方法文章

研究小鼠创伤性脑损伤后盲肠微生物群的变化

DOI：

10.3791/59410

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2019年9月19日

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1Emergency and Trauma Center, The International Medical Center, The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种使用侧向液体打击装置诱导弥漫性创伤性脑损伤，并随后采集盲肠内容物进行肠道微生物组分析的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

越来越多的证据表明，微生物群-肠-脑轴在脑部疾病的发生机制中起着重要作用。多项研究还表明，创伤性脑损伤会引起肠道微生物群的变化。然而，脑-肠轴双向调节的潜在机制仍不清楚。目前，可用于研究创伤性脑损伤后肠道微生物群变化的模型较少。因此，本研究结合了使用侧向液体冲击装置诱导创伤性脑损伤的实验方案，以及损伤后盲肠样本的分析方法，以探究肠道微生物组的改变。通过16S核糖体DNA测序来确定创伤性脑损伤后肠道微生物群组成的改变。该方案为研究肠道微生物与创伤性脑损伤之间的关系提供了一种有效的方法。

引言

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创伤性脑损伤（TBI）是一个全球性的公共卫生问题，也是青年人死亡和残疾的主要原因1,2。TBI 每年导致大量死亡，幸存者则经历多种躯体、精神、情绪和认知功能障碍。因此，TBI 给患者家庭和社会资源带来了沉重负担。TBI 包括创伤发生时即刻出现的原发性脑损伤，以及在初始损伤后数小时至数月内发展的继发性脑损伤。继发性脑损伤由多种生化级联反应介导，这些反应不仅对大脑有害，还对包括胃肠道系统在内的多个器官系统产生显著的负面影响3。

目前，动物实验中诱导创伤性脑损伤（TBI）的模型主要有三种：液体打击损伤、控制性皮层冲击（CCI）和自由落体撞击加速损伤。其中，侧向液体打击损伤（LFPI）是最常用于建立弥漫性轴索损伤（DAI）的模型4。该装置通过颅骨切除术，在完整的硬脑膜上施加短暂的液体压力脉冲来造成脑损伤，该脉冲由摆锤撞击产生。LFPI 是一种可重复且可控的 TBI 研究建模方法。

微生物组被定义为定植于人体内的所有微生物的基因组总和。尤其是肠道微生物，不仅在肠道稳态和功能中发挥重要作用，还调节宿主生理学的诸多方面以及其他器官的功能5。近年来，越来越多的证据表明，肠道菌群通....

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方案

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所有操作程序均经浙江大学实验动物伦理委员会批准。手术中使用的所有器械和材料均为无菌。 TBI 操作过程大约需要 20 分钟。

1. 动物护理

  1. 本实验使用5至6周龄的雄性C57BL/6J小鼠（体重20–25 g）。
  2. 将小鼠维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，并确保其自由摄食和饮水。在整个研究期间，假手术组和TBI组小鼠应给予相同数量的食物和水。
  3. 应尽一切努力减少动物的疼痛与不适。

2. 诱导创伤性脑损伤

  1. 注射 氯胺酮（80-100 mg/kg）/赛拉嗪（10 mg/kg），腹腔注射 用于麻醉。通过角膜反射或痛觉反射检测麻醉深度。使用人工泪液或润滑性眼膏防止眼睛干涩。
  2. 麻醉后，将小鼠置于俯卧位。手术期间以及TBI后30分钟内，使用温控加热垫维持体温在37 °C。
  3. 剃除切口区域的毛发。
  4. 用70%乙醇以三次交替擦拭的方式对头皮进行消毒，然后在矢状面切开头皮。
  5. 使用镊子向两侧牵拉切口，并轻微分离骨膜。
  6. 用记号笔在颅骨右侧顶叶区域画一个直径为3 mm的圆，距中线2 mm。
  7. 使用电动钻钻开颅骨。此步骤需谨慎操作，以保护硬脑膜免受损伤。
  8. 移除骨瓣，暴露一个直径....

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结果

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创伤性脑损伤（TBI）的建立过程如图1所示。麻醉和消毒后，沿矢状方向切开头皮（图1A）。使用电动钻头在右侧顶叶皮层上方颅骨处钻取一个直径为3 mm的颅骨窗（图1B，C），保持硬脑膜完整。将一根塑料损伤套管置于骨窗上方，并使用牙科丙烯酸树脂将其固定于颅骨上（图1D）。

侧向液体脉冲损伤操作过程如图2所示。在开始实验前，通过输送约10次脉冲对设备进行测试，直至获得稳定信号。调节钟摆角度至起始位置，以达到约2.0 atm的脉冲强度（图2A）。将套管内充满无菌生理盐水，然后.......

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讨论

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本文介绍了一种简单高效的实验方案，用于检测小鼠创伤性脑损伤（TBI）后盲肠微生物群的变化。脑损伤的诱导及盲肠内容物样本的采集是该方案的关键步骤。

尽管已有研究人员探讨了创伤性脑损伤（TBI）后肠道微生物群的变化，但这些研究中所使用的脑损伤模型主要为控制性皮质撞击（CCI）8以及自由落体撞击/冲击诱导模型9。然而，CCI模型主要模拟脑挫伤，而自由落体撞击模型可能存在一定的不准确性。在所有现有的脑损伤模型中，液体打击致脑损伤（LFPI）模型应用最为广泛，该模型可同时模拟局灶性和弥漫性脑损伤11,12，并能复制临床上TBI患者所表现出的多种重要特征。该操作过程中的关键步骤包括保护硬脑膜以及确保套管的气密性。然而，开颅手术和粘合过程均需要操作者具备熟练的技术，这可能是本实验方案的一项局限性。尽管如此，LFPI仍是一种简便、稳定且精确的方法。因此，本研究采用LFPI诱导小鼠TBI，.......

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者衷心感谢王宝红提供的技术指导。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DNA提取试剂盒 QIAGEN51604用于从粪便样本中快速纯化基因组DNA
基因分析服务GENEWIZ基因分析服务
加热垫上海赛非生物科技有限公司TR-200加热垫
注射器浙江大学医学院附属第一医院注射器
LFPI装置弗吉尼亚
联邦大学		FP302LFPI装置
微型颅骨钻RWD生命科学78061微型颅骨钻
聚维酮碘浙江大学医学院附属第一医院聚维酮碘

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332(2017).
  2. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated....

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