冠状动脉血流储备（CFR）定义为最大冠状动脉血流量与静息冠状动脉血流量的比值。本文介绍一种通过超声评估大鼠CFR的实验方案，该方法可在无阻塞性冠状动脉疾病的情况下用于预测心血管危险因素。
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摘要
摘要
冠状动脉疾病是全球死亡的首要原因。急性心肌梗死后，通过冠状动脉再通实现早期且成功的心肌干预，是减少缺血心肌范围最有效的策略。冠状动脉微血管无法被直接观察和成像 体内，但有多种有创和无创技术可用于评估直接依赖冠状动脉微血管功能的参数。缺血再灌注后的内皮功能也可通过冠状动脉血流储备（CFR）在冠状循环水平进行评估。 本研究中，测量了大鼠左前降支（LAD）冠状动脉的峰值流速 体内 通过经胸多普勒超声心动图在静息状态和应激挑战（由多巴酚丁胺诱导）期间评估。正常心脏在应激诱导期间可将其冠状动脉血流增加至静息值的四倍。在缺血再灌注后，我们发现冠状动脉血流储备（CFR）显著降低，可作为冠状动脉微血管功能障碍的标志。CFR揭示了微血管功能障碍的重要性，并已被证明可独立于是否存在严重阻塞性疾病来预测心血管风险。
引言
心肌缺血再灌注（IR）是指心脏血流受限后，血流恢复并同时发生再氧合的一种病理状态1。冠状动脉闭塞可由栓子或胆固醇斑块破裂引起，导致代谢供需严重失衡，从而引发组织缺氧。再灌注治疗已被证实可挽救濒危心肌，改善急性心肌梗死患者的左心室功能，并提高生存率。然而，在冠状动脉再通后，可能会出现小冠状血管的功能异常2,3,4,5。相当一部分患者（可能高达40%）即使冠状动脉血流恢复，仍无法实现微血管和心肌的充分灌注。在活体（in vivo）条件下，冠状动脉微循环的可视化与评估较为困难，但目前已有一些有创和无创技术可用于直接评估依赖于冠状动脉微血管功能的各项参数6,7。此外，还可通过冠状动脉血流储备（CFR）来评估冠状循环水平的内皮功能5。
经胸多普勒超声心动图是一种无创性工具，可用来研究冠状动脉血流速度和冠状动脉血流储备（CFR）5。CFR代表最大冠状动脉血流量与静息冠状动脉血流量的比值8。在应激负荷状态下，正常心脏的冠状动脉血流量可增加至静息状态下的四倍。当CFR降低时，心血管风险增加9。Ishihara等研究表明，在冠状动脉血管成形术后，CFR会立即严重受损5。在无冠状动脉狭窄的情况下，冠状动脉微血管功能障碍会导致CFR下降，这种情况存在于约一半的稳定性冠状动脉疾病患者中10。
该方法的总体目标是通过超声心动图对大鼠左前降支冠状动脉（LAD）功能进行无创可视化，可用于计算冠状动脉血流储备（CFR）。这为诊断微血管功能障碍和评估潜在治疗方案提供了一种重要的评估工具。
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方案
所有操作均按照路易斯维尔大学机构动物照护与使用委员会（IACUC 批准的方案 18223）批准的规程以及《美国国立卫生研究院实验动物照护与使用指南》11 进行。
1. 动物
- 使用4月龄雌性Fisher 344大鼠（体重~150–180 g）进行研究。
2. 介入放射学手术前的超声成像
- 使用异氟烷麻醉大鼠——诱导室浓度为5%，氧流量为1.5–2.0 L/min2 流速随后调整为1.5–2.0%，氧气流量为1.5–2.0 L/min2 流动麻醉。该麻醉在整个实验过程中持续维持，包括静息期和应激期。
- 将动物置于仰卧位，剃除胸部毛发。使用内置加热平台维持体温在37–38 °C。通过软件监测心率。
注意：适当的麻醉对于维持心率在正常生理范围（295-350 次/分钟）至关重要。 - 成像前涂抹眼科用兽医软膏，以防止眼睛干涩。
- 使用13–24 MHz线性探头（例如MS250）进行超声心动图检查（图1A).
