我们描述了一种处理接受抗逆转录病毒治疗的慢性HIV感染者支气管肺泡灌洗液及其配对的外周血的方法，以评估肺部HIV储存库。这些方法可获得高纯度的CD4 T细胞和肺泡巨噬细胞，随后可用于通过超敏聚合酶链式反应进行免疫表型分析以及HIV DNA/RNA定量。
方法文章
支气管肺泡灌洗液及配对血液样本中肺泡巨噬细胞和CD4+ T细胞免疫表型分析与HIV储存库评估的处理方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
支气管镜检查是一种医疗操作，通过支气管镜将生理盐水注入肺部，随后施加负压吸引，回收支气管肺泡灌洗（BAL）液。BAL液富含细胞，因此可提供肺部免疫微环境的“快照”。CD4 T细胞是目前研究最清楚的HIV储存库，同时有充分证据表明组织巨噬细胞（包括肺泡巨噬细胞，AMs）也可作为病毒储存库。然而，关于AMs在HIV储存库建立与维持过程中的具体作用，目前仍有许多未知之处。因此，建立一套用于处理BAL液以获取可用于病毒学和免疫学检测的细胞的实验方案，对于阐明肺部作为HIV储存库的作用具有重要意义。本文介绍了一种采用常规技术（如简单离心和流式细胞术）处理BAL液的标准化流程。所获得的CD4 T细胞和AMs可用于后续实验，包括免疫表型分析以及HIV DNA和RNA的定量检测。
引言
治愈HIV感染面临的最重要挑战之一是潜伏性HIV储存库的存在，这种储存库可在抗逆转录病毒治疗（ART）中断后导致血浆病毒血症反弹1,2。尽管在长期ART治疗期间，HIV储存库在多个组织区室（包括次级淋巴器官、肠相关淋巴组织（GALT）和中枢神经系统（CNS））中已有充分记录，但自ART前时代以来，肺部一直被忽视为研究领域3。然而，肺部在HIV的发病机制中起着核心作用。事实上，肺部症状是艾滋病相关机会性感染最早的表现之一4。即使在现代ART时代，HIV感染者比未感染HIV者更易罹患感染性和非感染性肺部疾病。例如，HIV感染者发生侵袭性Streptococcus pneumoniae感染以及慢性阻塞性肺疾病（COPD）的风险升高5,6。此外，结核病（TB）与HIV共感染在世界某些地区（尤其是撒哈拉以南非洲）是一项重大的公共卫生挑战，因为HIV感染者患结核病的可能性是未感染HIV者的16至27倍7。尽管已有研究提出了一些解释HIV感染者对肺部感染和慢性疾病易感性的机制8,9,10，但对于病毒血浆载量已被抑制的HIV感染者仍面临更高肺部并发症风险的精确细胞机制，尚未完全阐明。重要的是，无论吸烟状况如何，HIV本身都是肺部感染和慢性疾病的一个极强风险因素6。
因此，分析肺部的免疫微环境对于理解其在健康与疾病中的作用至关重要。尽管诱导痰样本属于无创采集方式，但通常含有大量上皮细胞和碎片，而肺部淋巴细胞稀少，且不含肺泡巨噬细胞（AMs），这限制了其仅适用于特定应用场景。相反，由于存在显著出血和气胸（肺塌陷）的风险，在无疑似疾病的情况下无法获取较大的组织活检样本。此外，大多数肺部免疫细胞主要位于黏膜层面，此处肺部在呼吸过程中持续受到抗原刺激。为此，支气管镜检查获取支气管肺泡灌洗液（BAL）的优势在于能够相对安全地获取淋巴细胞和肺泡巨噬细胞（参见图1）。在支气管肺泡灌洗液中，巨噬细胞占细胞总数的最大比例，其次为淋巴细胞11。因此，建立一种可用于后续实验应用（如免疫表型分析、细胞培养、转录组学或其他进一步应用）的支气管肺泡灌洗液处理方法具有重要意义。本文所述的支气管肺泡灌洗液处理方案改编自先前描述的一般性操作流程，并针对多种下游检测方法进行了优化。该方法可实现肺部淋巴样和髓样黏膜免疫细胞的分离，用于其表型与功能特征分析，以及对艾滋病病毒感染成人患者体内HIV储存库的评估。
为建立本方案，我们采用以下标准招募研究参与者15。参与者需满足以下条件方可纳入本研究：（1）接受抗逆转录病毒治疗（ART）至少3年；（2）病毒载量（VL）持续抑制至少3年；（3）CD4 T细胞计数≥200/mm3；（4）愿意接受研究性肺量测定和支气管镜检查。具有以下任一情况的患者被排除在研究之外：（1）支气管镜检查禁忌证；（2）高出血风险：存在凝血功能障碍，或正在接受华法林或氯吡格雷治疗；（3）血小板减少症（血小板计数低）；（4）活动性肺部感染或其他急性肺部病变；（5）妊娠或计划怀孕。
方案
本研究方案直接依据《赫尔辛基宣言》中的原则制定，并获得了麦吉尔大学健康中心机构审查委员会（RI-MUHC，编号#15-031）、魁北克大学蒙特利尔分校（UQAM，编号#602）以及蒙特利尔大学医院中心研究委员会（CR-CHUM，编号#15-180）的批准。
1. 支气管肺泡灌洗
注意：本节描述的支气管镜检查由持证呼吸科医生操作，并由呼吸治疗师协助完成16,17。
- 准备操作所需的器械，包括支气管镜和生理盐水。将局部麻醉喷雾喷至患者咽喉后部，应尽可能避免过度使用局部麻醉剂。将心电导联连接至胸部以监测心率和心律，并将血氧探头连接至一只手的食指以监测血氧饱和度。将鼻导管插入鼻孔以提供辅助氧气。
- 将患者置于仰卧位。在呼吸科医生或麻醉师在场的情况下，给予静脉镇静：咪达唑仑 0.01–0.04 mg/kg 和芬太尼 50–100 µg（以提高患者舒适度并减轻咳嗽反射）。
- 推进可弯曲支气管镜，直至其楔入目标亚段支气管。用注射器注入生理盐水（每次 50–60 mL），然后施加轻柔负压吸引（50–80 mmHg）。灌洗液将收集在注射器中，随后转移至收集容器。
