大鼠原位肾移植：一种新颖且简化的手术方法

摘要

本文及实验方案旨在详细说明并演示大鼠原位肾移植手术的操作过程。该方法通过采用静脉和输尿管套管吻合技术，简化了手术步骤，以实现供体肾脏的正确灌注，并缩短再灌注时间。

摘要

与任何类型的肾脏替代疗法相比，肾移植可提高终末期肾病患者的生存率并改善其生活质量。在过去几十年中，大鼠肾移植模型已被用于研究排斥反应和免疫耐受的免疫学现象。该模型已成为在开展昂贵的临床前大型动物研究之前，测试新型免疫调节药物和治疗方案不可或缺的工具。

本方案详细介绍了如何在大鼠中可靠地进行原位肾移植。该方案包含三个可提高成功率的关键步骤：通过门静脉灌注供体肾脏，以及使用套管系统吻合肾静脉和输尿管，从而缩短冷缺血和热缺血时间。采用该技术，我们在接受同基因型或耐受性肾移植的大鼠中实现了超过6个月的存活率，并维持正常的血清肌酐水平。根据研究目的，可通过移植前或移植后的干预措施对该模型进行调整，以研究急性、慢性、细胞介导或抗体介导的排斥反应。该动物模型具有可重复性、可靠性且成本较低，适用于研究肾移植的多个方面。

引言

历史上，Brent 和 Medawar 首次通过在啮齿类动物中进行皮肤移植开展了移植排斥研究¹。人们很快认识到，皮肤具有独特的免疫学特征，是一种高度免疫原性的器官，其排斥反应与其他有血管化的实体器官不同²。大鼠实体器官移植排斥的研究通常局限于心脏、肝脏和肾脏移植。尽管这些器官均适用于排斥反应的研究，但各自存在优缺点。心脏移植通常被植入腹腔，并与主动脉和下腔静脉吻合，而受体自身的心脏则保留在原位³。这种方法无法重现人类临床、解剖和生理条件。此外，心脏对冷缺血极为敏感，为了恢复其功能，必须优先在1小时内再灌注⁴。肝脏移植通常被认为在手术上更具挑战性且时间要求更严格。在切除受体原位肝脏后，供体肝脏必须在30分钟内完成植入并恢复血流，因为受体无法在无功能性肝脏的情况下存活更长时间⁵。肝动脉、门静脉，尤其是胆管的重建，需要精细的外科技术。除了手术难度外，肝脏已知具有诱导耐受的特性，啮齿类动物和人类均可能实现功能性耐受^6,7,8。与上述器官不同，肾脏可进行原位移植，是一种免疫原性明确的器官，在未使用免疫抑制的情况下可表现出一致且可重复的排斥反应，并且能够耐受长达数小时的冷缺血时间。因此，大鼠肾脏移植是研究同种异体移植物排斥与耐受的理想模型。

肾移植（KT）是终末期肾病患者的首选治疗方法。过去几十年中，肾移植术后的短期生存率已显著提高，但长期生存率却停滞不前⁹。传统的免疫抑制方案仍然是标准的抗排斥治疗手段。然而，长期使用免疫抑制治疗会导致明显的发病率和死亡率，例如肾毒性、糖尿病以及继发性恶性肿瘤^10,11,12。从长期来看，慢性抗体介导和细胞介导的排斥反应威胁着移植物的存活，而目前可用的治疗选择十分有限。

移植领域的一个主要目标是诱导移植耐受，从而避免长期使用免疫抑制剂。大鼠肾移植（KT）模型是研究免疫排斥过程以及评估新型免疫调节和移植耐受策略的可靠工具。大鼠同样适用于研究急性和慢性细胞介导及抗体介导的排斥反应^{13,14,15,16,17}。该手术模型已被证实为一种可靠、可重复且经济有效的工具，可用于研究同种异体移植物排斥与耐受的多个方面。在开展昂贵且操作繁琐的大型动物研究之前，常利用该模型来测试新型耐受诱导方案。在大鼠中实施KT手术需要经过 extensive 外科训练和专业技术，以达到>90%的存活率。在本文及随附的教学视频中，我们提供了本机构多年来成功实施的大鼠原位KT手术的逐步操作流程。

在开始任何操作之前，供体和受体的选择至关重要，具体选择取决于实验的性质。理想情况下，供体和受体的体重应在220–260 g之间，年龄应在8–12周之间。体重低于220 g的动物其动脉、静脉和输尿管直径较小，使得受体的吻合操作尤为困难。较小的动物即使发生少量失血，也可能导致低血容量并引发死亡。体重超过260 g的动物血管周围脂肪较多，分离血管需要更长的手术时间，从而延长冷缺血时间。

方案

Lewis（RT1¹）和Dark Agouti（DA）（RT1A^a）大鼠购自商业供应商（见材料表）。这些完全MHC不匹配的大鼠品系常用于急性肾同种异体移植排斥反应的研究。所有动物均按照美国国立卫生研究院（NIH）的指南，饲养和维持于约翰斯·霍普金斯大学的无特定病原体设施中。所有实验操作均经机构动物护理和使用委员会批准。

