一种用于检测丽沙病毒的通用巢式逆转录聚合酶链式反应的评估

摘要

已开发出一种广谱丽沙病毒巢式逆转录聚合酶链式反应，可特异性检测所有已知的丽沙病毒。使用不同动物种类的狂犬病脑组织样本进行验证表明，该方法的灵敏度和特异性与金标准荧光抗体检测相当，可用于常规狂犬病诊断。

摘要

为了检测弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）内的狂犬病毒及其他成员物种，已开发出一种泛狂犬病毒属嵌套式反转录聚合酶链式反应（nested RT-PCR）方法，用于扩增狂犬病毒属核蛋白（N）基因的保守区域。该方法以病毒RNA为模板，使用寡聚（dT）₁₅和随机六聚体作为引物进行反转录（RT），合成病毒互补DNA（cDNA）。随后，以病毒cDNA为模板，在第一轮PCR中利用外侧引物扩增出845 bp的N基因片段，再通过第二轮嵌套PCR利用内侧引物扩增出最终的371 bp片段。该方法可检测不同遗传谱系的狂犬病毒（RABV）。在中国为期10年的狂犬病临床诊断与监测中，使用8种家养动物共9,624份脑组织样本对该方法进行验证，结果显示，与世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）推荐的金标准方法——直接荧光抗体试验（FAT）相比，该方法的敏感性为100%，特异性为99.97%。此外，通过模拟检测所有狂犬病毒属合成N基因质粒的方法评估表明，该方法还可特异性扩增国际病毒分类委员会（ICTV）第十次报告中列出的另外15种已确认和2种新发现的狂犬病毒属物种的靶向N基因片段。该方法为狂犬病诊断提供了FAT之外的一种便捷替代方案，并已被批准为中国国家标准（GB/T36789-2018）。

引言

狂犬病是由Lyssavirus属病毒引起的一种全球性人畜共患病¹。丽沙病毒（Rhabdoviridae科）为单股负链RNA病毒，基因组大小约为12 kb，编码5种蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）以及大蛋白或RNA聚合酶（L）。  根据N基因的核苷酸序列、遗传距离和抗原模式，丽沙病毒被分为16个种，包括经典狂犬病毒（RABV）和狂犬病相关病毒（RRV）：拉各斯蝙蝠病毒（LBV）、杜文黑格病毒（DUVV）、莫科拉病毒（MOKV）、欧洲蝙蝠丽沙病毒1型（EBLV-1）、欧洲蝙蝠丽沙病毒2型（EBLV-2）、澳大利亚蝙蝠丽沙病毒（ABLV）、阿拉万病毒（ARAV）、伊科马病毒（IKOV）、博克洛蝙蝠丽沙病毒（BBLV）、甘诺鲁瓦蝙蝠丽沙病毒（GBLV）、伊尔库特病毒（IRKV）、胡占德病毒（KHUV）、西高加索蝙蝠病毒（WCBV）、希莫尼蝙蝠病毒（SHIBV）和莱里达蝙蝠丽沙病毒（LLEBV）²。最近又发现了两种新的丽沙病毒：Kotalahti蝙蝠丽沙病毒（KBLV），于2017年从芬兰的布兰特氏鼠耳蝠（Myotis brandtii）中分离获得³；以及中国台湾蝙蝠丽沙病毒（TWBLV），于2016–2017年间从中国台湾的日本伏翼（Pipistrellus abramus）中分离获得⁴。

所有哺乳动物均易感染狂犬病；然而，该病缺乏可识别的大体特异性病变或特异性的临床症状，因此只能通过实验室检测进行诊断⁵。目前最广泛使用的狂犬病诊断方法是荧光抗体检测法（FAT），该方法被世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）公认为金标准^5,6。然而，FAT在降解或自溶的脑组织样本上可能产生不可靠的结果。此外，该方法无法用于检测脑脊液（CSF）、唾液和尿液等生物液体样本，因此在生前诊断中的应用受到极大限制⁷。其他传统的替代诊断方法，如狂犬病组织培养感染试验（RTCIT）和小鼠接种试验（MIT），则需要数天时间⁶，这在需要快速诊断的情况下是一个主要缺点。

多种分子诊断检测方法（例如，通过逆转录聚合酶链式反应[RT-PCR]检测病毒RNA、PCR-酶联免疫吸附试验[PCR-ELISA]、原位杂交以及实时PCR）被用作狂犬病诊断的快速且敏感的技术⁸。目前，世界动物卫生组织（OIE）已推荐将RT-PCR用于常规狂犬病诊断，且在《陆生动物诊断试验与疫苗手册》中描述了一种半巢式（hn）PCR，用于检测所有丽沙病毒属（lyssaviruses）⁵。本文中，我们介绍一种广谱丽沙病毒巢式RT-PCR方法，可实现对全部18种丽沙病毒物种的特异且高灵敏度检测，其性能相当于甚至优于荧光抗体试验（FAT）。该方法的原理是首先将靶标RNA（丽沙病毒N基因的保守区域）逆转录为cDNA，随后通过两轮PCR扩增cDNA。第一轮PCR使用外侧引物，对cDNA进行扩增，产生一个845 bp的片段；第二轮PCR则以第一轮PCR的产物为模板，利用内侧引物扩增出一个371 bp的片段。两轮PCR显著提高了检测的灵敏度。