- 重复灌洗，累计总量达 200–300 mL。若条件允许，应至少收集 100 mL 的支气管肺泡灌洗液（BAL 液）。
- 将 BAL 液置于冰上保存。
2. 支气管肺泡灌洗细胞的分离
注意：以下操作必须在生物安全柜（II 级，BSL2 或更高级别）中以无菌条件进行。
- 将BAL样本置于冰上，直至进行处理。
- 在原始收集管中涡旋混匀BAL样本，然后使用刻度移液管将其转移至50 mL离心管中。如果BAL液体明显浑浊或被丝状组织污染，则通过70 µm尼龙滤网过滤液体至新的50 mL离心管中。
- 在4 °C条件下以200 × g离心10分钟。将上清液转移至新的50 mL离心管中。用移液器吸头轻轻吹打沉淀物，并将其重悬于1 mL RPMI 1640培养基中。
- 将1 mL上清液分装至10个1.5 mL微量离心管中，剩余上清液按每管10 mL分装至15 mL离心管中。所有上清液样品均储存于-80 °C。
- 处理BAL细胞沉淀。
- 每25 mL原始样本加入10 mL RPMI 1640培养基重悬沉淀，于4 °C以200 × g离心10分钟。将上清液转移至新的15 mL离心管中（确认沉淀中有足够细胞后弃去）。
- 用1 mL RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清，FBS）重悬沉淀，使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞计数。
注意：如果在分选前未通过细胞贴壁法分离BAL液体，则直接进入第4节。
3. 支气管肺泡灌洗细胞的黏附（可选）
注意：此替代方案可在细胞分选之前或代替细胞分选进行。以下操作必须在生物安全二级（BSL2）或更高级别的生物安全柜中以无菌条件进行。
- 将用于分选的所需数量的支气管肺泡灌洗（BAL）细胞转移至新的15 mL离心管中，并调整体积至每毫升含1.5 × 106个巨噬细胞。每孔加入2 mL细胞悬液至6孔板中，在37 °C、5 % CO2条件下孵育2小时，以使细胞充分贴壁。
- 孵育结束后，小心吸除含有非贴壁细胞的培养基，并将其转移至15 mL离心管中。在室温（RT）下以300 × g离心10分钟。弃去上清液，用含2 % FBS的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，浓度为1 × 107个细胞/mL，然后将细胞悬液转移至5 mL圆底聚苯乙烯管中。此淋巴细胞组分现已准备好用于细胞染色及分选。
- 向6孔板中剩余的贴壁细胞每孔加入1 mL细胞解离液（见材料表），在37 °C、5 % CO2条件下孵育至少15分钟，直至用移液器枪头可轻松使细胞从孔板表面脱落。
- 使用移液器枪头轻柔而彻底地刮下孔板表面的贴壁细胞，并利用孔内1 mL液体辅助细胞脱落。将细胞转移至新的15 mL离心管中。用1 mL PBS洗涤各孔，并将洗涤液一并加入该离心管中。最后用PBS将管内液体体积补足至5 mL。
- 在室温（RT）下以300 × g离心10分钟。弃去上清液，用含2 % FBS的PBS重悬细胞，浓度为1 × 107个细胞/mL，然后将细胞悬液转移至5 mL圆底聚苯乙烯管中。此髓系细胞组分现已准备好用于细胞染色及分选。
4. 外周血单个核细胞的分离
注意：以下操作必须在生物安全二级（BSL2）或更高级别的生物安全柜中以无菌条件进行。
- 在支气管镜检查的同一天（通常在BAL采集前直接进行），从供体采集六管静脉血，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管（每管约10 mL）。
- 将血液样本在室温下以300 × g 离心15分钟进行分离。将血浆分装至1.5 mL微量离心管中，每管1 mL，随后在-80 °C保存。
- 进行密度梯度分离。
- 向每管血液中加入2 mL RPMI 1640培养基，并使用移液管充分混匀。
- 转移至3个50 mL离心管中，并用RPMI 1640补足每管体积至25 mL。
- 另准备一组3个50 mL离心管，每管加入20 mL室温的淋巴细胞分离液（LSM）（参见材料表）。将25 mL稀释后的血液沿管壁缓慢而轻柔地叠加至LSM液面上方，操作时保持离心管倾斜约45°角。
- 在室温下以600 × g 离心25分钟，离心过程中设置低加速度，不设减速（关闭刹车）。
- 对外周血单个核细胞（PBMCs）进行洗涤。
- 使用移液管将离心管中两液相界面处的细胞层转移至50 mL离心管中；若总体积超过30 mL，则分装至两个离心管中。每管用PBS补足体积至50 mL。
- 在室温下以700 × g 离心5分钟，尽可能吸除上清液。
- 重悬细胞沉淀，并用PBS补足体积至25 mL。在室温下以350 × g 离心10分钟，尽可能吸除上清液。
- 重复步骤4.4.3中所述的洗涤步骤。
- 将细胞沉淀重悬于5 mL PBS + 2% FBS中，并进行细胞计数。
5. 全BAL细胞和PBMCs的分选
注意：以下操作必须在生物安全二级（或更高级别）的无菌条件下进行。
- 准备分选缓冲液，含 PBS + 5% FBS + 25 mM HEPES（pH 7.4）。准备若干 5 mL 圆底聚苯乙烯管，每管加入 1 mL FBS，用于收集分选后的细胞亚群。
- 进行染色。