1. 供体操作步骤

1. 将本实验中使用的所有外科器械进行准备并高压灭菌，以达到消毒目的，并使用一次性无菌手套以防止感染并发症。
2. 通过吸入异氟烷（诱导浓度为 3%–4%，维持浓度为 1%–2%）对供体大鼠实施麻醉，并在手术全程中维持麻醉状态。对所有供体和受体动物均预先皮下注射 0.1 mg/kg 体重的丁丙诺啡以提供镇痛。
3. 现在将大鼠置于仰卧位，并用无菌医用胶带固定四肢。
4. 使用电动剪毛器去除腹部区域的毛发。
   1. 涂抹眼部润滑剂，并使用浸有聚维酮碘的无菌纱布对术区进行消毒，随后使用浸有异丙醇的纱布再次消毒。
   2. 在进行首次切口前，通过检查趾夹缩足反射是否消失，确认大鼠已充分麻醉。
5. 使用剪刀从耻骨联合至剑突处沿腹中线做一较大的纵向皮肤和肌肉切口，进入腹腔。
6. 在腹壁两侧各插入一个牵开器，以充分暴露腹腔内结构。
7. 用湿润的无菌纱布覆盖肠管，并将其移至腹腔右侧，以暴露主动脉、下腔静脉和左肾。使用 1 mL 预热的生理盐水通过 1 cc 注射器滴加，以保持肠管和腹腔器官湿润并维持正常温度。
   1. 使用第二块湿润纱布覆盖并向上移动胃和脾脏，使其位于肾脏头侧，另用一小块湿润纱布覆盖暴露的肾脏（图 1A）。
8. 使用显微外科镊子分离并游离左肾动脉和静脉，使其脱离周围结缔组织并彼此分开。通过电凝左性腺静脉以游离左肾静脉，通过电凝肾上腺动脉以游离左肾动脉。随后，使用显微镊子剥离结缔组织，游离左肾蒂上下方的主动脉和下腔静脉（图 1B）。
9. 使用显微镊子将输尿管从周围结缔组织中分离并游离，然后使用显微剪刀在距离肾盂 2 cm 处做一斜行切口。将一根聚酰胺套管（见 材料表）插入输尿管切口约一半长度，并用 8-0 丝线打结固定套管（图 1C）。
   ​注意：切勿将输尿管周围的全部脂肪和结缔组织完全去除，因为这些组织可防止粘连引起的梗阻，过度清除可能导致输尿管坏死。应特别注意保护为输尿管供血的血管。
10. 使用显微镊子或显微剪刀将左肾从肾周脂肪中分离并游离。保留肾脏的脂肪囊，并以此部位作为操作肾脏的抓持点。
    1. 暴露下腔静脉。
11. 通过阴茎静脉使用 27 G 针头的注射器注射 200 单位肝素。注射后用棉签压迫注射部位至少 1 分钟，以防止出血。
12. 辨认门静脉（pv）和下腔静脉（ivc）（图 1D）。使用 16 G 针头将 50 mL 冰冷生理盐水与 500 单位肝素的混合液注入门静脉，以冲洗肾脏（图 1E）。在冲洗前，于肝下水平切断下腔静脉，并在针头插入部位尾侧切断门静脉，以使血液顺利流出体外。缓慢输注生理盐水开始冲洗，观察肾脏颜色由深红色逐渐变为均匀的灰白色（图 1F）。
13. 冲洗完成后，于靠近主动脉和下腔静脉处分别结扎肾动脉和肾静脉，并将冲洗后的肾脏置于盛有冰生理盐水的培养皿中。 图 2A 展示了供体手术过程的示意图。
14. 将肾脏置于冰生理盐水中后，固定并固定住静脉套管手柄（见 材料表），然后轻柔地将肾静脉穿过套管。接着使用 8-0 丝线打三个结，将肾静脉固定在套管上（图 2B）。                                                                       
    注意：在固定静脉时，需特别注意其方向。静脉旋转会导致血流受阻并引发血栓形成。

