本文介绍了一种使用侧向液体打击装置诱导弥漫性创伤性脑损伤，并随后采集盲肠内容物进行肠道微生物组分析的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
越来越多的证据表明，微生物群-肠-脑轴在脑部疾病的发生机制中起着重要作用。多项研究还表明，创伤性脑损伤会引起肠道微生物群的变化。然而，脑-肠轴双向调节的潜在机制仍不清楚。目前，可用于研究创伤性脑损伤后肠道微生物群变化的模型较少。因此，本研究结合了使用侧向液体冲击装置诱导创伤性脑损伤的实验方案，以及损伤后盲肠样本的分析方法，以探究肠道微生物组的改变。通过16S核糖体DNA测序来确定创伤性脑损伤后肠道微生物群组成的改变。该方案为研究肠道微生物与创伤性脑损伤之间的关系提供了一种有效的方法。
引言
创伤性脑损伤（TBI）是一个全球性的公共卫生问题，也是青年人死亡和残疾的主要原因1,2。TBI 每年导致大量死亡，幸存者则经历多种躯体、精神、情绪和认知功能障碍。因此，TBI 给患者家庭和社会资源带来了沉重负担。TBI 包括创伤发生时即刻出现的原发性脑损伤，以及在初始损伤后数小时至数月内发展的继发性脑损伤。继发性脑损伤由多种生化级联反应介导，这些反应不仅对大脑有害，还对包括胃肠道系统在内的多个器官系统产生显著的负面影响3。
目前，动物实验中诱导创伤性脑损伤（TBI）的模型主要有三种：液体打击损伤、控制性皮层冲击（CCI）和自由落体撞击加速损伤。其中，侧向液体打击损伤（LFPI）是最常用于建立弥漫性轴索损伤（DAI）的模型4。该装置通过颅骨切除术，在完整的硬脑膜上施加短暂的液体压力脉冲来造成脑损伤，该脉冲由摆锤撞击产生。LFPI 是一种可重复且可控的 TBI 研究建模方法。
微生物组被定义为定植于人体内的所有微生物的基因组总和。尤其是肠道微生物，不仅在肠道稳态和功能中发挥重要作用，还调节宿主生理学的诸多方面以及其他器官的功能5。近年来，越来越多的证据表明，肠道菌群通过肠-脑轴调控大脑的发育和功能6。肠道菌群的紊乱已被证实与多种脑功能障碍相关，包括帕金森病、情绪障碍和自闭症7。最近，临床前研究还报道，急性脑损伤可引起肠道菌群的变化8,9。
Treangen 等人的一项研究10发现，在闭合性颅脑损伤（CCI-induced TBI）后，三种微生物物种显著减少，两种微生物物种显著增加。该证据表明，调节肠道微生物群可能成为TBI管理中的一种治疗手段。然而，脑损伤引起肠道微生物群变化的机制仍不清楚。因此，需要一种相对简单且高效的研究TBI后肠道微生物群变化的模型。为此，本研究提出了一种用于检测小鼠TBI后肠道微生物群变化的实验方案。
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方案
所有操作程序均经浙江大学实验动物伦理委员会批准。手术中使用的所有器械和材料均为无菌。 TBI 操作过程大约需要 20 分钟。
1. 动物护理
- 本实验使用5至6周龄的雄性C57BL/6J小鼠（体重20–25 g）。
- 将小鼠维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，并确保其自由摄食和饮水。在整个研究期间，假手术组和TBI组小鼠应给予相同数量的食物和水。
- 应尽一切努力减少动物的疼痛与不适。
2. 诱导创伤性脑损伤
- 注射 氯胺酮（80-100 mg/kg）/赛拉嗪（10 mg/kg），腹腔注射 用于麻醉。通过角膜反射或痛觉反射检测麻醉深度。使用人工泪液或润滑性眼膏防止眼睛干涩。
- 麻醉后，将小鼠置于俯卧位。手术期间以及TBI后30分钟内，使用温控加热垫维持体温在37 °C。
- 剃除切口区域的毛发。
- 用70%乙醇以三次交替擦拭的方式对头皮进行消毒，然后在矢状面切开头皮。