- 准备 3 个 5 mL 圆底聚苯乙烯管，分别用于支气管肺泡灌洗液（BAL，全细胞或贴壁后淋巴细胞和髓系细胞组分）和外周血单个核细胞（PBMCs）（见第 4 节）。对每个细胞亚群，准备一管用于分选的细胞，以及两管各含 5 × 105 个细胞的对照管，分别用于未染色和活率染色补偿对照。
- 在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将对照组细胞重悬于 100 µL PBS 中，并在 4 °C 保存，直至按步骤 5.2.6 所述制备补偿对照。
- 用 PBS + 5% FBS 将 Fc 受体（FcR）阻断试剂稀释至 1:20（参见材料表，以防止抗体非特异性结合至表达 FcR 的细胞上的 Fc 受体）。将待分选细胞以 1 × 107 个细胞/250 µL 的浓度重悬于 FcR 阻断混合液中，在 4 °C 孵育 1 小时。
- 孵育后，向细胞中加入适当的抗体混合物（见表 1），在 4 °C 避光孵育 1 小时。
- 染色 1 小时后，向细胞中加入 1 mL PBS，在 4 °C 以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于分选缓冲液中，调整至 1 × 107 个细胞/250 µL。如需要，通过 70 µm 滤膜过滤细胞。
- 制备补偿对照。
- 在微量离心管中，每 1 mL PBS 加入抗小鼠 Ig、κ 链及阴性对照补偿微珠各三滴（参见材料表），混匀后取 100 µL 分装至各 5 mL 圆底聚苯乙烯管中用于补偿对照。每种抗体混合物中含有的荧光染料均需准备一管单独的补偿管。
- 将抗体混合物中的每种抗体各取 1 µL，分别加入含有微珠的不同试管中。另取 1 µL 活率染料加入步骤 5.2.1 中预留的一管含 5 × 105 个细胞的试管中。在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
- 向每管中加入 1 mL PBS，在 4 °C 以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 250 µL PBS 中，避光保存于 4 °C，待用时取出。
- 通过荧光激活细胞分选（FACS）将细胞分选至预先加入 1 mL FBS 的收集管中，并轻轻旋转混匀，使血清均匀涂布于管壁。
- 以低压条件分选 BAL 细胞。首先设门排除噪声信号，选择活的、CD45+ 细胞，并在此群体中进一步排除双联体细胞（见图 3）。在较大的髓系细胞群中，分选 CD206 和 CD169 双阳性细胞作为肺泡巨噬细胞（AMs）；在较小的淋巴细胞群中，分离 CD3+ 细胞，并分选 CD4 和 CD8 单阳性细胞亚群（见图 3；代表性结果部分详述了设门策略）。
- 分选 PBMCs 时，首先设门排除噪声信号，选择活的、CD45+ 细胞，并在此群体中排除双联体细胞。接着设门选择 CD3 细胞，在 CD3- 群体中先设门于 CD14，分选单阳性单核细胞；然后在 CD3+ 群体中设门于 CD4 和 CD8，分选两种单阳性细胞亚群（代表性结果部分详述了设门策略）。
6. 肺泡巨噬细胞和外周血单个核细胞的免疫表型分析
注意：以下操作必须在生物安全二级（BSL2）或更高级别的生物安全柜中以无菌条件进行。
- 分别向两个 5 mL 圆底聚苯乙烯管中各加入最多 100 万个 AM 和 PBMC。在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟，并弃去上清液。
- 进行 FcR 封闭以提高抗体染色的特异性。为此，将细胞重悬于 100 µL PBS + 2% FBS 中，并加入 1.4 µL FcR 封闭试剂。在 4 oC 下孵育 20 分钟。
- 进行细胞外染色。
- FcR 封闭孵育后，加入所需的细胞外抗体混合物，涡旋混匀各管，并在 4 °C 避光孵育 1 小时。
- 加入 500 µL PBS 洗涤两次，每次在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟。
- 进行固定和通透处理（所用具体试剂见材料表）。
- 按 1 份通透缓冲液与 3 份稀释缓冲液的比例配制通透溶液。将细胞沉淀重悬于 1 mL 通透溶液中，在 4 °C 避光孵育 40 分钟。
- 按 1 份洗涤缓冲液与 4 份 H2O 的比例配制洗涤溶液。向通透处理后的细胞中加入 2 mL 洗涤溶液，在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 进行细胞内染色。
- 将细胞重悬于 100 µL 1× 洗涤溶液中，加入所需的细胞内抗体，涡旋混匀各管，并在 4 °C 避光孵育至少 1 小时。
- 加入 2 mL 洗涤溶液，在室温下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 200 μL PBS 中。将细胞在 4 °C 避光保存至后续使用。
7. 支气管肺泡灌洗细胞的剩余部分
注意：以下操作必须在生物安全二级（BSL2）或更高级别的生物安全柜中以无菌条件进行。
- 在细胞数量允许的情况下，将支气管肺泡灌洗（BAL）细胞沉淀物（来自步骤 2.2.2）中的活细胞进行冷冻保存。
- 准备冻存液，其中含有 90% 胎牛血清（FBS）和 10% 二甲基亚砜（DMSO）。