方案

本方案中使用小鼠的实验已获得中国军事医学科学院军事兽医研究所动物福利行政委员会（实验动物福利与使用委员会授权，许可证号 JSY-DW-2010-02）的批准。所有实验均遵循了机构和国家关于实验动物护理和使用的指导方针。

1. RNA 提取

1. 使用基于异硫氰酸胍-苯酚-氯仿的提取方法或市售的病毒RNA提取试剂盒，从疑似狂犬病的脑组织、皮肤活检样本、唾液、脑脊液或RABV感染的细胞培养物中提取RNA。提取的RNA应立即使用，或于-80 °C保存备用。

2. 病毒RNA的逆转录

1. 从冷冻柜中取出 表1 所列的反转录试剂，置于冰上，使用前使其充分解冻并涡旋混匀。
2. 在0.2 mL PCR管中，按照 表1 所列试剂配制12 µL反转录反应体系。为避免移液误差，应配制比实际所需反应数多至少一个反应体积的预混液。
3. 在模板操作间内的PCR工作站中，向反转录反应体系中加入8 µL待测样本、阳性对照RNA或阴性对照。反转录阳性对照为从感染固定毒株RABV CVS-11（challenge virus standard-11）的细胞培养物中提取的RNA，储存于-80 °C；阴性对照为无RNase的ddH₂O。
4. 通过涡旋充分混匀反转录反应管中的内容物，然后短暂离心。
5. 将反应管放入热循环仪中，设置cDNA合成程序如下：42 °C反应90分钟，95 °C变性5分钟，4 °C保存。设定反应体积为20 µL，启动反转录程序。

3. 第一轮 PCR

1. 将 表2 中列出的 PCR 试剂在洁净室中置于冰上保存直至使用；使用前解冻并涡旋混匀。
2. 在 0.2 mL 的 PCR 管中，使用 表2 中列出的试剂配制第一轮 PCR 反应体系。
3. 在模板室的 PCR 工作站内，向第一轮 PCR 反应体系中加入 2 µL 的 cDNA 或质粒样品。PCR 阳性对照为上述 RT 方法中步骤 2.3 所述制备的 CVS-11 cDNA。PCR 阴性对照为 ddH₂O。
4. 将密封的反应管转移至 PCR 扩增仪中，并按照 表3 中列出的程序进行扩增循环。

4. 第二轮 PCR

1. 使用表4中列出的试剂，在0.2 mL PCR管中配制第二轮PCR反应体系。
2. 向第二轮PCR反应体系中加入2 µL第一轮PCR产物。此外，以ddH₂O作为第二轮PCR的阴性对照。
3. 采用与步骤3.4相同的程序进行PCR扩增循环。

5. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物

1. 通过将1.5 g琼脂糖加入100 mL Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中，并在微波炉中加热使其充分溶解，制备1.5%的琼脂糖凝胶。
2. 加入溴化乙锭（EB）（终浓度为0.01%）或其它商业化的EB替代染料。将凝胶倒入模具中，在室温下静置至少30分钟使其完全凝固。
3. 将5 µL每种PCR产物与1 µL 6x上样缓冲液混合，制备上样样品。
4. 将样品和合适的DNA marker分别加入加样孔中，在120 V电压下电泳约30–45分钟，直至染料前沿迁移至凝胶长度的约75%–80%处。
5. 关闭电源，将电极从电源上断开，然后小心地从电泳槽中取出凝胶。
6. 使用紫外凝胶成像系统观察并拍摄DNA片段。

