要添加抗生素，因为这可能影响HL-60细胞的分化。
- 为了传代/维持HL-60细胞，将5 × 106个细胞接种于10 mL HL-60细胞培养基中，置于75 cm2通气培养瓶内，在37 °C、5% CO2条件下培养。每3−4天传代一次，以维持最佳细胞浓度。
注意：细胞浓度不应超过5 × 106/mL。 - 通过将约1 × 106个细胞/mL的HL-60细胞分装至含10%二甲基亚砜（DMSO）的HL-60培养基中，并转移至1 mL冻存管，制备工作细胞库。
注意：工作细胞库可保存于-80 °C；主细胞库应保存于-120 °C。 - 将1.5 × 107个HL-60细胞接种于15 mL含0.6% N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的HL-60细胞培养基中，在37 °C、5% CO2条件下，使用无菌滤帽的75 cm2培养瓶培养3天，以诱导细胞分化，用于后续OPKA实验。
- 通过检测细胞活力和细胞表面标志物，并依据已建立的流式细胞术方案16,17,18,19，验证HL-60细胞是否成功分化并适用于OPKA检测。分化完成后，收集HL-60细胞，并将约1 × 104个细胞用荧光标记的CD71、CD35、annexin V和碘化丙啶抗体/染料进行染色。
注意：根据已建立的验证方案14，分化后的细胞应具有≥65%的存活率、≥55%的CD35+细胞比例，以及≤20%的CD71+细胞比例（图1）。
2. OPKA 缓冲液和试剂的制备
- 通过将42.5 mL无菌含Ca2+/Mg2+的1×磷酸盐缓冲液（PBS）、5 mL热灭活的胎牛血清和2.5 mL 0.1%无菌明胶混合，配制50 mL无菌调理缓冲液B（OBB）。4 °C保存。
- 获取幼兔补体，并于-80 °C保存。
- 获取或制备细菌培养平板（即15 × 100 mm2 5%绵羊血琼脂平板）。
3. 细菌储备样品的制备
- 获取待检测的细菌菌株储备液。
注意：本实验方案使用 3 型肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae WU2，由 Moon Nahm 博士惠赠）。 - 将细菌菌株在适当的液体培养基中（本实验中 WU2 菌株使用含 0.5% 酵母提取物的 Todd-Hewitt 肉汤）于 37 °C 培养约 2−4 小时。
注意：培养物在 600 nm 处的光密度（OD600）应介于 0.6 至 0.8 之间。 - 在 6,000 × g 离心 2 分钟以沉淀细菌，然后将菌体重新悬浮于 10−30 mL 含 15% 甘油的适当培养基中。将细菌培养物按每份 500 µL 分装至无菌的 1.5 mL 离心管中，并于 -80 °C 保存。
- 在 37 °C 水浴中解冻一管细菌储备液。在无菌条件下离心收集菌体，并将其重新悬浮于 500 µL OBB 中。
- 用 OBB 对细菌储备液进行不同梯度稀释（例如：未稀释液 10 µL、1:10 稀释液 10 µL、1:100 稀释液 10 µL 等）。按照下述方法（第 4–6 节，包括 HL-60/补体共培养）使用不同稀释度的未经处理的细菌储备液进行 OPKA 实验。将平板于 30 °C 过夜培养（无需 CO2）。
注意：30 °C 是针对 WU2 菌株防止过度生长的特定温度；其他菌株或血清型可能在 37 °C 下生长最佳。 - 计数未经处理的细菌储备液与 HL-60 细胞及补体共培养后各稀释度的菌落。确定哪个稀释度可产生适宜计数的菌落数量（未经处理的细菌与 HL-60 细胞共培养时，理想菌落数约为 80−120 CFUs）。记录该稀释度，供后续使用该细菌储备液进行 OPKA 实验时参考。
4. 细菌处理与培养
- 解冻在步骤 3.3 中制备的一管细菌储备液。离心收集菌体（6,000 × g，2 分钟），并根据步骤 3.6 确定的最佳稀释比例，将菌体沉淀重悬于 OBB 中。
- 在圆底 96 孔细胞培养板的每孔中加入 10 µL 重悬后的细菌稀释液。
- 向每个实验孔中分别加入 20 µL 相应的抗体或药物处理液，每个样本设两个复孔。
注意：在本实验方案中，使用小鼠来源的血清型特异性抗体作为处理 X，使用已知可降解 3 型多糖荚膜的糖苷水解酶作为处理 Y（图 2）4,20。对照孔则根据处理孔所用缓冲液，使用 1× PBS 或 OBB。 - 将样品板在室温下以约 90 rpm 振荡 1 小时。根据所测试处理物的最佳温度或振荡条件，可对这些条件进行调整。
5. HL-60 细菌共培养
- 通过收集经DMF处理三天前的HL-60分化细胞（参见步骤1.4），将其转移至15 mL圆锥形离心管中制备HL-60细胞。离心沉淀细胞（500 x g，3 分钟），弃去上清液，并用至少 10 mL 的 1x PBS 洗涤。
- 离心收集洗涤后的细胞（500 × g） g，3 分钟），弃去上清液，将细胞重悬于 OBB 中（起始使用 1 mL OBB，并调整至终浓度为 1 × 107/mL（细胞计数后）
- 加入幼兔补体（无菌、未稀释的幼兔血清，3−4 周龄），终体积比为 1:5。
注意： HL-60-补体混合物的最终浓度应为 1 x 107/mL。若需检测补体依赖性，可使用第二种溶液，其中含有活性HL-60细胞及热灭活补体（补体可通过在水浴中37°C孵育30分钟进行灭活）。 >55 °C 下至少 30 分钟。 - 细菌培养1小时完成后（步骤4.4），将每个样本（即每个30 µL样本取10 µL）均分至两个新的孔中，形成两个重复孔，分为两组（即仅使用原始30 µL共培养液中的20 µL，以预留移液误差空间）：一组与HL-60补体共培养，另一组仅含细菌。向实验组孔（标记为+HL-60）中每孔加入50 µL HL-60补体混合液（来自步骤5.3）；向仅含细菌的孔（标记为-HL-60）中每孔单独加入50 µL OBB。
注意： 在此示例中，使用约800个细菌CFU与5 x 105/50 µL HL-60 细胞。如果最终菌落数表明感染复数过高或过低，应调整初始细菌稀释度，而非HL-60细胞数量。 - 在37 °C下振荡96孔板1小时（无CO₂）2).