- 在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 10 分钟，收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于 1.5 mL 冻存液中，转移至冻存管。将冻存管放入程序降温盒（见材料表），置于 -80 °C 保存。待温度稳定后，转移至液氮中进行长期保存。
- 将 BAL 细胞以干燥沉淀形式保存。
- 将剩余细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中，在台式离心机中以 6,000 × g 离心 1 分钟。尽可能吸除上清液，避免扰动沉淀。将沉淀物在 -80 °C 保存。
8. HIV DNA 和 RNA 定量
注意：以下操作必须在生物安全二级（BSL2）或更高级别的生物安全柜中以无菌条件进行。
- 总HIV DNA定量
- 为避免支气管肺泡灌洗液裂解物中的碎片对聚合酶链式反应（PCR）产生抑制作用，应使用DNA提取试剂盒（参见 材料表) 按照试剂盒说明书从BAL细胞样本中提取DNA。在下方所述的预扩增步骤（步骤8.1.3）中，取15 µL该DNA与主混合液共同使用。
- 制备标准曲线稀释液。
- 同上，使用DNA提取试剂盒从2 x 10的细胞沉淀中提取DNA6 ACH-2 细胞（参见 材料表).
- DNA洗脱后，对ACH-2 DNA进行连续10倍梯度稀释，制备6个稀释度，范围从3 × 105 将细胞调整至每15 µL含3个细胞。
- 进行预扩增步骤。
- 在另一个房间内，配制主混合液 n + 2 个样品，包含 1x 聚合酶缓冲液、3 mM MgCl2，300 µM dNTPs 和 2.5 U 的 Taq DNA聚合酶（参见 材料表）以及每种四种引物各300 nM（参见步骤8.1.3.2）。所有测定均需设置三个复孔。
- 使用引物 hCD3OUT5'、hCD3OUT3'、ULF1 和 UR1 扩增人 CD3 和 HIV 的 DNA（引物序列见 表 2）。注意，两个基因在同一个反应管中进行预扩增。轻轻混匀，并离心管子以确保充分混合。
- 在96孔PCR板中每孔加入35 µL主混合液，再加入15 µL标准品或样品DNA。总反应体积为50 µL。
- 进行预扩增（95 °C 变性 8 分钟，随后进行 12 个循环：95 °C 1 分钟、55 °C 40 秒、72 °C 1 分钟，最后 72 °C 延伸 15 分钟）。
- 进行实时荧光定量PCR。
- 为了定量 CD3 和 HIV DNA，配制两种含有 1x PCR 反应主混合液的主混合物（参见 材料表），1,250 nM 的特异性引物和 100 nM 的探针。使用引物 HCD3IN5' 和 HCD3IN3' 以及探针 CD3 FamZen 在一个反应中定量人 CD3，使用引物 UR2 和 LambdaT 以及探针 UHIV FamZen 在另一个反应中定量 HIV DNA（引物和探针序列见 表 2）。将每种混合液各13.6 µL分装至适用于qPCR的试管中。
- 将预扩增PCR产物用无菌、无DNase、无RNase、无蛋白酶的水按1:10稀释。取6.4 µL每种稀释后的样品，加入至含有13.6 µL qPCR混合液的适用于qPCR的管中 总体积为20 µL。
- 使用以下程序进行实时PCR：95 °C 变性4分钟，然后进行40个循环，每循环包括95 °C 3秒和60 °C 10秒，单次采集信号。
- 根据标准曲线推算每个反应管中HIV拷贝数和细胞等效数量。计算每10个细胞中的HIV DNA拷贝数。6 细胞
- HIV RNA 定量检测
- 使用RNA提取试剂盒从BAL细胞样本中提取RNA（参见 材料表根据制造商说明书进行操作。在下方所述的逆转录与预扩增步骤（步骤 8.2.4）中使用 17 µL 该 RNA。
- 体外合成并精确定量的LTR-gag RNA用作标准品；将其加入健康供体RNA提取物中用于GUSB归一化。对该标准品进行连续六次十倍梯度稀释, 对应于 3 x 105 细胞中LTR-gag RNA的三个拷贝，总体积17 µL。
- 将每种标准品稀释液和每个样本各17 µL分配至96孔PCR板中，并用DNase处理样本（参见 材料表在25 °C下孵育10分钟以去除污染的基因组DNA。加入2 µL 25 mM EDTA终止反应，并将样品在65 °C下孵育10分钟。
- 进行逆转录（RT）和预扩增PCR。
- 使用一步法 RT-PCR 试剂盒进行此步骤（参见 材料表）按照制造商说明书操作。使用引物GUSB forward 1、GUSB reverse 1、UR1和ULF1扩增人GUSB（作为内参基因）和LTR-gag HIV RNA的cDNA（引物序列见 表2GUSB 的数值将用于对 HIV 的数值进行标准化。
- 在含有经DNase处理的标准品和样品的同一96孔PCR板中，每孔加入31 µL的混合液，并充分混匀。总反应体积为50 µL。
- 按照制造商说明书进行16个循环的扩增，退火温度为55 °C。
- 进行实时荧光定量PCR。
- 配制两种主混合液，每种包含1× PCR反应主混合液（同上8.1.4.1步骤）、1250 nM的相应引物和100 nM探针。其中一种反应使用GUSB forward 2、GUSB reverse 2引物和GUSB-HEX探针定量GUSB cDNA；另一种反应使用UR2、LambdaT引物和UHIV FamZen探针定量HIV cDNA（引物序列见 表2).
