利用整体胚胎落射荧光技术分析小鼠胚胎发生过程中的心脏腔室发育

摘要

我们介绍了利用从心室特异性MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠中分离出的胚胎，通过整体封片表层荧光显微镜观察小鼠心脏发育的实验方案。该方法使我们能够直接可视化小鼠心脏发育过程中心室形成的各个阶段，而无需繁琐的组织化学方法。

摘要

本实验方案旨在介绍一种利用心室特异性荧光报告基因敲入小鼠（MLC-2v-tdTomato 小鼠）进行小鼠胚胎解剖及心脏发育过程中心室腔室可视化的方法。心脏发育包括线性心管的形成、心管弯曲以及四腔分隔等过程，这些复杂的发育事件在所有脊椎动物中高度保守。小鼠胚胎心脏已被广泛用于心脏发育研究。然而，由于其体积极小，小鼠胚胎心脏的解剖在技术上具有挑战性。此外，心脏腔室形成的观察通常需要借助原位杂交、利用LacZ报告基因小鼠进行β-半乳糖苷酶染色，或对胚胎心脏切片进行免疫染色。本文中，我们描述了如何解剖小鼠胚胎心脏，并通过整体封片落射荧光显微镜技术直接观察MLC-2v-tdTomato小鼠的心室腔室形成。利用该方法，无需对小鼠胚胎进行进一步实验处理，即可直接观察心管的形成与弯曲过程以及四腔结构的发育。尽管本方案以MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠品系为例进行说明，但该方法同样适用于其他心脏特异性的荧光报告基因转基因小鼠品系。

引言

心脏发育过程中的心腔形成是一个复杂的生物学过程，需经历多个形态学上不同的胚胎发育阶段^1,2。心脏前体细胞群首先形成新月形结构，随后发育为线性心管，再通过延伸和扭转形成螺旋状的早期心脏结构。在完成分隔过程后，早期心脏最终转变为具有四个心腔的成熟心脏。上述任一过程的中断均可能导致先天性心脏发育缺陷。因此，阐明心脏发育中心腔形成背后的分子机制至关重要。尽管此前已有大量关于心脏发育的研究，但目前对这一复杂过程的理解仍然有限。

原位杂交、免疫组织化学以及利用LacZ报告基因小鼠进行的β-半乳糖苷酶染色已被广泛用于通过标记心脏特异性或心腔特异性结构基因或蛋白（如Nppa、Coup-TFII、Irx4、MLC-2a和MLC-2v）^{3,4,5,6,7,8,9,10}来研究小鼠心脏发育过程中的心腔形成。然而，这些使用小鼠胚胎的实验需要耗费大量时间并具备专业技术，因为必须依次完成多个不同的实验步骤¹¹。本文中，我们描述了一种简单的整体标本落射荧光显微镜方法，用于观察从MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠中分离出的胚胎发育中的心室¹²。与以往方法相比，该方法的优势在于避免了复杂的实验步骤，从而减少实验变异。本方案的主要目的是介绍如何解剖小鼠胚胎及发育中的心脏，并在无需繁琐的组织化学实验的情况下，观察小鼠心脏各阶段心腔发育过程。该方法可轻松应用于评估多种其他转基因小鼠品系（如标记早期心脏标志物的Mesp1Cre: Rosa26EYFP¹³、Isl1Cre: Rosa26EYFP¹³、Hcn4H2BGFP¹⁴、Hcn4Cre: Rosa mT/mG¹⁴、Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG¹⁴、Hcn4-eGFP¹⁵、Isl1Cre: Rosa mT/mG¹⁴、Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato¹⁵以及TgMef2c-AHF-GFP¹⁶小鼠）中心脏的发育情况。

方案

所有动物实验程序均经范德比尔特大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准。

1. 小鼠胚胎的收集与解剖

1. 将8-10周龄的雌性MLC-2v-tdTomato^+/-小鼠与8-10周龄的雄性MLC-2v-tdTomato^+/-小鼠交配，以获得MLC-2v-tdTomato^+/+、MLC-2v-tdTomato^+/-和MLC-2v-tdTomato^-/-胚胎。
2. 每天早晨检查雌鼠阴道栓情况。发现阴道栓当日的中午定为E0.5。
   注意：应在早晨（交配后8-24小时内）进行阴道检查以确认阴道栓，因为阴道栓可能在当天晚些时候脱落。
3. 采用CO₂吸入法安乐死不同妊娠天数（如E8.5、E10.5和E12.5）的孕鼠，随后进行颈椎脱位。
4. 将小鼠仰卧放置，并在其腹部喷洒70%乙醇，以防止解剖过程中鼠毛污染。
5. 使用锋利的手术剪和镊子切开皮肤和腹壁，打开腹腔。
6. 在腹腔背侧定位两侧子宫角。
7. 使用锋利的手术剪和镊子，在两侧输卵管上方小心剪断，分离整个子宫。
8. 将完整解剖出的子宫置于含冰上冷PBS的10 cm培养皿中，使用锋利的手术剪和镊子沿子宫角逐个分离羊膜囊。
9. 用移液器将每个胚胎转移至盛有冰上冷PBS的6孔板的各个孔中。
10. 在解剖显微镜下，于含冰上冷PBS的6孔板单个孔中，使用锋利的手术剪和镊子剪断脐带，打开羊膜囊并暴露胚胎。
11. 使用锋利的手术剪和镊子尽可能去除胚外组织，同时避免损伤胚胎。
    注意：通常在解剖发育中的心脏之前，先对完整小鼠胚胎进行整体荧光成像，如下所述。
12. 使用锋利的手术剪和镊子剪下胚胎头部，转移至含有100 µL缓冲液A（25 mM NaOH和0.2 mM EDTA）的1.5 mL离心管中，用于基因型鉴定，以便与荧光成像结果进行关联分析。
13. 用精细镊子打开胚胎胸腔，使用锋利的手术剪和镊子将心脏从肺和血管组织中分离出来，再用移液器将解剖出的胚胎心脏转移至含PBS的12孔板的孔中。所有解剖操作均在配有光纤显微照明装置的解剖显微镜下完成。
    注意：由于E8.0或E8.5时期小鼠胚胎心脏体积极小且结构脆弱，解剖技术上较为困难。早期胚胎心脏（即E8.0和E8.5）可在完整胚胎中直接观察，无需解剖分离。