6. 样品涂布与过夜培养
- 用 OBB 将每个孔稀释至 1:5，使每个样品的体积至少为 50 µL。
- 将每种样品各 50 µL 直接移液至细菌培养平板上指定区域，确保样品之间有足够的间距。对于 15 × 100 mm2 的圆形琼脂平板，每块平板上移液约 4 个样品。
- 盖上皿盖，在室温下静置约 15 分钟，使样品干燥。
- 将平板倒置，在 30 °C 下过夜培养（无需 CO2）。或者，将平板置于厌氧罐中培养，以检测无氧条件是否影响细菌生长，或用于形态学对照。
- 过夜培养后，计数每个指定样品区域内的菌落。通过将每组活细胞数量与相应的对照组和/或未与 HL-60 细胞共培养的样品进行比较，分析数据（代表 100% 细胞存活率，0% 细胞杀伤率）。
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结果
在开始 OPKA 之前，应验证 HL-60 细胞的分化情况。可通过流式细胞术检测细胞表面 CD11b、CD35、CD71 和 annexin V 的表达水平（图1）。也可使用碘化丙啶（propidium iodide）作为细胞活力标记物。经 DMF 处理 3 天后，CD35 的表达应升高（所有细胞中 ≥55%），CD71 的表达应降低（所有细胞中 ≤20%）。annexin V 阳性细胞与碘化丙啶（PI+）细胞的总比例应 <35%，以确保足够的细胞活力。若上述比例未达到最低要求，应按照讨论部分所述调整培养条件。
步骤 6.5 获得的菌落形成单位（CFU）数量可用于比较不同组别相对于未经处理的对照组（100% 细胞存活率）的细菌细胞存活情况，如图 2所示。例如，未接受处理但与 HL-60 细胞共培养的孔中获得的平均菌落数量，应与未接受处理且未与 HL-60 细胞共培养的细胞数量相近，这表明细胞存活率为 100%，即细胞死亡率为 0%。在有效处理条件下，HL-60 共...
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讨论
OPKA 在评估疫苗诱导的抗体介导免疫反应中具有重要作用6,8。这种简化的 OPKA 的主要意义在于其可适应待测条件（如抗体、酶处理等）的灵活性。因此，该检测不仅可用于测试调理素（如抗体）在吞噬作用中的贡献，还可用于评估克服通常抑制吞噬通路的毒力因子（如荚膜多糖）的方法。通过减少多重 OPKA 中通常所需的步骤数量，可有效降低因技术误差影响实验结果的可能性，并减少为获得可用数据所需进行的故障排查和优化工作。由于本方案适用于多种处理条件的变化，因而具有很高的灵活性。
在进行OPKA实验之前，预先建立检测体系，包括HL-60细胞的培养以及细菌菌种的制备，对于避免实验过程中额外的优化步骤至关重要。必须投入足够时间确保所有试剂和细胞类型在实验开始前均已准备就绪并具备正常功能。这些准备工作包括：在培养条件下扩增HL-60细胞系（约两周时间），验证特定浓度的二甲基甲酰胺（DMF）能否有效诱导HL-60细胞分化（约一周时间），以及制备无污染且经优化的细菌菌液稀释液（约两周时间）。...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢阿拉巴马大学伯明翰分校的 Moon Nahm 博士在我们实验室建立 OPKA 检测方法过程中提供的宝贵帮助。本研究由美国国立卫生研究院基金 1R01AI123383-01A1 资助，项目负责人：FYA。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Annexin V（APC 标记） | BioLegend | 640919 | |
| 抗人 CD35 抗体（PE 标记） | BioLegend | 333405 | |
| 抗人 CD71 抗体（PE 标记） | BioLegend | 334105 | |
| 拟使用的细菌菌株（例如，Streptococcus pneumoniae, WU2） | 细菌呼吸道参考实验室（Moon Nahm 博士） | ||
| 血琼脂平板 | Hardy Diagnostic | A10 | |
| 胎牛克隆血清 | HyClone | SH30080.03 | |
| 甘油 | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 细胞 | ATCC | CCL-240 | |
| IgG 同型对照（PE 标记） | BioLegend | 400907 | |
| N,N-二甲基甲酰胺（DMF） | Fisher Chemical | UN2265 | |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4864 | |
| 含 L-谷氨酰胺的 RPMI 培养基 | Corning | 10-040-CV |
参考文献
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
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