- 将每种qPCR预混液各13.6 µL分装至适用于qPCR的试管中。用无DNase、RNase和蛋白酶的无菌水将逆转录预扩增PCR产物按1:10稀释，然后向相应的PCR混合液中加入6.4 µL每种稀释后的样品或标准品。总体积为20 µL。
- 使用以下程序进行实时PCR：95 °C 变性4 min，然后进行40个循环（95 °C 3 s，60 °C 10 s），每个循环采集一次荧光信号（FamZen选择绿色通道，HEX选择黄色通道）。
结果
在大多数非吸烟者中，支气管肺泡灌洗液（BAL）被收集于无菌容器中，呈略显浑浊的淡黄色至橙色液体。如果供体在支气管镜检查期间接受了支气管内活检并出现少量出血，则液体颜色可能偏粉红色。若供体为吸烟者，液体颜色可能更深。离心后，BAL 上清液几乎透明并略带橙色，而细胞沉淀的颜色则从灰白色到深棕色不等，具体取决于样本状态以及供体是否吸烟。
计数整个支气管肺泡灌洗（BAL）样本时，可观察到不同类型的细胞，包括直径约17 µm的较大圆形巨噬细胞和直径约7.3 µm的较小圆形淋巴细胞18,19（见图2）。吸烟者的巨噬细胞体积增大，约增加40%18。不同细胞类型的形态差异使得巨噬细胞和淋巴细胞可被分别计数。视野中也可能存在一些碎片，尤其是在吸烟者样本中更为明显。巨噬细胞是BAL中最丰富的细胞类型，在非吸烟者中约占细胞总数的85%20，而在吸烟者中其比例进一步升高，可能显得几乎占绝对优势。
BAL 细胞容易发生聚集，因此在所有操作过程中必须充分混匀。即使经过多次洗涤步骤，沉淀物仍可能呈现较深颜色。若染色后用于细胞分选的细胞悬液中可见丝状碎片，则应将细胞通过一个 70 µm 在通过细胞分选仪运行之前进行过滤。
分选支气管肺泡灌洗（BAL）细胞时必须采用低压力，以确保液滴足够大，能够容纳巨噬细胞。首先对所有 CD45+21 细胞设门，然后根据细胞活性设门，以排除所有死细胞（见图3）。接着选择单细胞群体，在该群体中根据细胞大小和形态分为两个亚群：较大的髓系细胞和较小的淋巴细胞（见图3）。在较大的细胞中，基于 CD20622,23 和 CD16922 进行设门，将双阳性细胞分选为肺泡巨噬细胞（AMs）；在较小的细胞中，选择 CD3+ 细胞，并进一步对 CD4 和 CD8 设门，分选 CD4 单阳性细胞和 CD8 单阳性细胞（见图3）。所使用的标记物是基于先前描述的肺泡巨噬细胞表型选择的，例如存在于吞噬细胞上的甘露糖受体 CD20623，以及唾液酸粘连素受体 CD16922。
分选PBMC时，首先根据前向散射和侧向散射对细胞设门，应显示出均一的淋巴细胞群体，取全部淋巴细胞，排除靠近零轴的噪声信号（数据未显示）。接着对细胞群体进行活率和CD45标记设门，选取活的CD45+细胞。然后对该群体进行CD3设门；为分离单核细胞，对CD3-群体进一步进行CD14设门，并分选所有单阳性细胞。为分离淋巴细胞亚群，对CD3+细胞进行CD4和CD8设门，并分选双单阳性细胞群体。
图1：实验方案概览。 示意图展示了本实验方案的工作流程，包括所获得样本的潜在后续应用。PBMC = 外周血单个核细胞；BAL = 支气管肺泡灌洗液；LSM = 淋巴细胞分离液。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：支气管肺泡灌洗液全液的显微镜视野。 显微镜图像来自（A）非吸烟者和（B）吸烟者，可见淋巴细胞 (L)、巨噬细胞 (M) 和红细胞 (RBC)。放大倍数为 1,000 倍（10 倍目镜和 100 倍油镜）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：全支气管肺泡灌洗（BAL）细胞分选的代表性设门策略。 用于从全BAL细胞样本中分选肺泡巨噬细胞（AM）、CD4和CD8 T细胞的设门策略。请点击此处查看该图的放大版本。
| 样本 | 抗体 | 荧光染料 | 克隆号 | 每项检测用量 (µL) |
| 支气管肺泡灌洗液和外周血单个核细胞 | 活/死细胞染料 | APC-H7 | - | 1 |
| CD45 | PE-Cy7 | HI30 | 5 | |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 2 | |
| CD4 | PE-cy5 | RPA-T4 | 4 | |
| CD8 | BV605 | SK1 | 3 | |
| 仅支气管肺泡灌洗液 | CD206 | PE | 19.2 | 10 |
| CD169 | BB515 | 7-239 | 5 | |
| 仅外周血单个核细胞 | CD14 | BV786 | M5E2 | 5 |
表1：用于分选全支气管肺泡灌洗细胞和分离外周血单个核细胞的流式分选方案。
| 靶标 | 步骤 | 引物名称 | 引物序列 | |||
| HIV 总 DNA 或 HIV LTR-Gag RNA | 预扩增 PCR | UR1 | 5'-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3' | |||
| ULF1 | 5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3' | |||||
| 实时 PCR | UR2 | 5'-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3' | ||||
| LambdaT | 5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3' | |||||
