新型的组织透明化技术（如溶剂清除器官的终极三维成像）可与免疫染色兼容，能够实现狂犬病病毒脑部感染及其复杂细胞环境的三维可视化。通过对厚的抗体标记脑组织切片进行光学透明化处理，可增加成像深度，并实现共聚焦激光扫描显微镜下的三维分析。
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摘要
摘要
通过免疫标记技术对组织和器官中的感染过程进行可视化，是现代感染生物学的一项关键方法。该技术能够观察和研究病原体在器官组织内的分布、嗜性及丰度，从而为疾病的发生与发展提供关键数据。利用传统的显微镜方法，免疫标记主要局限于从石蜡包埋或冷冻样本中获取的薄切片。然而，这些薄切片有限的二维成像平面可能导致丢失有关受感染器官复杂结构及感染细胞微环境的重要信息。目前，新型多色、兼容免疫染色的组织透明化技术为研究病毒感染器官组织的高通量三维图像堆栈提供了相对快速且经济的方法。通过将组织暴露于有机溶剂中，使其在光学上变得透明，从而匹配样本的折射率，显著减少光散射。因此，结合长工作距离物镜，可利用常规共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对厚度达1 mm的大块组织进行高分辨率成像。本文介绍了一种在组织透明化后进行深层组织成像的实验方案，用于可视化狂犬病病毒感染脑组织中的病毒分布，以研究病毒致病机制、传播途径、嗜性及神经侵入等科学问题。
引言
传统的组织学技术主要依赖于器官组织的薄切片，这本质上只能对复杂的三维环境提供二维的观察视角。尽管从原理上可行，但通过连续薄切片进行三维重建需要复杂的技术流程，包括切片过程本身以及后续获取图像的计算机内联配准1。此外，切片后z轴体积的无缝重建至关重要，因为由于图像平面不重叠、染色差异以及切片刀等物理因素对组织造成的破坏，可能导致机械和计算伪影持续存在。相比之下，对完整厚组织样本进行纯光学切片可获得重叠的图像平面（过采样），从而促进三维重建。这对于分析复杂细胞群体中的感染过程尤其有利（例如，在周围胶质细胞和免疫细胞背景下研究神经元网络）。然而，厚组织切片本身存在光散射以及抗体难以深入渗透到组织内部等固有障碍。近年来，已开发并优化了多种技术以克服这些问题2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。本质上，这些方法通过使用水性2,3,4,5,6,7,8,9或有机溶剂基10,11,12,13溶液处理，使目标组织在光学上变得透明。3DISCO（溶剂清除器官的三维成像）11,12及其后续改进方法uDISCO（终极溶剂清除器官三维成像）13的提出，提供了一种相对快速、简单且成本低廉且具有优异透明化效果的工具。该透明化方案的主要成分是有机溶剂tert-丁醇（TBA）、苯甲醇（BA）、苯甲酸苄酯（BB）和二苯醚（DPE）。随后发展并引入了iDISCO（免疫标记兼容的溶剂清除器官三维成像）14——一种兼容的免疫染色方案，进一步优于现有方法，实现了对目标抗原的深层组织标记，并支持免疫染色样本的长期保存。因此，结合iDISCO14与uDISCO13，可利用常规共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对大块组织切片（厚达1 mm）中经抗体标记的蛋白质进行高分辨率成像。
完整保留器官在三维空间中的复杂结构对于脑组织而言尤为重要。神经元是一种高度异质性的细胞亚群，其三维形态因神经突起的投射方式而表现出极大的多样性（由Masland15综述）。此外，大脑由多个区室和亚区室组成，每个区室均包含不同类型的细胞亚群及其特定比例，包括胶质细胞和神经元（由von Bartheld等16综述）。作为一种嗜神经病毒，狂犬病病毒（RABV，由Fooks等17综述）主要感染神经元，并利用神经元的运输机制从初始感染部位沿轴突逆向迁移至中枢神经系统（CNS）。本文所述方案（图1A）可用于对感染脑组织获得的大体积、连续图像堆栈进行免疫染色辅助下的RABV及RABV感染细胞的检测与可视化。该方法可实现对感染微环境无偏倚、高分辨率的三维评估。该方案适用于多种物种的脑组织样本，可在固定后立即进行，也可在样本经多聚甲醛（PFA）长期保存后实施，并允许对染色并透明化处理的样本进行数月的保存和重复成像。
