大鼠原位肾移植：一种新颖且简化的手术方法

摘要

本文及实验方案旨在详细说明并演示大鼠原位肾移植手术的操作过程。该方法通过采用静脉和输尿管套管吻合技术，简化了手术步骤，以实现供体肾脏的正确灌注，并缩短再灌注时间。

摘要

与任何类型的肾脏替代疗法相比，肾移植可提高终末期肾病患者的生存率并改善其生活质量。在过去几十年中，大鼠肾移植模型已被用于研究排斥反应和免疫耐受的免疫学现象。该模型已成为在开展昂贵的临床前大型动物研究之前，测试新型免疫调节药物和治疗方案不可或缺的工具。

本方案详细介绍了如何在大鼠中可靠地进行原位肾移植。该方案包含三个可提高成功率的关键步骤：通过门静脉灌注供体肾脏，以及使用套管系统吻合肾静脉和输尿管，从而缩短冷缺血和热缺血时间。采用该技术，我们在接受同基因型或耐受性肾移植的大鼠中实现了超过6个月的存活率，并维持正常的血清肌酐水平。根据研究目的，可通过移植前或移植后的干预措施对该模型进行调整，以研究急性、慢性、细胞介导或抗体介导的排斥反应。该动物模型具有可重复性、可靠性且成本较低，适用于研究肾移植的多个方面。

引言

历史上，Brent 和 Medawar 首次通过在啮齿类动物中进行皮肤移植开展了移植排斥研究¹。人们很快认识到，皮肤具有独特的免疫学特征，是一种高度免疫原性的器官，其排斥反应与其他有血管化的实体器官不同²。大鼠实体器官移植排斥的研究通常局限于心脏、肝脏和肾脏移植。尽管这些器官均适用于排斥反应的研究，但各自存在优缺点。心脏移植通常被植入腹腔，并与主动脉和下腔静脉吻合，而受体自身的心脏则保留在原位³。这种方法无法重现人类临床、解剖和生理条件。此外，心脏对冷缺血极为敏感，为了恢复其功能，必须优先在1小时内再灌注⁴。肝脏移植通常被认为在手术上更具挑战性且时间要求更严格。在切除受体原位肝脏后，供体肝脏必须在30分钟内完成植入并恢复血流，因为受体无法在无功能性肝脏的情况下存活更长时间⁵。肝动脉、门静脉，尤其是胆管的重建，需要精细的外科技术。除了手术难度外，肝脏已知具有诱导耐受的特性，啮齿类动物和人类均可能实现功能性耐受^6,7,8。与上述器官不同，肾脏可进行原位移植，是一种免疫原性明确的器官，在未使用免疫抑制的情况下可表现出....

方案

Lewis（RT1¹）和Dark Agouti（DA）（RT1A^a）大鼠购自商业供应商（见材料表）。这些完全MHC不匹配的大鼠品系常用于急性肾同种异体移植排斥反应的研究。所有动物均按照美国国立卫生研究院（NIH）的指南，饲养和维持于约翰斯·霍普金斯大学的无特定病原体设施中。所有实验操作均经机构动物护理和使用委员会批准。

1. 供体操作步骤

1. 将本实验中使用的所有外科器械进行准备并高压灭菌，以达到消毒目的，并使用一次性无菌手套以防止感染并发症。
2. 通过吸入异氟烷（诱导浓度为 3%–4%，维持浓度为 1%–2%）对供体大鼠实施麻醉，并在手术全程中维持麻醉状态。对所有供体和受体动物均预先皮下注射 0.1 mg/kg 体重的丁丙诺啡以提供镇痛。
3. 现在将大鼠置于仰卧位，并用无菌医用胶带固定四肢。
4. 使用电动剪毛器去除腹部区域的毛发。
   1. 涂抹眼部润滑剂，并使用浸有聚维酮碘的无菌纱布对术区进行消毒，随后使用浸有异丙醇的纱布再次消毒。
   2. 在进行首次切口前，通过检查趾夹缩足反射是否消失，确认大鼠已充分麻醉。
5. 使用剪刀从耻骨联合至剑突处沿腹中线做一较大的纵向皮肤和肌肉切口，进入腹腔。
6. 在腹壁两侧各插入一个牵开器，以充分暴露腹腔内结构。....

结果

我们进行了同基因型（N = 5）和异基因型肾移植（N = 5）。接受同基因型移植的动物在无任何免疫抑制治疗的情况下实现了长期存活。未接受免疫抑制治疗而接受异基因型移植的动物则发生移植物排斥，并因肾功能衰竭死亡，中位存活时间为8天（图4A）。同基因型组血清肌酐水平仅轻度升高，而异基因型组肌酐水平升高了14倍（0.5 mg/dL 对比 7.0 mg/dL，p <0.01）（图4B）。移植肾取出后的大体观察显示，同基因型移植肾未见任何异常，肾脏颜色及内部结构保持完整。相比之下，发生排斥的异基因型移植肾可见红色出血斑块，且内部结构遭到破坏（图4C）。同基因型移植物的苏木精-伊红染色显示肾小球毛细血管环细小，内皮细胞和系膜细胞数量正常。而排斥的异基因型移植物则显示肾小球结构破坏，并伴有炎症和小管炎表现（

讨论

在本论文中，我们详细描述了大鼠原位肾移植（KT）的手术方法，包括实施该手术所需的所有必要设备（图5）。1965年，Fisher 和 Lee 发表了首篇关于大鼠肾移植的报告，标志着这一富有前景的研究领域的开端¹⁸。自那时起，人们对该模型进行了多种改进，以提高其可重复性。由于存在多种近交系和远交系大鼠，且具有部分或完全MHC错配组合，该模型已成为研究缺血-再灌注损伤以及肾移植排斥反应与耐受性的有效动物模型¹⁹。大鼠肾移植模型可作为在将研究扩展至猪和非人灵长类动物模型之前验证假设的工具。目前可用于研究啮齿类动物肾移植排斥反应或耐受性的模型选择有限。小鼠肾移植模型在技术上极具挑战性，需要较长的培训周期才能达到>80%的存活率²⁰。小鼠模型的另一个局限性在于，约30%的受体在无需免疫抑制的情况下会自发接受肾同种异体移植物。然而，小鼠的其他器官移植（如皮肤和心脏）通常在10天内即被排斥，这表明在完全MHC错配的小鼠中，肾同种异体移植物的排斥.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸丁丙诺啡	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
弯头解剖镊	中国浙江镇邦		11厘米 平柄
肝素钠注射液 USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
微型直头平滑镊子	中国 Jingzhong	WA3010
微针持针器	中国 Jingzhong	WA2010
微血管夹	中国 Jingzhong	WA40120
微型弹簧剪刀 1	ROBOZ	RS-5620
微型弹簧剪刀 2	F.S.T.	91501-09
微型弹簧剪刀 3	中国浙江镇邦		8.5厘米 Vannas，弯曲型
普乐可复（他克莫司/FK506）	Astellas
大鼠	Charles River &和 Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
夏弗	Wahl	79600-2101
4-0 缝合线	Ethicon	J304H
缝合线，4-0	Ethicon	683G
10-0 缝合线	Ethicon	2820G
注射器 &针头	BD
8-0 缝线	阿什韦	75290
输尿管袖状组织	微腔	160-1	聚酰亚胺管，直径 0.41 mm
静脉袖带	Intramedic BD	7441	PE-200 非射线显影聚乙烯管，内径：1.4 mm，外径：1.9 mm