| UHIV FamZen: | 5'-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3' | |||||
| CD3 DNA | 预扩增 PCR | HCD3 out 5' | 5'-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3' | |||
| HCD3 out 3' | 5'-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3' | |||||
| 实时 PCR | HCD3 in 5' | 5'-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3' | ||||
| HCD 3 in 3' | 5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3' | |||||
| CD3 FamZen: | 5'-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3' | |||||
| GUSB RNA | 预扩增 PCR | GUSB Forward 1: | 5’-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3’ | |||
| GUSB Reverse 1: | 5’- GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3’ | |||||
| 实时 PCR | GUSB Forward 2: | 5'-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3’ | ||||
| GUSB Reverse 2: | 5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3' | |||||
| GUSB-HEX: | 5'-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3' | |||||
表2：用于HIV DNA和RNA定量的引物和探针序列。
讨论
本文介绍了一种处理支气管肺泡灌洗液（BAL）以获取CD4 T细胞和肺泡巨噬细胞（AMs）的方法，同时获得配对的外周血单个核细胞（PBMCs），可用于研究肺部HIV病毒库。我们近期报道了对配对外周血与BAL样本中CD4 T细胞内HIV DNA的定量分析结果，本课题组已证实，肺部CD4 T细胞中的HIV含量是外周血CD4 T细胞的13倍15。然而，AMs中HIV DNA的水平具有供体依赖性，因此迄今为止，在淋巴细胞与巨噬细胞之间的HIV DNA水平尚未观察到一致的相关性15。然而，获得这些原代巨噬细胞亚群对于深入探究这一问题、并更好地理解HIV病毒库背景下肺部病毒载量至关重要。
在抗逆转录病毒治疗（ART）前时代以及多项利用支气管肺泡灌洗液（BAL）的研究中，参与者接受支气管镜检查的目的是诊断疑似病理改变或对呼吸系统症状进行微生物学诊断3。然而，我们能够招募到无任何活动性肺部症状或病理改变的参与者，且所有参与者均签署了伦理知情同意书15。我们从本中心招募了正在参与其他研究的个体，例如阻塞性肺疾病肺量计筛查研究24，以及正在接受其他科研操作（如白细胞单采术和结肠镜检查）的个体。既往针对艾滋病病毒感染者的研究表明，利他主义是激励其参与科研研究的关键因素25。与许多人体样本类似，我们观察到个体之间的差异性较大。无法"预测"哪些参与者可获得细胞产量较高或较低的支气管肺泡灌洗液。与外周血（其淋巴细胞数量相对稳定）不同，支气管肺泡灌洗液中的细胞数量变异程度较大。向肺内注入更大体积的生理盐水（以期获得更多的灌洗液回收量）并不总是可行，因为较大体积的生理盐水常与更明显的咳嗽以及支气管镜检查后发热风险升高相关。我们注意到，使用直径较小（而非较大）的支气管镜有助于呼吸科医生更深入地进入支气管，从而获取含有更多细胞的灌洗液。一个一致的发现是，吸烟者的支气管肺泡灌洗液中肺泡巨噬细胞（AMs）的比例显著高于淋巴细胞，这是预料之中的现象，因为肺泡巨噬细胞会吞噬碎屑和颗粒物质。此外，我们观察到吸烟者的支气管肺泡灌洗液中含有可堵塞实验设备（如PCR仪和流式细胞仪）的碎屑。在空气污染严重或个体频繁暴露于空气质量较差环境的地区，也可能出现类似问题。
关于CD4 T细胞和AMs在HIV储存库形成及病毒持续存在中的作用，细胞纯度是一个关键考量因素。因此，我们选择使用荧光激活细胞分选（FACS）来获得高纯度的细胞群体。此外，在支气管镜检查过程中可能出现轻微出血，因此收集的支气管肺泡灌洗液（BAL）可能被血液污染；若样本中存在初始B细胞，则提示可能存在血液污染，此时可用红细胞裂解缓冲液洗涤细胞以解决该问题。研究BAL液的另一挑战在于炎症标志物和细胞因子的定量，而这些指标对于理解HIV的持续存在至关重要26。由于灌注的生理盐水会稀释BAL液，炎症介质和细胞因子的浓度可能难以准确测定。尽管已有研究提出采用尿素校正因子来校正稀释效应，但相关文献中对此方法的描述相对较少27,28。