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方案
使用了感染RABV且经PFA固定的存档脑组织材料。相关动物实验研究已由梅克伦堡-前波美拉尼亚州农业、食品安全与渔业局（LALFF M-V）所属的动物护理、使用及伦理委员会评估，并获得许可编号7221.3-2.1-002/11（小鼠）和7221.3-1-068/16（雪貂）的批准。动物实验中的常规护理和所用方法均依照批准的指南进行。
警告：本实验方案使用多种有毒和/或有害物质，包括多聚甲醛（PFA）、甲醇（MeOH）、过氧化氢（H2O2）、叠氮化钠（NaN3）、TBA、BA、BB 和 DPE。MeOH 和 TBA 高度易燃。为避免接触，应穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目镜），并在通风橱内进行实验操作。废弃物应分别收集于适当的容器中，并根据当地法规进行处理。狂犬病毒被归类为生物安全等级（BSL）-2 病原体，因此通常可在 BSL-2 条件下操作。某些活动，包括可能产生气溶胶的操作、高病毒浓度的操作或涉及新型丽沙病毒的操作，可能需要 BSL-3 等级。建议高风险人员（包括动物饲养员和实验室工作人员）进行暴露前预防接种18,19。请参照当地主管部门的规定。
1. 脑组织固定与切片
- 将脑组织样本置于适量的4%多聚甲醛（溶于磷酸盐缓冲液PBS [pH 7.4]中）固定液中，在4 °C条件下固定至少48小时（组织与固定液体积比约为1:10 [v/v]）。
- 用PBS清洗组织样本3次，每次至少30分钟，随后将样本保存于含0.02% NaN3的PBS溶液中，4 °C保存备用。
- 使用振动切片机将组织切成厚度为1 mm的切片（刀片进给速率：0.3–0.5 mm/s，振幅：1 mm，切片厚度：1,000 µm）。
- 为保持切片顺序的准确性，将每一片组织单独存放于多孔细胞培养板的孔中，加入含0.02% NaN3的PBS溶液，4 °C保存备用。
2. 甲醇样品预处理
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非另有说明，均在室温下操作。需避免样品暴露于光照下。样品预处理的主要目的是通过甲醇（MeOH）处理改善抗体渗透性，并通过过氧化氢（H2O2）处理降低组织自发荧光14。
- 配制20% (v/v)、40%、60% 和 80% 的甲醇（MeOH）水溶液。例如，配制20% MeOH溶液时，将10 mL 100% MeOH加入40 mL蒸馏水中，置于合适的可密封容器中，通过倒置混匀。
- 将样品转移至大小合适的容器中（例如5 mL反应管）。注意选择对本实验所用试剂具有化学耐受性的材料。例如，聚丙烯适用，而聚苯乙烯不适用。
注意：本实验方案中的体积参数均基于5 mL反应管。若使用其他容器，请相应调整体积。 - 将样品依次用已配制的系列浓度MeOH溶液（从低到高）各4 mL孵育，每种浓度孵育1小时。
- 将样品用纯（100%）MeOH孵育2次，每次1小时。
- 将样品冷却至4 °C（例如，置于实验室安全冰箱中）。
- 配制漂白液（5% H2O2 甲醇溶液），例如将30% H2O2 储存液按1:6比例用纯（100%）MeOH稀释，并在4 °C预冷。
- 从冷藏的样品中移除100% MeOH，加入4 mL预冷的漂白液（5% H2O2 甲醇溶液），在4 °C孵育过夜。
- 将漂白液替换为4 mL 80% MeOH，孵育1小时。随后继续使用已配制的系列MeOH溶液，按浓度从高到低依次孵育各1小时，直至样品在4 mL 20% MeOH中孵育1小时。
- 用4 mL PBS洗涤样品1次，每次1小时。
3. 免疫染色