- 将动物置于加热平台上，呈仰卧位。通过鼻罩控制麻醉。然后使用轨道系统将探头定位，以获取胸骨旁短轴切面（PSAX）图像图1B).
- 从胸骨旁短轴切面（PSAX）向头侧移动探头，定位肺动脉（图1B).
- 将探头从肺动脉向尾侧方向轻微移动，以观察左前降支（LAD），并保存图像。
注意：若无彩色多普勒，左前降支（LAD）较难定位，因此并非总能获取其B型超声图像。 - 当个体差异导致难以定位冠状动脉前降支（LAD）时，采用以下所述技术：
- 将探头移至肺动脉外侧。
- 调整平台角度，使动物倾斜、倒置或略微向右侧倾斜，以便探头更清晰地观察左心室。
- 一旦B模式图像被采集或以电影模式存储，点击 彩色多普勒 在触摸屏上（图1C）。在短轴切面上显示冠状动脉（白箭头指示前降支）图1C）。实时观察到的红色表示血流方向（即血流朝向探头）。
- 在彩色多普勒模式下观察到左前降支（LAD）后，将模式切换至 脉搏波 (PW) 模式。观察冠状动脉上是否存在黄色指示线图2A).
- 将黄色脉冲波取样线置于冠状动脉中央，确保其角度与血流方向平行。
注意：血流速度受脉冲多普勒（PW）取样线角度影响显著，务必使屏幕上的探头角度与左前降支（LAD）血管走行角度相匹配。请使用触摸屏调整角度，PW取样线与血流方向夹角应小于60°。 - 使用 动态图像存储 在舒张期峰值时捕捉静息状态下LAD冠状动脉血流速度的波形图2B).
- 在获得静息状态下前降支（LAD）血流速度后，测量应激状态下前降支的最大血流速度以计算冠状动脉血流储备（CFR）。为测量应激期间的最大血流速度，经尾静脉以20 µg/kg/min的剂量输注多巴酚丁胺。8 (图2C).
注意：多巴酚丁胺输注时间不应超过 8 分钟。使用输注泵，并将输注泵的内径设置为 14.43（适用于 BD 10 mL 注射器）。- 使用25G输液蝶形针进行尾静脉插管。放置输液针时，先在大鼠尾根部缠绕一小条纱布，然后用止血钳夹住并扭转止血带以施加压力，使静脉扩张。
- 将针头连接多巴酚丁胺注射器后直接放置。
注意：采血时需格外小心，避免意外注入药物，以确保针头正确置于尾静脉内。同时，务必避免将气泡注入静脉，因为栓塞可能对动物造成致命后果。 - 针头放置到位后，用胶水和一片手术胶带固定针头，并将输液管固定在尾巴上。
- 移除止血钳和止血带以恢复血流。
- 将多巴酚丁胺注射器置于输液泵中，并设置为以 20 µg/kg/min 的速度输注。
- 输注多巴酚丁胺期间，需密切监测左前降支（LAD）峰值血流速度及心率。应定期在多普勒模式下记录LAD的脉冲波（PW）峰值，尤其是当其因多巴酚丁胺作用而升高时。
注意：多巴酚丁胺引起的压力负荷会使心脏负荷加重，这通常会导致心脏和前降支（LAD）发生移动。为保持前降支的可视性，需准备调整动物、探头或两者的位置。 - 在LAD峰值和心率于刺激过程中达到平台期后，停止多巴酚丁胺输注，移除尾静脉输液装置，并将动物从平台上取下。让动物在其饲养笼中恢复。
- 选择 峰值速度 从所示图像中获取舒张期峰值速度的工具 图2B 和 C。
- 将左前降支（LAD）在负荷状态（多巴酚丁胺）下的舒张期峰值血流速度与静息状态下左前降支舒张期峰值血流速度的比值计算为冠状动脉血流储备（CFR）指数图2A).