肺泡巨噬细胞（AM）具有很强的自发荧光，这在细胞分选和流式细胞术表型分析过程中会带来问题。特别是对于吸烟者而言，其 AM 可能呈现完全黑色，显著增强其自发荧光强度。当使用标准的蓝色 488 nm 激光激发时，AM 的自发荧光在约 540 nm 处达到峰值，与常用荧光偶联物如 FITC 和 PE29，30 的荧光光谱重叠。值得注意的是，可使用两种不同的激光分别激发 FITC 和 PE（例如，用黄/绿激光激发 PE，用蓝色 488 nm 激光激发 FITC）。为克服 FITC 检测中固有的自发荧光干扰，我们使用未染色的 AM 样本确定自发荧光背景水平。此外，使用荧光减一（FMO）对照对于解决这些技术问题非常有帮助。在补偿巨噬细胞群体时，可使用较大尺寸的微球（例如 7.5 µm），相比用于补偿淋巴细胞群体的小微球（例如 3.0 µm），其尺寸更接近巨噬细胞。更理想的方法是使用少量细胞作为单染对照，针对特定亚群中已知高表达的标志物（如 HLA-DR 或 CD45），将这些标志物分别与目标荧光染料偶联，从而实现比微球补偿更精确的补偿调节。对于吸烟者的样本，该策略尤为有用，因为其巨噬细胞体积更大且自发荧光更强。此外，在样本制备阶段，可按照本方案第 3 节所述，先将整个支气管肺泡灌洗（BAL）样本在培养板中培养，利用细胞贴壁特性实现不同细胞群体的分离。通过这种方式，可将贴壁的巨噬细胞与非贴壁细胞（如淋巴细胞）分离开来。若将淋巴细胞与 AM 群体分开分析，补偿调节将变得容易得多；然而，依赖贴壁分离会导致部分巨噬细胞丢失，这在细胞数量本就有限的情况下需慎重权衡。此外，贴壁步骤可能导致贴壁单核细胞发生非预期激活，进而影响后续实验结果。因此，必须在获得更高纯度细胞群体的分选效率与可用于后续实验的细胞数量受限之间进行权衡。
其他模型，尤其是小鼠模型，已被用于研究巨噬细胞的免疫学特征和生物学特性。尽管这些模型极为有用，能够为难以操控的细胞类型提供深入的见解，但仍存在局限性。许多细胞表面标志物在小鼠与人类之间存在差异，导致人类肺泡巨噬细胞（AMs）的免疫表型尚未完全明确。此外，由于每只动物可获取的细胞数量较少，该模型系统需要合并多只小鼠的样本进行检测。同时，样本合并的做法排除了对遗传易感性和性别的考量。最近研究表明，由于限制因子SAMHD-1表达水平的差异，性别在HIV-1感染巨噬细胞的过程中起着一定作用31。非人灵长类动物（NHP）是与人类最接近的模型，促进了猴免疫缺陷病毒（SIV）感染及其对免疫系统影响的研究，有助于阐明组织驻留型巨噬细胞与单核细胞来源巨噬细胞的不同作用。在恒河猴中，已有研究显示，通过支气管肺泡灌洗（BAL）分离出的肺巨噬细胞含有具备复制能力的病毒；研究人员采用病毒扩增检测法（VOA）分析了SIV在组织驻留细胞中的行为32。这一发现具有重要的科研价值，但在应用于人类之前仍需在人体中加以验证，且由于使用非人灵长类动物成本高昂，难以开展大样本量的研究。此外，人类肺泡巨噬细胞还可广泛应用于其他多种研究，例如体外病毒/微生物感染检测，以及结核病/HIV共感染等其他病原体相关研究。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢以下资助机构：加拿大卫生研究院（CIHR）（资助号 #153082，授予 CC、MAJ、NC）；魁北克卫生研究基金会-传染病与艾滋病研究网络（FRQ-S），该机构为 CC 和 MAJ 提供了资助；麦吉尔大学医学院，该机构为 CC 提供了资助。本研究还部分得到了加拿大卫生研究院（CIHR）资助的加拿大艾滋病治愈研究团队（CanCURE）项目（HB2 – 164064，授予 MAJ、CC 和 NC）的支持。MAJ 担任加拿大卫生研究院（CIHR）免疫病毒学方向的加拿大研究主席二级职位，CC 和 NC 分别获得魁北克卫生研究基金会（FRQ-S）初级研究员一级和初级研究员二级研究薪金奖。ET 获得麦吉尔大学健康中心研究所（RI-MUHC）硕士研究生奖学金。
此外，作者谨向Josée Girouard以及所有参与样本协调与采集工作的临床工作人员和呼吸治疗师表示感谢；同时感谢RI-MUHC免疫表型分析平台的Ekaterina Iourtchenko、Hélène Pagé-Veillette和Marie-Hélène Lacombe；并感谢Marianna Orlova博士提供显微镜照片。最重要的是，作者衷心感谢众多志愿者，若无他们的参与，本研究将无法实现。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70 µm 无菌细胞筛 | Fisher Scientific | 22363548 | 70 微米尼龙网筛 µm孔过滤器用于在分选前去除BAL样本中的杂质 |
| ACH-2 细胞 | 美国国立卫生研究院 | 349 | 含单个整合前病毒拷贝且不表达CD4的HIV-1潜伏性T细胞克隆 |
| BD FACSAria | BD 生物科学 | N/A | 细胞分选仪（配置为可同时检测16种颜色） |
| BD LSRFortessa X-20 | BD 生物科学 | N/A | 流式细胞仪（配置为可同时检测14种颜色） |
| 支气管镜 | Olympus | BF-1TH190 | EEIII HD 治疗型支气管镜；工作通道宽度 2.8 mm；外径 6.0 mm |
| 细胞解离液 | Sigma | C5914 | 用于从塑料或玻璃表面温和解离贴壁细胞类型的非酶解体系 |
| CD169 BB515 | BD 生物科学 | 565353 | 用于流式细胞术的唾液酸结合分子抗体 |
| CD14 BV786 | BD 生物科学 | 563698 | 用于流式细胞术的内毒素受体抗体 |
| CD206 PE | BD 生物科学 | 555954 | 用于流式细胞术的甘露糖受体抗体 |
| CD3 Alexa700 | BD 生物科学 | 557943 | 用于流式细胞术的T细胞共受体抗体 |