- 使用镊子向两侧牵拉切口，并轻微分离骨膜。
- 用记号笔在颅骨右侧顶叶区域画一个直径为3 mm的圆，距中线2 mm。
- 使用电动钻钻开颅骨。此步骤需谨慎操作，以保护硬脑膜免受损伤。
- 移除骨瓣，暴露一个直径为3毫米的小骨窗。
- 在颅骨开孔处放置一根塑料损伤套管（内径 = 2.5 mm，长度 = 8 mm），并使用牙科丙烯酸树脂将套管固定于颅骨上。
- 使用注射器（5 mL）将无菌0.9% NaCl（生理盐水）注入导管，确保导管内无气泡。
- 打开示波器和放大器，确保侧向液体脉冲损伤（LFPI）装置的高压管中无气泡。通过施加约10次脉冲测试装置，直至获得稳定信号。调节摆锤起始位置的角度，使脉冲强度达到约2.0 atm。
- 将损伤套管连接至LFPI装置。通过扣动触发器释放钟摆以诱导脑损伤。随后产生脉冲，并通过完整的封闭液体填充管路系统将脉冲传递至硬脑膜。
- 对假手术组小鼠进行相同的外科手术操作，但不实施侧颅脑损伤（LFPI）。
3. 术后治疗
- 诱导脑损伤后，移除塑料套管并缝合切口。 手术期间给予布托啡诺（2mg/kg）皮下注射或腹腔注射，之后每6-12小时给药一次，持续三天。
- 将小鼠置于加热垫上直至其恢复自主活动。将加热垫温度设为37 °C以加速麻醉复苏。
- 将小鼠放回笼中，并自由供应食物和饮水 ad libitum。
4. 剖腹手术及盲肠样本采集
- 在相应时间点，通过 CO2 窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
注：本实验选择的时间点为创伤性脑损伤后 1 h、6 h、1 d、3 d 和 7 d，以分析肠道微生物群的动态演变过程。 - 去除小鼠腹部表面的毛发，并用 70% 乙醇对腹部进行消毒。
- 将无菌铺巾覆盖于小鼠体表，从雄性小鼠包皮上方的下腹部正中线处开始做切口。
- 暴露肠道后，定位盲肠，并将其与其他肠段轻轻分离。避免使用有齿或尖锐镊子夹持盲肠，应使用无创镊，例如带齿的 Adson 镊。
- 用锋利的剪刀剪开盲肠。
- 手动将盲肠内容物取出并置于无菌敷料上，随后转移至 1.5 mL 微量离心管中保存。
- 将盲肠内容物于 -80 °C 保存，直至进行微生物组分析。
5. DNA 提取、16S rDNA 测序及数据分析
- 从粪便中分离DNA
注意：本实验使用市售的DNA提取试剂盒（材料表）。- 使用解剖刀刮取300 mg粪便至2 mL微量离心管中，并将管子置于冰上。
- 向每个样品中加入1 mL抑制缓冲液，持续涡旋振荡1分钟，或直至粪便样品充分均质化。
- 以最大转速离心1分钟，使粪便颗粒沉淀。
- 用移液器将2 µL蛋白酶K加入一个新的2 mL微量离心管中。从步骤5.1.3中吸取600 µL上清液加入含蛋白酶K的2 mL微量离心管中。然后加入600 µL缓冲液1，涡旋振荡15秒。
- 将样品在70 °C孵育10分钟。
- 向裂解液中加入600 µL 100%乙醇（1:1比例），通过涡旋混合。短暂以最大转速离心，以去除管盖内壁的液滴。
- 将600 µL裂解液加入离心柱中，以最大转速离心1分钟。弃去穿流液。重复此步骤一次。然后将离心柱转移至新的2 mL收集管中。
- 打开离心柱，加入500 µL缓冲液2，以最大转速离心1分钟。取出离心柱并放入新的2 mL收集管中。
- 向柱中加入500 µL缓冲液3，以最大转速离心3分钟。弃去穿流液。重复一次离心步骤，以确保缓冲液3完全被去除。
- 将离心柱放入新的2 mL收集管中，用移液器将200 µL缓冲液4直接加入膜上。室温（RT）孵育1分钟，然后以最大转速离心1分钟以洗脱DNA。
- 16S-rDNA测序与数据分析
- 使用20–30 ng DNA生成扩增子。