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非另有说明，均在室温下操作。避免样品暴露于光照。为防止微生物生长，向本部分溶液中加入 NaN3，终浓度为 0.02%。组织样品通过非离子型去污剂 Triton X-100 和 Tween 20 处理以进一步增加通透性。使用正常血清阻断非特异性抗体结合。添加甘氨酸和肝素以降低免疫标记背景14。
- 用 4 mL 的 0.2% Triton X-100/PBS 对样品进行清洗，每次 1 小时，共清洗 2 次。
- 在 37 °C 条件下，用 4 mL 的 0.2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M 甘氨酸/PBS 对样品进行透化处理，持续 2 天。
- 将样品置于 4 mL 的 0.2% Triton X-100/10% DMSO/6% 正常血清/PBS 中，在 37 °C 下孵育 2 天，以阻断抗体的非特异性结合。
注意：为获得理想的阻断效果，应使用与二抗同一物种来源的正常血清。 - 将样品置于 2 mL 的一抗溶液（3% 正常血清/5% DMSO/PTwH [含肝素的 PBS-Tween 20] + 一抗/抗体）中，在 37 °C 下孵育 5 天。孵育 2.5 天后更换一抗溶液 。
- 配制 PTwH 时，将肝素钠盐溶于蒸馏水中，配制成 10 mg/mL 的储存液（将此溶液分装后于 4 °C 保存）。将储存液加入 0.2% Tween 20/PBS 中，使其终浓度为 10 µg/mL。
注意：选择合适的一抗稀释比例可能需要优化。通常可从常规免疫组织化学推荐的浓度开始尝试。
- 配制 PTwH 时，将肝素钠盐溶于蒸馏水中，配制成 10 mg/mL 的储存液（将此溶液分装后于 4 °C 保存）。将储存液加入 0.2% Tween 20/PBS 中，使其终浓度为 10 µg/mL。
- 用 4 mL 的 PTwH 对样品清洗 1 天，期间至少更换 4–5 次洗涤缓冲液，并将最后一次洗涤液过夜保留。
- 将样品置于 2 mL 的二抗溶液（3% 正常血清/PTwH + 二抗/抗体）中，在 37 °C 下孵育 5 天。孵育 2.5 天后更换二抗溶液。
- 将二抗/抗体以 1:500 的比例稀释于二抗溶液中（即 2 mL 溶液中加入 4 µL 二抗）。
- 按照步骤 3.5 所述方法对样品清洗 1 天，并将最后一次洗涤液过夜保留。
4. 细胞核染色
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非另有说明，均在室温下操作。避免样品暴露于光照下。如无需进行核染色，或TO-PRO-3的激发波长/发射光谱需用于其他荧光染料的激发或检测，则可省略此步骤。
- 将核酸染料 TO-PRO-3 用 PTwH 按 1:1,000 稀释，将样品在 4 mL 核染色液中孵育 5 小时。
- 按照步骤 3.5 所述方法洗涤样品 1 天，最后一次洗涤过夜。
注意：洗涤完成后，样品可在 4 °C 的 PBS 中保存，直至进行光学透明处理。
5. 组织透明化
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非另有说明，均在室温下操作。避免样品暴露于光照。组织样品经梯度浓度的TBA溶液脱水处理。由于免疫染色需要水相溶液，所有染色步骤必须在组织透明化之前完成。通过BA、BB和DPE混合液处理实现光学透明和折射率匹配。透明化溶液中添加DL-α-生育酚作为抗氧化剂13。
- 配制30% (v/v)、50%、70%、80%、90% 和 96% 的TBA水溶液。例如，配制30% TBA溶液时，将15 mL 100% TBA加入35 mL蒸馏水中，置于合适的可密封容器中，通过倒置混匀。
注意：TBA的熔点为25–26 °C，因此在室温下通常呈固态。为配制TBA溶液，需将密封良好的TBA瓶置于37 °C的培养箱或水浴中加热。 - 依次用4 mL已配制的TBA溶液（按浓度从低到高）对样品进行脱水处理，每种浓度处理2小时。96% TBA溶液可过夜放置。
- 进一步用纯（100%）TBA对样品脱水2小时。
- 配制透明化溶液BABB-D15。