| CD4 PE-Cy5 | BD 生物科学 | 555348 | 用于流式细胞术的T细胞共受体抗体 |
| CD45 PE Cy-7 | BD 生物科学 | 557748 | 用于流式细胞术的受体连接蛋白酪氨酸磷酸酶抗体 |
| CD8 BV605 | BD 生物科学 | 564116 | 用于流式细胞术的T细胞共受体抗体 |
| CompBead Plus | BD | 560497 | 抗小鼠 Ig, κ 用于优化流式细胞术中荧光补偿的阴性对照聚苯乙烯微粒 |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 将单链和双链DNA消化为含有5'磷酸的寡脱氧核糖核苷酸，以去除RNA中的DNA污染 |
| dNTP试剂盒 100 mM | Invitrogen | 10297-018 | 由四种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）组成，用于PCR |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D8418 | 用于配制保存活细胞的冷冻保护剂的非极性质子性溶剂 |
| EDTA | Invitrogen | AM9912 | 用于终止 DNase I 酶活性 |
| FBS | Wisent Bioproducts | 080-150 | 用于补充培养基的优质胎牛血清 |
| 人FcR封闭试剂 | Miltenyi | 130-059-901 | 与细胞表面的 Fc 受体结合，以防止流式抗体的非特异性结合 |
| FlowJo v10 | FlowJo LLC | N/A | 用于所有分析的流式细胞术分析软件 |
| HLA-DR BV650 | BD 生物科学 | 564231 | 用于流式细胞术的MHC II类细胞表面受体抗体 |
| HyClone HEPES 溶液 | Fisher Scientific | SH3023701 | 维持生理 pH 的缓冲液 |
| 活/死 APC-H7 | Invitrogen | L34975 | 用于流式细胞术的活力标记物 |
| 淋巴细胞分离液（LSM） | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | 用于从全血中分离PBMC的多糖蔗糖 |
| Mr. Frosty 冷冻容器 | 赛默飞世尔科技 | 5100-0001 | 确保降温速率接近 -1 的冷冻容器 °C/min，细胞保存的最佳速率 |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-41 | 用于PBMC样本补偿的小鼠、大鼠和仓鼠抗体 |
| PBS 1× | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | 用于细胞洗涤和染色的磷酸盐缓冲液 |
| PCR管 Corbett Rotor-Gene | Axygen | PCR-0104-C | 0.1 mL 容量的 4 孔 PCR 管，适用于 Corbett Rotor-Gene |
| PerfeCTa qPCR ToughMix | Quantabio | 95112 | 用于DNA模板PCR扩增的2倍浓度即用型反应预混液 |
| QiaAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | 用于分离基因组、线粒体、细菌、寄生虫或病毒DNA的试剂盒。包含QIAamp Mini Spin Columns、QIAGEN Proteinase K、试剂、缓冲液和收集管 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | 用于纯化多达 100 个样本的试剂盒 µ从细胞、组织和酵母中提取总RNA。包含RNeasy Mini离心柱、收集管、无RN酶的试剂和缓冲液 |
| Rotor-Gene Q | Qiagen | 9001550 | 实时荧光定量PCR仪 |
| RPMI 1640 1x | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | 细胞培养基 |
| 无菌水 | Wisent Bioproducts | 809-115-CL | DNase，RNase &且无核酸酶和蛋白酶 |
| 上标™ III 一步法 RT-PCR 系统 | Invitrogen | 12574018 | 单管一步法RT-PCR试剂盒，可同时进行cDNA合成与PCR扩增。包含SuperScript III RT/Platinum Taq混合酶、2×反应混合液（含每种0.4 mM dNTP、3.2 mM MgSO₄）及硫酸镁 |
| Taq DNA 聚合酶 | Invitrogen | 18038-042 | 一种耐热酶，在存在dNTP和引物的条件下，以单链DNA为模板合成DNA。包含Taq DNA Polymerase、10x PCR缓冲液、氯化镁 |
| 转录因子缓冲液套装 | BD 生物科学 | 562725 | 用于流式细胞术的细胞内染色缓冲液。包括固定/透化缓冲液、稀释缓冲液、透化/洗涤缓冲液 |
| 台盼蓝 | Sigma | T8154 | 使用血细胞计数板进行细胞计数时的活率染料 |
参考文献
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