中国台湾蝙蝠种群狂犬病毒属监测的标准操作规程

摘要

本方案介绍了在中国台湾蝙蝠中进行狂犬病病毒属抗原诊断检测的标准实验室操作程序。

摘要

狂犬病毒属（Lyssavirus）病毒是人畜共患病原体，至少有七种狂犬病毒属物种与人类感染病例相关。由于蝙蝠是大多数狂犬病毒属病毒的天然宿主，自2008年起，中国台湾已开展针对蝙蝠的狂犬病毒属监测项目，以了解这些病毒在蝙蝠中的生态学特征。在该项目中，非政府蝙蝠保护组织与地方动物疾病控制中心合作，收集死亡蝙蝠或因虚弱、疾病而濒临死亡的蝙蝠。通过尸体解剖获取蝙蝠脑组织，并采用直接荧光抗体检测法（FAT）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测狂犬病毒属抗原和核酸。对于FAT检测，建议使用至少两种不同的狂犬病诊断用荧光结合物。对于RT-PCR检测，采用两组引物（JW12/N165-146，N113F/N304R）扩增狂犬病毒属核蛋白基因的部分序列。该监测项目对蝙蝠中的狂犬病毒属及其他重要人畜共患病原体进行持续监控。2016至2017年间，在两只日本伏翼蝙蝠（Pipistrellus abramus）中发现了中国台湾蝙蝠狂犬病毒。这些发现应引起公众、卫生专业人员及科学界对接触蝙蝠及其他野生动物潜在风险的重视。

引言

狂犬病毒属（Lyssavirus）的病毒是人畜共患病原体。目前已发现至少有七种狂犬病毒属物种与人类病例相关¹。除该属已确认的16个物种外^1,2,3，最近还在蝙蝠中鉴定出中国台湾蝙蝠狂犬病毒（Taiwan bat lyssavirus, TWBLV）⁴和科塔拉赫蒂蝙蝠狂犬病毒（Kotalahti bat lyssavirus）⁵，但它们的分类地位尚未确定。

除莫科拉丽沙病毒（Mokola lyssavirus）和伊科马丽沙病毒（Ikoma lyssavirus）外，大多数丽沙病毒的自然宿主均为蝙蝠，而莫科拉丽沙病毒和伊科马丽沙病毒迄今尚未在任何蝙蝠中被发现^1,2,3,6。关于亚洲蝙蝠中丽沙病毒的信息仍然有限。已有报道在亚洲蝙蝠中发现两种尚未明确分类的丽沙病毒（一种来自印度，另一种来自泰国）^7,8。2002年在中国报告了一例与蝙蝠咬伤相关的人类狂犬病病例，但该诊断仅基于临床观察⁹。在中亚地区，1991年在吉尔吉斯斯坦的小鼠耳蝠（Myotis blythi）中发现了阿拉万丽沙病毒（Aravan lyssavirus），2001年在塔吉克斯坦的须鼠耳蝠（Myotis mystacinus）中发现了胡占德丽沙病毒（Khujand lyssavirus）¹⁰。在南亚地区，2015年在斯里兰卡的印度狐蝠（Pteropus medius）中发现了甘诺鲁瓦蝙蝠丽沙病毒（Gannoruwa bat lyssavirus）³。在东南亚地区，菲律宾、泰国、孟加拉国、柬埔寨和越南的多项蝙蝠血清学研究显示血清阳性率存在差异^{11,12,13,14,15}。尽管2012年在中国吉林省的白斑长舌蝠（Murina leucogaster）中发现了伊尔库特丽沙病毒（Irkut lyssavirus）¹⁶，但东亚地区蝙蝠种群中丽沙病毒的确切物种及其分布地点仍不清楚。