注意：BABB-D15是BA与BB（BABB）的混合物，再按x:1的比例与DPE混合，其中x为该溶液名称中指定的数值，本例中为15。- 配制BABB时，按1份BA与2份BB的比例混合。
- 按15:1的比例混合BABB与DPE。
- 加入0.4 vol%的DL-α-生育酚（维生素E）。
注意：例如，配制20 mL BABB-D15时，将6.25 mL BA与12.5 mL BB混合，加入1.25 mL DPE，并补充0.08 mL DL-α-生育酚。
- 用透明化溶液处理样品，直至其呈现光学透明（2–6小时）。
- 样品可在BABB-D15中于4 °C避光保存，直至进行封片与成像。
6. 样品安装
- 使用3D打印机打印 成像室及盖子（材料：共聚酯[CPE]，喷嘴：0.25 mm，层高：0.06 mm，壁厚：0.88 mm，壁数：4，填充率：100%，无需支撑结构；相应的.STL文件可在以下位置找到） 补充材料 本方案的
- 组装成像室（图2).
- 将圆形盖玻片（直径：30 mm）用RTV-1（单组分室温硫化）硅橡胶固定在成像室上。用蘸水的棉签除去多余的硅橡胶，并过夜固化。
- 将圆形盖玻片（直径：22 mm）用RTV-1硅橡胶固定在盖子上。移除 过量硅橡胶 用沾水的棉签擦拭，并过夜固化。
- 将样品放入成像腔室，加入少量BABB-D15，盖上盖子。通过入口用皮下注射针头（27 G × 3/4 英寸 [0.40 mm × 20 mm]）向腔室内注满BABB-D15。
- 用RTV-1硅橡胶密封成像室的入口并封堵。在避光条件下过夜固化。
7. 成像与图像处理
- 通过选择相应的激光谱线以匹配所用的荧光染料来设置图像采集参数。调整每个检测器的检测范围，以防止不同通道之间的信号重叠。
注：Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568 和 TO-PRO-3 的典型检测范围分别为 500–550 nm、590–620 nm 和 645–700 nm。 - 选择采集参数，定义 z 轴堆栈的上、下边界，并采集图像堆栈。
注：典型的采集参数包括：逐帧扫描，像素大小为 60–90 nm，z 轴步长为 0.5 µm，线平均为 1，扫描速度为 400 Hz，针孔大小为 1 阿贝单位。 - 使用适当的图像分析软件（例如 Fiji）处理图像堆栈，以生成三维投影或进行深入分析。
注：由于所采集图像文件体积较大，通常需要使用工作站进行处理。- 在 Fiji 中打开采集或图像文件（文件 | 打开 | 选择文件）。
- 若使用 .LIF 文件，例如，在 Bio-Formats 对话框窗口中选择或取消选择所需选项。使用 Hyperstack 查看堆栈。除此之外，无需进行其他特定选择或勾选。点击 确定。
- 如果文件包含多个图像堆栈，请选择需要分析的堆栈，并点击 确定 确认。
- 将合并的图像拆分为各个独立通道（图像 | 颜色 | 通道工具，然后选择 更多 | 拆分通道），对每个通道执行漂白校正（图像 | 调整 | 漂白校正），并选择 简单比率法（背景强度：0.0）。
注：在某些情况下，例如信号无明显的线性衰减或整体信号过弱时，简单比率法 可能失效。此时可尝试 指数拟合法，或跳过漂白校正步骤。 - 使用滑块调整每个通道的亮度和对比度（图像 | 调整 | 亮度 | 对比度）。
- 合并各通道（图像 | 颜色 | 合并通道），生成复合图像（图像 | 颜色 | 通道工具，然后选择 更多 | 生成复合图像），并将其转换为 RGB 格式（图像 | 颜色 | 通道工具，然后选择 更多 | 转换为 RGB）。
- 如有必要，调整图像堆栈大小以减少计算时间和文件体积（图像 | 调整 | 大小，勾选两个选项并启用双线性插值）。
- 生成三维投影（图像 | 堆栈 | 3D 投影）。选择 最亮点投影法 作为投影方式，并将切片间距设置为与所采集图像堆栈的 z 轴步长一致。为获得最佳质量，将旋转角度增量设为 1，并启用插值功能。根据需要调整总旋转角度、透明度阈值和不透明度。
- 如有必要，将三维投影图像转换回 8 位格式（图像 | 类型 | 8 位），重新调整亮度和对比度（使用相应滑块：图像 | 调整 | 亮度 | 对比度），然后按照步骤 7.3.4 所述方法将图像堆栈重新转换为 RGB 格式。