- 使用市售引物，针对细菌16S rDNA的V3和V4高变区两侧相对保守区域设计。本研究中使用的正向引物包含序列 "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT"，反向引物包含序列 "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC"。
- 在离心管中加入2.5 µL缓冲液1、2 µL dNTPs、每种引物各1 µL、0.5 µL DNA聚合酶和20 ng模板DNA，配制PCR反应体系。使用ddH2O将反应体系定容至25 µL。
- 设置PCR反应参数如下：94 °C预变性3分钟，进行1次；随后进行24个循环：94 °C变性5秒，57 °C退火90秒，72 °C延伸10秒。
- 根据制造商说明进行PE250/300双端测序，并使用QIIME数据分析包进行16S rRNA数据分析。
注意：本实验中，DNA测序与数据分析主要由专业测序公司完成。
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结果
TBI 的建立过程如图1所示。麻醉并消毒后，沿矢状方向切开头皮（图1A）。使用电动钻头在右侧顶叶皮层上方颅骨处钻取一个直径为 3 mm 的颅骨窗，硬脑膜保持完整（图1B、C）。将一根塑料损伤套管置于骨窗上方，并用牙科丙烯酸树脂将其固定于颅骨上（图1D）。
侧向液体脉冲损伤操作过程如图2所示。在开始实验前，通过输送约10次脉冲对设备进行测试，直至获得稳定信号。调节钟摆角度至起始位置，以达到约2.0 atm的脉冲强度（图2A）。将套管内充满无菌生理盐水，然后将其连接至L...
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讨论
本文介绍了一种简单高效的实验方案，用于检测小鼠创伤性脑损伤（TBI）后盲肠微生物群的变化。脑损伤的诱导及盲肠内容物样本的采集是该方案的关键步骤。
尽管已有研究人员探讨了创伤性脑损伤（TBI）后肠道微生物群的变化，但这些研究中所使用的脑损伤模型主要为控制性皮质撞击（CCI）8以及自由落体撞击/冲击诱导模型9。然而，CCI模型主要模拟脑挫伤，而自由落体撞击模型可能存在一定的不准确性。在所有现有的脑损伤模型中，液体打击致脑损伤（LFPI）模型应用最为广泛，该模型可同时模拟局灶性和弥漫性脑损伤11,12，并能复制临床上TBI患者所表现出的多种重要特征。该操作过程中的关键步骤包括保护硬脑膜以及确保套管的气密性。然而，开颅手术和粘合过程均需要操作者具备熟练的技术，这可能是本实验方案的一项局限性。尽管如此，LFPI仍是一种简便、稳定且精确的方法。因此，本研究采用LFPI诱导小鼠TBI，...
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披露
作者衷心感谢王宝红提供的技术指导。
致谢
作者无任何利益冲突需要披露。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DNA提取试剂盒 | QIAGEN | 51604 | 用于从粪便样本中快速纯化基因组DNA |
| 基因分析服务 | GENEWIZ | 基因分析服务 | |
| 加热垫 | 上海赛非生物科技有限公司 | TR-200 | 加热垫 |
| 注射器 | 浙江大学医学院附属第一医院 | 注射器 | |
| LFPI装置 | 弗吉尼亚 联邦大学 | FP302 | LFPI装置 |
| 微型颅骨钻 | RWD生命科学 | 78061 | 微型颅骨钻 |
| 聚维酮碘 | 浙江大学医学院附属第一医院 | 聚维酮碘 |
参考文献
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重印与许可