为评估中国台湾蝙蝠种群中丽沙病毒的存在情况，启动了一项监测计划，采用直接免疫荧光抗体试验（FAT）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）两种方法。2016–2017年，在两例日本小蝙蝠（Pipistrellus abramus）中鉴定出中国台湾蝙蝠丽沙病毒⁴。本文介绍了一套针对中国台湾蝙蝠种群开展丽沙病毒监测的实验室标准操作程序。本实验室蝙蝠丽沙病毒诊断的流程图见图1。

方案

1. 处理狂犬病毒时的安全预防措施

1. 确保所有处理蝙蝠样本的实验室工作人员均接受暴露前狂犬病预防接种¹⁷。在操作前监测工作人员的狂犬病抗体水平，并每6个月复查一次¹⁷。对于抗体水平低于0.5 IU/mL者，需进行加强狂犬病疫苗接种¹⁷。
2. 根据实验室所在国家的生物安全法规，确保以下操作在相应生物安全等级的实验室中进行（例如在中国台湾地区为BSL-2实验室，澳大利亚为BSL-3实验室），且工作人员具备当前有效的资质并穿戴适当的个人防护装备¹⁸。
   注意：狂犬病疫苗对属于基因群II和III的丽沙病毒提供的保护作用极低或无保护作用¹⁸。必须告知工作人员，已在蝙蝠中鉴定出多种人畜共患病原体¹⁹，因此应在相应生物安全等级的实验室条件下，穿戴适当的个人防护装备处理样本。

2. 样本采集

1. 使用发现的虚弱、患病的蝙蝠或蝙蝠尸体。
   注意：虚弱或患病的蝙蝠将被送往台北蝙蝠保育协会接受兽医护理或用于研究，而蝙蝠尸体则直接提交至动物健康研究所。本监测项目中未对任何健康蝙副实施安乐死。
2. 由蝙蝠生态学家通过形态学特征鉴定蝙蝠物种²⁰。
3. 当检测到丽沙病毒阳性时，采用已发表的实验方法对蝙蝠物种进行DNA条形码分析²¹。
4. 提交每具蝙蝠尸体的信息表（采集地点、物种、临床症状等）。

3. 蝙蝠标本的尸体解剖

1. 准备材料。
   1. 准备一个干净的解剖板，并放置无菌吸水垫用于解剖。
   2. 准备用于采集蝙蝠器官的收集管。
   3. 准备一次性镊子和手术刀用于解剖。在每只蝙蝠解剖之间更换工具。准备用70%乙醇润湿的棉球，用于采样过程中清洁镊子和手术刀。
   4. 准备两张显微镜载玻片用于荧光抗体检测（FAT）。采集新鲜标本，并将其固定于福尔马林溶液中以进行组织病理学检查。
2. 解剖前检查所有外部开口。拍摄蝙蝠的外部特征照片，特别是头部、耳朵和翅膀，以用于物种鉴别。
3. 采集口腔拭子样本。将蝙蝠腹侧朝下放置在解剖板上，并用镊子固定其头部。用手术刀沿颅顶正中线切开皮肤，并将皮肤向两侧拉开。用手术刀沿颅顶正中线切开颅骨，并用镊子将其打开，暴露脑组织。
4. 将脑组织从颅腔中取出，置于无菌压舌板上，并从脑组织制备印迹涂片（见步骤4.2）。取少量新鲜脑组织，固定于福尔马林中用于组织病理学检查。将剩余脑组织放入收集管中，用于核酸提取。
5. 使用70%乙醇润湿的棉球清洁镊子和手术刀，以在标本采集过程中去除残留组织。
6. 将蝙蝠背侧朝下放置在解剖板上，并用针在腋下和尾跟两侧将其固定在板上。
7. 从下颌至肛门沿身体正中线切开皮肤。用镊子提起并分离皮肤及下方肌肉组织。采集靠近下颌骨的唾液腺。
8. 用镊子轻轻抬起胸骨，用手术刀沿正中线切开胸骨和腹壁。用手术刀切断锁骨。用针将左右肋骨固定在解剖板上，以打开胸腔。
9. 记录大体病变及死后自溶程度。
10. 使用镊子和手术刀从尸体中取出内脏组织（即心脏、肺、肝、肾、肠道）。根据未来研究需要采集内脏标本。
    注：建议采集双份样本。一份用于分子诊断，另一份应加入或不加入病毒运送培养基后于-80 °C冷冻保存，用于病毒培养²²。