6. 套式RT-PCR的表征

1. 6.1. 特异性与灵敏度 检测 18 种丽沙病毒质粒
   1. 订购18种用于PCR的商用质粒，每种质粒包含每种丽沙病毒（16种ICTV物种和2种新物种）的完整N基因。
   2. 使用阿伏伽德罗常数（N）计算质粒的拷贝数_A）以及以下公式。
      [(质粒DNA含量，单位为 g/µL)/(质粒长度，单位为 bp × 660)] × 6.022 × 10²³ = 分子数/µL
   3. 配制储备溶液（2.24 × 10⁹ 分子/µL）所有18种质粒的ddH₂O.
   4. 对全部18种质粒进行九次10倍梯度稀释，使用ddH₂O作为稀释液₂O. 将每种质粒储存液各取10 µL，用90 µL ddH₂O稀释。₂O. 涡旋并短暂离心。
   5. 按照第3-5节所述进行PCR扩增。
   6. 通过检测一系列丽沙病毒质粒，分析巢式PCR的特异性和敏感性。
2. d的测定检测 l模仿
   1. 调整狂犬病病毒CVS-11株细胞培养物的滴度至10^5.5 TCID₅₀/mL（病毒滴度根据OIE手册确定）⁵.
   2. 对CVS-11进行五次10倍梯度稀释（原液浓度为10^5.5 TCID₅₀/mL），具体操作见步骤 6.1.4。
   3. 按照第1至第5节所述，对所有病毒稀释液进行RNA提取和巢式RT-PCR扩增操作。
3. 比较比较 的 巢式RT-PCR 与 "“金标准”FAT
   1. 采用巢式 RT-PCR 检测所有临床样本，随后用 FAT 确认结果⁵ 以及 N 基因测序⁹.
   2. 使用SAS 9.1对标准化数据进行统计分析。采用Kappa检验和McNemar卡方检验对诊断试验进行统计学比较（SAS命令：proc freq；table/agree）。在假定为二项分布的情况下计算置信区间。
4. 降解样本检测效能的评估
   1. 将两份经确认的狂犬病犬临床脑组织样本置于37 °C下孵育。
   2. 在37 °C暴露的每一天，通过巢式RT-PCR、FAT和MIT检测两个样本⁵.

结果

用于检测18种丽沙病毒的巢式RT-PCR结果如图1所示。所有PCR阳性对照在第一轮扩增中均出现预期的845 bp条带，在第二轮扩增中出现371 bp条带，阴性对照无条带。全部18种丽沙病毒均产生预期的845 bp和/或371 bp条带，表明该巢式RT-PCR方法可检测所有18种丽沙病毒。其中16种丽沙病毒质粒在两轮PCR中均实现有效扩增，但ARAV和IKOV两种病毒仅在第一轮或第二轮PCR中发生扩增。该方法对不同丽沙病毒质粒的检测灵敏度存在差异，检测限范围为2.24 × 10⁰ 至2.24 × 10⁵ 分子/µL，如表6所示。这些差异可归因于病毒序列多样性导致的引物与模板之间的不完全匹配。此外，该方法对细胞培养中狂犬病病毒CVS-11的检测灵敏度为10^2.5 TCID₅₀/mL。

采用巢式RT-PCR对共计9,624份临床脑组织样本进行检测，并与荧光抗体试验（FAT）结果进行比较，结果总结于

讨论

目前，RABV 是导致中国及其他国家几乎所有人类和动物狂犬病的主要丽沙病毒。此外，2012年在中国东北吉林省的一只Murina leucogaster蝙蝠中首次鉴定出一种 IRKV 变种¹⁰，并有报道称该病毒于2017年导致中国辽宁省一只狗死亡¹¹。最近，2017年在中国台湾的日本伏翼蝙蝠中也鉴定出一种新型丽沙病毒 TWBLV。这些结果表明，有效检测其他丽沙病毒对于预防蝙蝠传播的丽沙病毒外溢同样具有重要意义。在这方面，针对最保守的 N 基因区域设计的泛丽沙病毒巢式 RT-PCR 是一种非常有用的工具，研究结果表明，该方法能够有效检测迄今为止已发现的全部16种国际病毒分类委员会（ICTV）批准的丽沙病毒以及两种新发现的丽沙病毒物种，包括中国境内遗传差异较大的 RABV 和 IRKV（关于 IRKV 毒株的数据未展示）。然而，值得注意的是，ARAV 仅能被第二轮 PCR 引物检测到，而 IKOV 仅能被第一轮 PCR 引物检测到（图1）。为探究这一差异的原因，对全部18...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 × TAE	多种	多种
6 × 上样缓冲液	TakaRa	9156
琼脂糖	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	多种	多种
DL 2,000 Marker	Takara	3427A
dNTPs (10 mM)	TakaRa	4019
dNTPs (2.5 mM)	TakaRa	4030
电泳系统	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/μL)	TakaRa	RR001
凝胶成像系统	UVITEC	Fire Reader
微量离心管	多种	多种
M-MLV 逆转录酶 (200 IU/µL)	TakaRa	2641A
NanoDrop 1000 分光光度计	Thermoscientific	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
PCR 仪	BIO-RAD	T100
PCR 管	多种	多种
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
移液器	多种	多种
随机引物	TakaRa	3801
RNase 抑制剂 (40 IU/µL)	TakaRa	2313A
无 RNase 的 ddH2O	TakaRa	9102
Taq 缓冲液 (10×)	TakaRa	9152A
吸头	多种	多种
涡旋混合器	多种	多种