2. 受体操作步骤

1. 重复供体手术中的步骤 1.1–1.11。
2. 在左肾动脉和肾静脉靠近主动脉和下腔静脉的近端位置放置两个无创微血管夹（图 3A）。
3. 结扎受体肾静脉在肾入口处的近端，用肝素化生理盐水冲洗肾静脉，以清除血管内残留的全部血液。
4. 将结扎后的受体肾静脉滑过先前在供体肾脏上已放置好的套管式肾静脉，并用 8-0 丝线固定（图 3B）。固定时应保持肾静脉与套管之间的位置方向一致。
5. 在左肾下极水平结扎输尿管，并从肾周脂肪中游离肾脏。
6. 结扎受体肾动脉在肾入口处的近端，用肝素化生理盐水冲洗以清除血管内多余血液。使用 10-0 尼龙线以 8 至 10 针间断缝合方式行肾动脉端对端吻合（图 3C）。操作动脉时应利用其外膜层进行牵拉调整。
7. 移除血管夹以重新开始肾脏再灌注。先移除静脉上的夹子，再移除动脉上的夹子（图 3D）。使用无菌棉签轻轻压迫吻合区域周围可能渗血的部位。数分钟内通常即可实现通畅的吻合。
8. 短暂观察肾脏以评估灌注是否充分。再灌注后，肾脏颜色应立即发生变化，并在数分钟后逐渐恢复其自然的深红色（图 3E）。有时可见输尿管出现蠕动及局部尿液生成。
9. 最后将输尿管套管的暴露端插入受体输尿管内，并用 8-0 丝线固定受体输尿管 （图 2C 和 图 3F）。
10. 为保持供体与受体输尿管的位置稳定，将两根输尿管末端相互打结固定。
11. 可选操作：可用 4-0 丝线结扎右侧肾动脉和肾静脉，切除右侧肾脏。
12. 从腹腔中移除所有纱布，将所有器官复位，向肠管喷洒 1 mL 生理盐水以保持湿润，然后使用 4-0 可吸收缝线间断缝合腹直肌，再用 4-0 丝线间断缝合皮肤层以关闭腹腔。

3. 术后护理

1. 将动物置于清洁的笼子中，自由摄取水和食物，并在37 °C加热垫上恢复。
2. 皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡以镇痛，并监测动物恢复情况。 根据疼痛或不适表现，可能需要在接下来的几天内追加镇痛药物。 通常不常规使用抗生素，因为感染并发症罕见。
3. 观察动物恢复1–2小时后，将其送回动物饲养设施。术后最初24小时内每日检查2–3次，之后每日检查一次。注意观察疼痛和痛苦的迹象、经口摄入量以及尿量。
4. 术后7–10天拆除缝线。

结果

我们进行了同基因型（N = 5）和异基因型肾移植（N = 5）。接受同基因型移植的动物在无任何免疫抑制治疗的情况下实现了长期存活。未接受免疫抑制治疗而接受异基因型移植的动物则发生移植物排斥，并因肾功能衰竭死亡，中位存活时间为8天（图4A）。同基因型组血清肌酐水平仅轻度升高，而异基因型组肌酐水平升高了14倍（0.5 mg/dL 对比 7.0 mg/dL，p <0.01）（图4B）。移植肾取出后的大体观察显示，同基因型移植肾未见任何异常，肾脏颜色及内部结构保持完整。相比之下，发生排斥的异基因型移植肾可见红色出血斑块，且内部结构遭到破坏（图4C）。同基因型移植物的苏木精-伊红染色显示肾小球毛细血管环细小，内皮细胞和系膜细胞数量正常。而排斥的异基因型移植物则显示肾小球结构破坏，并伴有炎症和小管炎表现（

讨论

在本论文中，我们详细描述了大鼠原位肾移植（KT）的手术方法，包括实施该手术所需的所有必要设备（图5）。1965年，Fisher 和 Lee 发表了首篇关于大鼠肾移植的报告，标志着这一富有前景的研究领域的开端¹⁸。自那时起，人们对该模型进行了多种改进，以提高其可重复性。由于存在多种近交系和远交系大鼠，且具有部分或完全MHC错配组合，该模型已成为研究缺血-再灌注损伤以及肾移植排斥反应与耐受性的有效动物模型¹⁹。大鼠肾移植模型可作为在将研究扩展至猪和非人灵长类动物模型之前验证假设的工具。目前可用于研究啮齿类动物肾移植排斥反应或耐受性的模型选择有限。小鼠肾移植模型在技术上极具挑战性，需要较长的培训周期才能达到>80%的存活率²⁰。小鼠模型的另一个局限性在于，约30%的受体在无需免疫抑制的情况下会自发接受肾同种异体移植物。然而，小鼠的其他器官移植（如皮肤和心脏）通常在10天内即被排斥，这表明在完全MHC错配的小鼠中，肾同种异体移植物的排斥...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸丁丙诺啡	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
弯头解剖镊	中国浙江镇邦		11厘米 平柄
肝素钠注射液 USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
微型直头平滑镊子	中国 Jingzhong	WA3010
微针持针器	中国 Jingzhong	WA2010
微血管夹	中国 Jingzhong	WA40120
微型弹簧剪刀 1	ROBOZ	RS-5620
微型弹簧剪刀 2	F.S.T.	91501-09
微型弹簧剪刀 3	中国浙江镇邦		8.5厘米 Vannas，弯曲型
普乐可复（他克莫司/FK506）	Astellas
大鼠	Charles River &和 Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
夏弗	Wahl	79600-2101
4-0 缝合线	Ethicon	J304H
缝合线，4-0	Ethicon	683G
10-0 缝合线	Ethicon	2820G
注射器 &针头	BD
8-0 缝线	阿什韦	75290
输尿管袖状组织	微腔	160-1	聚酰亚胺管，直径 0.41 mm
静脉袖带	Intramedic BD	7441	PE-200 非射线显影聚乙烯管，内径：1.4 mm，外径：1.9 mm