4. 直接荧光抗体检测（FAT）

1. 对脑组织进行压印涂片以进行荧光抗体试验（FAT）。按照先前所述方法进行FAT^18,23，但作如下修改。
2. 用镊子轻轻将脑组织与相连的神经组织分离，并将脑组织转移至无菌压舌板上。切取包含脑干和小脑的脑组织横截面^18,23。通过轻触脑组织切面进行压印涂片，并将载玻片压在镜头纸上以去除多余组织。
3. 用丙酮在 -20 °C 下固定载玻片 30 分钟。在用结合物染色前，将待检样本载玻片以及阳性和阴性对照载玻片干燥。
4. 强烈推荐使用两种市售的FITC标记抗狂犬病病毒抗体对丽沙病毒抗原进行染色²³。首次染色前应确定市售结合物的工作浓度。将稀释后的结合物经0.45 μM针头滤器滴加到载玻片上，置于湿盒中于37 °C孵育30分钟。
5. 孵育后，倾去载玻片上多余的结合物，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤载玻片。
6. 在载玻片上滴加少量10%甘油，加盖盖玻片。
7. 用荧光显微镜观察载玻片。

5. 核酸提取

1. 向脑组织中加入适量体积的 MEM-10（添加 10% 胎牛血清的最低必需培养基），使组织浓度达到 10%（w/v）。
2. 使用 5 mm 钢珠在匀浆仪中匀浆脑组织，然后以 825 × g 离心 10 分钟。
3. 使用市售的全自动总核酸提取试剂盒，从 200 μL 上清液中提取核酸，最终洗脱体积为 50 μL。

6. 逆转录 PCR 与系统发育分析

注意：已有多种引物组发表，可用于检测所有已知的丽沙病毒或特定的丽沙病毒。此处描述的方案仅为本实验室所使用的一个示例，可能并不适用于所有实验需求。请根据实验室的具体需要选择合适的引物。

1. 按如下方法配制一步法 RT-PCR 试剂：将 5 μL 提取的核酸加入反应体系中，反应体系包含 2.5 μL 10x 反应缓冲液、0.5 μL 正向引物和反向引物（各 10 μM）、4 μL 1.25 mM dNTP、0.3 μL RNase 抑制剂（40 U/µL）、0.3 μL 逆转录酶（10 U/µL）、0.4 μL DNA 聚合酶（5 U/µL）以及 11.5 μL 经 DEPC 处理的水。
   注意：本方案中使用的引物组为 JW12（5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3'）和 N165-146（5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3'）²⁴。应根据所使用的引物组调整试剂配制和扩增条件。
2. 在以下条件下进行扩增循环：42 °C 孵育 40 分钟；94 °C 初始变性 10 分钟；进行 35 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 30 秒、55 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 30 秒；最后在 72 °C 延伸 10 分钟。
3. 使用其他一种或多种引物组以提高诊断灵敏度。
   1. 使用 N113F（5'-GTAGGATGCTATATGGG-3'）和 N304R（5'-TTGACGAAGATCTTGCTCAT-3'）^25,26 配制一步法 RT-PCR 试剂：将 5 μL 提取的核酸加入反应体系中，反应体系包含 5 μL 10x 缓冲液、5 μL 正向引物和反向引物（各 4 μM）、5 μL 1.25 mM dNTP、0.5 μL RNase 抑制剂（40 U/µL）、0.2 μL 逆转录酶（10 U/µL）、1 μL DNA 聚合酶（5 U/µL）以及 23.3 μL 经 DEPC 处理的水。
   2. 在以下条件下进行扩增循环：42 °C 孵育 40 分钟；95 °C 初始变性 5 分钟；进行 35 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 1 分钟、55 °C 退火 1 分 20 秒、72 °C 延伸 1 分钟；最后在 72 °C 延伸 10 分钟。
      注意：根据实验室需求选择合适的引物用于诊断。N113F 最初设计用于狂犬病病毒扩增，但可能对其他丽沙病毒效果不佳。N113F 与 N304R 引物组对狂犬病病毒（中国台湾雪貂獾变异株）和中国台湾蝙蝠丽沙病毒具有良好扩增效果。若上述两组引物均可扩增出丽沙病毒，则联合使用 JW12 与 N304R 引物组更易获得完整的核蛋白基因序列。
4. 将 PCR 产物通过 2% 琼脂糖凝胶电泳进行分析，并在紫外光下观察成像。
5. 将 PCR 产物送至商业测序服务机构进行测序。
6. 将测序结果输入或上传至核苷酸基本局部比对搜索工具（BLAST）网页。选择 "others (nr etc.)" 数据库，并将生物体设置为 Lyssavirus。选择 MegaBlast 算法并运行 BLAST 分析。

