通过粪便DNA完整性检测评估结直肠癌风险与患病率

摘要

本文介绍的诊断用FL-DNA试剂盒是一种省时且操作简便的方法，可用于确定结直肠癌病变存在的可靠概率。

摘要

如今，粪便DNA可通过多种方法进行分离和分析。粪便中较长的DNA片段可通过qPCR检测，从而可靠地评估是否存在结直肠癌前病变或肿瘤性病变。该方法称为荧光长片段DNA检测（FL-DNA），是一种快速、无创的检测手段，是对现有初级预防体系的改进。该方法基于对粪便DNA完整性的评估，通过定量扩增基因组DNA的特定靶标实现。特别是，检测长度超过200 bp的DNA片段，可实现对结直肠病变患者的高特异性识别。然而，该系统以及目前所有可用的粪便DNA检测方法均存在一些需要解决的普遍问题（例如，检测应进行的频率，以及每位个体在每个时间点采集的最佳粪便样本数量）。但FL-DNA的主要优势在于，可将其与目前结直肠癌筛查项目中已使用的检测方法——基于免疫化学法的粪便隐血试验（iFOBT）联合应用。事实上，这两种检测可在同一样本上同时进行，从而降低成本，并更准确地预测结直肠病变的存在与否。

引言

结直肠癌（CRC）源于一个多阶段过程，健康的上皮细胞逐渐发展为腺瘤或息肉，并随时间推移进展为恶性癌^1,2。尽管结直肠癌发病率较高，但在过去十年中，其死亡率呈下降趋势³。事实上，筛查项目中采用的早期诊断工具已实现了对癌前腺瘤或息肉的早期发现和切除⁴。然而，由于各种技术局限性，目前尚无一种方法能够达到理想效果。因此，为了提高敏感性和特异性，已提出多种粪便DNA检测方法，可单独使用或与现有的常规诊断检测联合使用^5,6。

通常，健康的黏膜会向粪流中脱落凋亡的结肠上皮细胞，而病变的黏膜则会脱落非凋亡的结肠上皮细胞。长度在200 bp或以上的DNA片段是非凋亡DNA的特征。这种DNA被称为长链DNA（L-DNA），现已成为结直肠癌（CRC）早期诊断中可利用的生物标志物。L-DNA可从粪便样本中分离，并通过使用体外诊断FL-DNA试剂盒进行qPCR定量检测^7,8,9,<....

方案

患者于2013年至2015年间在意大利梅尔多拉（FC，意大利）的罗马涅肿瘤研究与治疗科学研究所（IRST）招募。入组患者纳入由IRST - IRCCS AVR伦理委员会批准的协议IRSTB002（批准日期：2012年10月25日，版本1）。所有方法均按照相关指南和法规进行。所有患者均签署了书面知情同意书。

1. 从粪便中提取DNA

1. 使用试剂盒制备粪便样本（参见材料表）。根据制造商说明书进行提取操作，选择并处理粪便材料。纯化后的DNA可直接进行扩增，或于-20 °C保存以备后续分析。

2. 阳性对照、标准品、加标 DNA 及临床样本的制备

1. 标准品和样本的制备
   1. 为制备阳性对照、标准品、内参DNA以及所有临床样本，先将阳性对照、标准品和内参DNA的各份样品离心，然后加入适量提供的水重新悬浮各试剂（见下文）。随后，轻轻涡旋混匀阳性对照、标准品和内参DNA，再离心10秒。为确保干粉试剂完全重悬，在使用前将液体试剂在室温（RT）下静置30分钟。
      1. 阳性对照为人源DNA的干粉形式。每份样品用750 µL水重悬。
      2. 内参DNA为鲑鱼（Oncorhynchus keta）DNA，作为外源性内参对照，用于验证从粪便样本中提取....

结果

本方案的工作流程如图1所示。该流程包含两个质控步骤，并根据这些步骤的结果采取不同的操作。首先，如果样本的对照结果不符合要求，则必须重复扩增步骤。其次，如果扩增受到抑制，则必须从起始步骤重新处理样本，或将其判定为无检测价值。

图2显示了阳性样本和阴性样本产生的荧光曲线。（A）展示的是一个合适的阳性样本示例。该样本在HEX通道的信号处于可接受范围内，且FAM通道的阳性信号高于阈值。（B）展示的是一个合适的阴性/非阳性样本示例。该样本在HEX通道的信号处于可接受范围内，且FAM通道的阴性对照信号低于阈值。（C）展示的是一个不合适的样本示例。该样本在HEX通道的信号不在可接受范围内，因此可推测可能存在抑制作用。该样本必须从提取步骤开始重新检测。

讨论

先前的研究表明，通过人工和半自动方法提取的粪便样本进行DNA完整性分析，可作为结直肠病变早期检测的一种替代工具^{7,8,9,10,11,12}。多年来，已开发出多种用于结直肠癌检测的分子生物学无创筛查方法，但与其它筛查手段相比，这些方法因耗时较长且成本效益较差，其广泛应用受到限制。

这种方法相对便宜且不太耗时。由于新流程所需的 manual 步骤较少，因此在检测结直肠病变方面具有更高的准确性。本文所述方法操作快速、manual 步骤少，每周可轻松处理大量样本。DNA 提取过程无特殊困难，既可通过简单的 manual 操作完成，也可使用自动仪器进行。在后一种情况下，有必要确定能够获得最可重复结果的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 和 2 mL 聚丙烯旋盖管（无 DNase、RNase、无 DNA、无 PCR 抑制剂）			DNA 提取和实时 PCR 所需耗材
无水乙醇（分析纯级别）			DNA 提取所需试剂
台式离心机			最大转速为 20000 × g。DNA 提取所需仪器
EasyPGX 分析软件版本 2.0.0	Diatech Pharmacogenetics	RT800-SW	分析软件
EasyPGX 离心/涡旋 8 孔条	Diatech Pharmacogenetics	RT803	推荐用于实时 PCR 检测的仪器
EasyPGX qPCR 96 孔仪器	Diatech Pharmacogenetics	RT800-96	推荐用于实时 PCR 检测的仪器
EasyPGX ready FL-DNA 试剂盒	Diatech Pharmacogenetics	RT029	实时 PCR 检测所需试剂盒
微量移液器（体积范围 1 至 1.000 µL）			DNA 提取和实时 PCR 所需耗材
无粉一次性手套			DNA 提取和实时 PCR 所需耗材
QIAamp Fast DNA Stool 试剂盒	Qiagen	51604	推荐用于粪便样本 DNA 提取与纯化的试剂盒
无菌滤芯吸头（无 DNase、RNase，体积范围 1 至 1.000 µL）			DNA 提取和实时 PCR 所需耗材
加热模块，例如 EasyPGX 干式加热块	Diatech Pharmacogenetics	RT801	DNA 提取所需仪器
涡旋振荡器，例如 EasyPGX 离心/涡旋 1.5 ml	Diatech Pharmacogenetics	RT802	DNA 提取所需仪器