3. 缺血再灌注损伤
- 使用异氟烷麻醉大鼠——诱导室浓度为5%，氧流量为1.5–2.0 L/min2 流速随后为1.5–2.0%，氧气流量为1.5–2.0 L/min2 流
- 通过脚趾回缩反射消失确认麻醉深度。在眼睛上使用眼科用凡士林软膏以防止干燥。使用加热垫或动物体温控制器维持动物体温在37–38 °C。
- 术前15分钟，按5 mg/kg剂量经肌内注射美洛昔康，随后皮下注射2 mL 0.9%氯化钠溶液以预防术中脱水。操作过程中使用无菌手套和器械，并采用无菌技术。利用光纤光源，使用18号静脉导管对大鼠进行气管插管，并连接至呼吸机。
- 通过第5肋间15 mm切口，使用8-0单丝缝线结扎LADth 肋间空间。打一个平结并留置30分钟。通过观察心脏表面变色，肉眼确认所有大鼠均出现缺血。1230分钟后松开结扎线，并通过观察心肌先前变色区域在1-2分钟内是否出现变红来确认再灌注。12.
- 使用4-0可吸收缝线以间断缝合方式关闭胸腔，然后使用5-0不可吸收丝线以连续缝合方式缝合皮肤。
- 将动物从麻醉状态中移出，让其在饲养笼中恢复。 每24小时肌肉注射一次5 mg/kg美洛昔康，在动物安乐死前持续给药（术后72小时）。
4. 红外手术后超声成像
- 缺血再灌注（IR）手术后 72 小时，再次测量冠状动脉血流和冠状动脉血流储备（CFR），并将测量结果与 IR 前的数值进行比较。重复步骤 2.1 至 2.15，具体操作如上所述。
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结果
本研究使用了12只雌性Fisher 344大鼠。我们采用多巴酚丁胺进行应激试验，并在缺血再灌注（IR）手术前及术后72小时测量了左前降支冠状动脉（LAD）血流速度。在IR手术前，静息状态下的LAD冠状动脉血流速度为423 ± 59 mm/s，多巴酚丁胺输注后显著升高至1005 ± 77 mm/s（图3A）。IR手术后72小时，静息状态下的LAD冠状动脉血流速度显著高于术前水平（743 ± 40 mm/s vs 423 ± 59 mm/s）（图3A）。IR手术后对多巴酚丁胺应激试验的反应较术前显著降低（937 ± 67 mm/s vs 1005 ± 77 mm/s）（图3A）。
CFR 计算为应激状态（多巴酚丁胺）下的峰值血流速度与静息状态血流速度（多巴酚丁胺输注前测得）的比值...
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讨论
本研究的主要发现是，即使在没有任何残余血管造影狭窄的情况下，缺血再灌注也会增加静息状态下左前降支冠状动脉的血流速度，并损害冠状动脉血流储备。
理解冠状动脉生理学是心脏病学家在治疗冠状动脉疾病时进行临床决策的重要组成部分。冠状动脉血流储备（CFR）是理解冠状动脉微循环病理生理学的重要功能参数之一7,13。CFR 是一种无创性方法，可用于评估冠状动脉狭窄和冠状动脉微血管循环情况，是心肌血液供应的指标，明确反映冠状动脉在应激条件下增加血流的能力7。正常的 CFR（>2.0）通常提示预后良好，而 CFR 低于 1.90 可为识别高危冠状动脉疾病提供额外的诊断信息14,15,16。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
我们感谢Helmsley基金会为我们提供超声设备以开展实验。本研究工作得到了NIA R01 053585基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 注射器 | BD Syringe | 302995 | |
| 250S 13–24 MHz 线性探头 | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| 多巴酚丁胺盐酸盐 | Sigma | D0676-10mg | |
| 异氟烷 | RRC | 27376 | |
| Legato 100 注射泵 | KD Scientific | 788100 | |
| Vevo 3100 | FUJIFILM VisualSonics Inc | ||
| 带翼输液套件，27G x 1/2" | Medline.com | TMOSV27ELZ |
参考文献
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