7. 病毒分离

注意：当 FAT 或 RT-PCR 检测任一结果为阳性时，进行病毒分离。

1. 将脑组织样本在 MEM-10 中制成 10% (w/v) 的悬浮液并匀浆。在 825 × g 条件下离心 10 分钟。
2. 取 200 µL 上清液与 1 mL MEM-10 中含 3 × 10⁶ 个 MNA（小鼠神经母细胞瘤）细胞的悬浮液混合，于 37 °C、含 1% CO₂ 条件下孵育 1 小时。将脑匀浆-细胞悬浮液转移至 25 cm² 培养瓶中，并加入 6 mL MEM-10。
3. 同时，将 1 mL 脑匀浆-细胞悬浮液接种于带有直径 6 mm 孔的四孔特氟龙包被玻片中进行培养。
4. 在 37 °C、含 1% CO₂ 条件下孵育 3–4 天后，用 100% 丙酮（v/v）固定四孔玻片上的细胞。
5. 按照步骤 4.4–4.7 使用两种 FITC 标记的抗狂犬病病毒抗体对玻片进行染色。当观察到胞质内包涵体时，表明细胞已被感染。记录感染细胞的百分比。
6. 当玻片染色结果为阴性时，对已接种的细胞培养物进行胰蛋白酶消化和传代：
   1. 移除培养基，并用 5 mL PBS 清洗培养瓶。
   2. 向培养瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶，并用力敲击瓶底。
   3. 加入 6 mL MEM-10，重悬细胞。
   4. 将细胞悬浮液转移至新的组织培养瓶（6 mL）和四孔玻片（1 mL）中。
7. 重复步骤 7.4–7.6，直至达到 100% 感染率。
8. 孵育 24 小时后收集上清液。

结果

2014年至2017年5月期间，共采集了来自13个物种的332具蝙蝠尸体用于监测。其中两例检测结果为阳性。在第一例蝙蝠病例中，使用一种商用FITC标记的抗狂犬病抗体通过FAT检测脑组织压片结果为阴性（图2），而采用两对引物（JW12/N165-146、N113F/N304R）进行的RT-PCR均获得阳性结果（图3）。获得了一段428 bp的扩增子序列（使用N113F/N304R引物扩增，包含部分核蛋白基因）。该序列通过GenBank数据库进行BLAST比对分析，结果显示该序列与丽沙病毒属（lyssaviruses）相似，但同源性低于79%（图4），支持所检测到的病毒为丽沙病毒属成员的鉴定结论。

随后，从这两个脑组织中成功分离出两种丽沙病毒，并通过荧光抗体检测法（图5）和测序分析确认了病毒的存在。根据序列分析结果，鉴定出的丽沙病毒被命名为中国台湾蝙...