- 将三维投影保存为 .TIF 文件（图像格式）和 .AVI 文件（视频格式）。
- 在 Fiji 中打开采集或图像文件（文件 | 打开 | 选择文件）。
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结果
结合iDISCO14与uDISCO13技术，并利用高分辨率共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），可深入揭示狂犬病病毒（RABV）感染脑组织及其周围细胞环境的时空分辨率与可塑性。
通过RABV磷蛋白（P）的免疫染色，可以在小鼠脑组织厚切片中观察到被感染神经元细胞的复杂层次结构（图3）。随后，可对获取的图像堆栈进行无缝三维重建（图3A, B，右侧面板；动态图1）。当使用来源于与器官组织相同物种的一抗或针对该物种的二抗时，需格外谨慎。在小鼠脑组织上使用抗小鼠IgG抗体会导致血管系统出现明显染色（图3B，左侧面板）。由于图像堆栈具有高分辨率，感染情况可评估至单细胞水平（图4
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讨论
近年来，组织透明化技术的复兴与进一步发展2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14，为获取器官组织的高通量图像堆栈开辟了许多新的可能性。这为研究包...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Thomas C. Mettenleiter 和 Verena te Kamp 对手稿的审阅。本工作由梅克伦堡-前波美拉尼亚州联邦卓越计划与欧洲社会基金（ESF）资助（项目编号：KoInfekt，ESF/14-BM-A55-0002/16），以及弗里德里希-勒弗勒研究所内部合作研究基金关于丽沙病毒的资助（Ri-0372）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 苯甲醇 | Alfa Aesar | 41218 | 透明化试剂 |
| 苯甲酸苄酯 | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | 透明化试剂 |
| 二甲基亚砜 | Carl Roth | 4720.2 | 多种缓冲液 |
| 二苯醚 | Sigma-Aldrich | 240834-100G | 透明化试剂 |
| DL-α-生育酚 | Alfa Aesar | A17039 | 抗氧化剂 |
| 驴血清 | Bio-Rad | C06SBZ | 封闭试剂 |
| 甘氨酸 | Carl Roth | 3908.2 | 降低背景信号 |
| 山羊血清 | Merck | S26-100ML | 封闭试剂 |
| 肝素钠盐 | Carl Roth | 7692.1 | 降低背景信号 |
| 过氧化氢溶液（30%） | Carl Roth | 8070.2 | 样品漂白 |
| 甲醇 | Carl Roth | 4627.4 | 样品预处理 |
| 多聚甲醛 | Carl Roth | 0335.3 | 用于配制固定液的结晶粉末 |
| 叠氮化钠 | Carl Roth | K305.1 | 防止储存液中微生物生长 |
| 叔丁醇 | Alfa Aesar | 33278 | 组织透明化过程中的样品脱水 |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | 核酸染料 |
| 吐温X-100 | Carl Roth | 3051.2 | 去垢剂 |
| 吐温20 | AppliChem | A4974,0500 | 去垢剂 |
| 其他材料 | |||
| 5 mL 反应管 | Eppendorf | 0030119401 | 样品管 |
| 圆形盖玻片（直径：22 mm） | Marienfeld | 0111620 | 成像腔室的组成部分 |