2. 全组织表层荧光成像

1. 将含有小鼠胚胎心脏的12孔板置于落射荧光解剖显微镜下。
2. 在落射荧光解剖显微镜下，使用精细镊子调整胚胎心脏的位置，使正在发育的心室靠近观察者。
3. 使用0.63倍物镜（变倍范围为3.15倍至18.9倍），在明场模式下调节图像焦距。
4. 拍摄明场曝光图像，并采集多张图片。通常采用1秒曝光时间获取图像，但曝光时间可能因照明条件和相机规格而异，需针对每个实验系统进行优化。
5. 关闭光纤显微镜照明器，切换至红色荧光滤光片（激发波长545 nm/发射波长605 nm），以观察tdTomato的表达情况。
6. 如有必要，重新调节图像焦距。
7. 调节亮度和对比度，进行红色荧光曝光并采集多张图像。
   注意：通常采用以下成像参数：曝光时间1秒，增益2倍，饱和度1.0，伽马校正1.0。最佳参数需根据具体实验条件优化确定；一旦确定最佳设置，整个实验过程中应保持一致。

3. 基因分型

1. 将步骤 1.12 的样品在 100 °C 下煮沸 1 小时。
2. 在 11,360 × g 条件下离心 2 分钟，取 20 µL 上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，加入 20 µL 缓冲液 B（40 mM Tris HCl，pH 5.5），并混匀。
3. 取步骤 3.2 中混合后的上清液 4.5 µL 作为 DNA 模板，加入各 0.5 µL 的特异性正向引物和反向引物（10 µM），10 µL 预混的聚合酶与反应缓冲液（2×）（见材料表），然后加水至总体积为 20 µL。引物序列如下：
   F1: 5’-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3’
   R1: 5’-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3’
   F2: 5’-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3’
   R2: 5’-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3’
4. 按照以下 PCR 程序（表 1 和 表 2）进行聚合酶链式反应（PCR）。
5. 将 PCR 产物和 DNA Marker 在 1× TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液（40 mM Tris-乙酸，1 mM EDTA）中，于 1% 琼脂糖凝胶上以 140 V 电泳 25 分钟。使用 100 bp DNA Marker 估算 PCR 条带的大小。
6. 将 DNA 凝胶置于紫外透射仪上，打开紫外灯以观察 DNA 条带。

结果

在心脏发育过程中，MLC-2v 被认为是心室腔室特化的最早标志物¹⁷。如图1所示，我们从 MLC-2v-tdTomato 报告基因敲入小鼠中分离出整个胚胎及胚胎心脏，并检测了 MLC-2v-tdTomato 报告基因在心脏发育过程中的表达情况。在 MLC-2v-tdTomato 报告基因敲入小鼠中，通过落射荧光整体成像，可在发育早期（E8.0 时）即观察到正在发育的心脏中持续表达的 tdTomato¹²（图2）。在 E8.0 时，线性心脏管中 tdTomato 的表达相对较弱，至 E8.5 时表达增强。在 E10.5 时，从整个小鼠胚胎中分离出的成环心脏显示，MLC-2v-tdTomato 报告基因仅在心室部分表达，而在静脉流入道、动脉流出道或未来的心房区域无表达。在 E12.5 至 E13.5 时，对 MLC-2v-tdTomato 报告基因敲入小鼠胚胎分离...

讨论

本文所述方法在无需开展耗时费力的实验以标记心室或心脏特异性结构基因或蛋白的情况下，相对简便地检测心室腔室的发育情况。因此，该方法最大限度减少了在免疫染色心脏切片中常出现的技术变异。

成功实施本方法有两个关键步骤：准确估计小鼠胚胎的发育年龄以及完整分离胚胎心脏。我们通常通过检测雌性小鼠阴道栓的存在来实际估算其胚胎发育年龄。然而，阴道栓的出现并不一定意味着已成功受孕，仅表明在大约8至24小时内发生过交配行为。即使观察到阴道栓，通常也难以在交配后10至11天之前确定雌鼠是否真正怀孕，需通过检查雌鼠腹部情况来进一步确认。为确保获得预期发育阶段的小鼠胚胎，建议采用多对雌雄小鼠同时配种的稳妥繁殖策略。在小鼠胚胎发生过程中，若要准确观察心脏心室的发育情况，关键在于分离出结构完整、无明显损伤的发育中鼠心，如图1所示。为成功完成本实验方案，必须在解剖显微镜下进行细致的解剖操作，并在解剖前充分了解各胚胎发育阶段的心脏解剖结构。

由于MLC-2v-tdTomato报告基因的表达最早出现在E...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖显微镜	Leica	MZ125
DNA分子量标准（100 bp）	Promega	G2101
落射荧光解剖显微镜	Leica	M165 FC
GoTaq Green预混试剂	Promega	M712
PCR仪（Master Cycler）	Eppendorf	6336000023