讨论

本实验室标准操作程序（SOP）提供了一套用于检测中国台湾蝙蝠样本中丽沙病毒抗原的系列流程。关键步骤包括使用荧光抗体试验（FAT）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。合适的样本选择以及病毒的成功分离也至关重要。此外，在蝙蝠丽沙病毒监测过程中还进行了一些问题排查。主要区别在于目标动物的不同。最初（2008–2009年），蝙蝠丽沙病毒监测的目标动物为活体蝙蝠，这些蝙蝠在中国台湾金门岛被捕获，经安乐死后进行丽沙病毒检测。大多数被捕获的蝙蝠健康状况良好，携带丽沙病毒的可能性较低，且此种监测方式不符合动物福利原则。因此，从第三年开始，仅收集死亡或濒死的蝙蝠，并将监测范围从区域性扩展至全国性。经过连续八年的监测，中国台湾最终首次检测到蝙蝠丽沙病毒病例。

尽管荧光抗体技术（FAT）是狂犬病诊断最广泛使用的方法，并被世界动物卫生组织（OIE）和世界卫生组织（WHO）推荐¹⁸，但已有少数研究显示，当FAT中使用不同的结合物时，结果存在不一致的情况^5,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.5% 胰蛋白酶 (10x)	Gibco	15090046	胰蛋白酶
25 cm2 培养瓶	Greiner bio-one	690160
丙酮	Honeywell	32201-1L
琼脂糖 I	VWR Life Science	97062-250
酒精	NIHON SHIYAKU REAGENT	NS-32294
AMV 逆转录酶	Promega	M5101
抗生素-抗真菌素(100X)	Gibco	15240-062	MEM-10
刀片	Braun	BA215
离心机	eppendorf	5424R
化学发光系统	TOP BIO CO.	MGIS-21-C2-1M
收集管	Qiagen	990381
收集管	SSI	2341-SO
盖玻片	Muto Pure chemical Co., LTD.	24505
DNA 分析仪	Applied Biosystems	3700XL
胎牛血清	Gibco	10437028	MEM-10
FITC 抗狂犬病单克隆球蛋白	Fujirebio Diagnostic Inc.	800-092	FITC 标记的抗狂犬病抗体：试剂 B
四孔特氟龙涂层玻片	Thermo Fisher Scientific	30-86H-WHITE
凝胶电泳系统	Major Science	MJ-105-R
HBSS (1x)	Gibco	14175095	胰蛋白酶
培养箱	ASTEC	SCA-165DS
倒置显微镜	Olympus	IX71
L-谷氨酰胺 200 mM (100x)	Gibco	A2916801	MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS 狂犬病 FAT 试剂	EMD Millipore Corporation	5100	FITC 标记的抗狂犬病抗体：试剂 A
MagNA Pure Compact 仪器	Roche	03731146001
MagNA Pure Compact 核酸分离试剂盒 1	Roche	03730964001
MEM (10x)	Gibco	11430030	MEM-10
MEM 非必需氨基酸 (100x)	Gibco	11140050	MEM-10
MEM 维生素溶液	Gibco	11120052	MEM-10
NaHCO3	Merck	1.06329.0500	MEM-10
针头	Terumo	NN*2332R9
PBS	Medicago	09-8912-100
引物合成	Mission Biotech
RNasin 核糖核酸酶抑制剂	Promega	N2111
测序服务	Mission Biotech
载玻片	Thermo Scientific	AA00008032E00MNT10
丙酮酸钠 (100 mM)	Gibco	11360070	MEM-10
不锈钢珠	QIAGEN	69989
无菌吸水垫	3M	1604T-2
注射器滤器	Nalgene	171-0045
Taq 聚合酶	JMR Holdings	JMR-801
PCR 仪	Applied Biosystems	2720
TissueLyser II	QIAGEN	85300
压舌板	HONJER CO., LTD.	122246
镊子	Tennyson medical Instrument developing CO., LTD.	A0601
酒石酸泰乐菌素	Sigma	T6271-10G	MEM-10