| 圆形盖玻片（直径：30 mm） | Marienfeld | 0111700 | 成像腔室的组成部分 |
| 皮下注射针头（27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]） | B. Braun | 4657705 | 向成像腔室中加入透明化溶液 |
| RTV-1 硅橡胶 | Wacker | Elastosil E43 | 用于组装成像腔室的粘合剂 |
| Ultimaker CPE 2.85 mm 透明材料 | Ultimaker | 8718836374869 | 3D 打印机用共聚酯丝材，用于打印成像腔室部件 |
| 技术设备与软件 | |||
| 3D 打印机 | Ultimaker | Ultimaker 2+ | 打印成像腔室 |
| 自动水浸系统 | Leica | 15640019 | 软件控制的水泵 |
| 台式轨道摇床 | Elmi | DOS-20M | 室温下样品孵育（约 150 rpm） |
| 加热型台式轨道摇床 | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | 37 °C 下样品孵育（约 150 rpm） |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | 倒置共聚焦显微镜，用于样品成像 |
| Fiji | NIH (ImageJ) | 开源软件（v1.52h） | 基于 ImageJ 的图像处理软件包 |
| 长工作距离水浸物镜 | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| 振动切片机 | Leica | VT1200S | 样品切片 |
| 工作站 | Dell | Precision 7920 | CPU：Intel Xeon Gold 5118 GPU：Nvidia Quadro P5000 内存：128 GB 2666 MHz DDR4 固态硬盘：2 TB |
| 一抗 | |||
| 山羊抗 RABV N 抗体 | Friedrich-Loeffler-Institut | 通过杆状病毒表达并经 His 标签纯化的 RABV 核蛋白 N 免疫山羊获得的单特异性多克隆山羊抗 RABV N 血清 稀释比例：1:400 | |
| 兔抗 GFAP 抗体 | Dako | Z0334 | 多克隆抗体（RRID:AB_10013382） 稀释比例：1:100 |
| 兔抗 MAP2 抗体 | Abcam | ab32454 | 多克隆抗体（RRID:AB_776174） 稀释比例：1:250 |
| 兔抗 RABV P 160-5 抗体 | Friedrich-Loeffler-Institut | 通过杆状病毒表达并经 His 标签纯化的 RABV 磷蛋白 P 免疫兔子获得的单特异性多克隆兔抗 RABV P 血清（参见参考文献 23：Orbanz 等，2010） 稀释比例：1:1,000 | |
| 二抗 | |||
| 驴抗山羊 IgG | Thermo Fisher Scientific | 根据偶联的荧光染料而定 | 高度交叉吸附 稀释比例：1:500 |
| 驴抗小鼠 IgG | Thermo Fisher Scientific | 根据偶联的荧光染料而定 | 高度交叉吸附 稀释比例：1:500 |
| 驴抗兔 IgG | Thermo Fisher Scientific | 根据偶联的荧光染料而定 | 高度交叉吸附 稀释比例：1:500 |
| 山羊抗小鼠 IgG | Thermo Fisher Scientific | 根据偶联的荧光染料而定 | 高度交叉吸附 稀释比例：1:500 |
| 山羊抗兔 IgG | Thermo Fisher Scientific | 根据偶联的荧光染料而定 | 高度交叉吸附 稀释比例：1:500 |
参考文献
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