已开发出一种广谱丽沙病毒巢式逆转录聚合酶链式反应，可特异性检测所有已知的丽沙病毒。使用不同动物种类的狂犬病脑组织样本进行验证表明，该方法的灵敏度和特异性与金标准荧光抗体检测相当，可用于常规狂犬病诊断。
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方法文章
一种用于检测丽沙病毒的通用巢式逆转录聚合酶链式反应的评估
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
为了检测弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）内的狂犬病毒及其他成员物种，已开发出一种泛狂犬病毒属嵌套式反转录聚合酶链式反应（nested RT-PCR）方法，用于扩增狂犬病毒属核蛋白（N）基因的保守区域。该方法以病毒RNA为模板，使用寡聚（dT）15和随机六聚体作为引物进行反转录（RT），合成病毒互补DNA（cDNA）。随后，以病毒cDNA为模板，在第一轮PCR中利用外侧引物扩增出845 bp的N基因片段，再通过第二轮嵌套PCR利用内侧引物扩增出最终的371 bp片段。该方法可检测不同遗传谱系的狂犬病毒（RABV）。在中国为期10年的狂犬病临床诊断与监测中，使用8种家养动物共9,624份脑组织样本对该方法进行验证，结果显示，与世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）推荐的金标准方法——直接荧光抗体试验（FAT）相比，该方法的敏感性为100%，特异性为99.97%。此外，通过模拟检测所有狂犬病毒属合成N基因质粒的方法评估表明，该方法还可特异性扩增国际病毒分类委员会（ICTV）第十次报告中列出的另外15种已确认和2种新发现的狂犬病毒属物种的靶向N基因片段。该方法为狂犬病诊断提供了FAT之外的一种便捷替代方案，并已被批准为中国国家标准（GB/T36789-2018）。
引言
狂犬病是由Lyssavirus属病毒引起的一种全球性人畜共患病1。丽沙病毒（Rhabdoviridae科）为单股负链RNA病毒，基因组大小约为12 kb，编码5种蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）以及大蛋白或RNA聚合酶（L）。 根据N基因的核苷酸序列、遗传距离和抗原模式，丽沙病毒被分为16个种，包括经典狂犬病毒（RABV）和狂犬病相关病毒（RRV）：拉各斯蝙蝠病毒（LBV）、杜文黑格病毒（DUVV）、莫科拉病毒（MOKV）、欧洲蝙蝠丽沙病毒1型（EBLV-1）、欧洲蝙蝠丽沙病毒2型（EBLV-2）、澳大利亚蝙蝠丽沙病毒（ABLV）、阿拉万病毒（ARAV）、伊科马病毒（IKOV）、博克洛蝙蝠丽沙病毒（BBLV）、甘诺鲁瓦蝙蝠丽沙病毒（GBLV）、伊尔库特病毒（IRKV）、胡占德病毒（KHUV）、西高加索蝙蝠病毒（WCBV）、希莫尼蝙蝠病毒（SHIBV）和莱里达蝙蝠丽沙病毒（LLEBV）2。最近又发现了两种新的丽沙病毒：Kotalahti蝙蝠丽沙病毒（KBLV），于2017年从芬兰的布兰特氏鼠耳蝠（Myotis brandtii）中分离获得3；以及中国台湾蝙蝠丽沙病毒（TWBLV），于2016–2017年间从中国台湾的日本伏翼（Pipistrellus abramus）中....
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方案
本方案中使用小鼠的实验已获得中国军事医学科学院军事兽医研究所动物福利行政委员会（实验动物福利与使用委员会授权，许可证号 JSY-DW-2010-02）的批准。所有实验均遵循了机构和国家关于实验动物护理和使用的指导方针。
1. RNA 提取
- 使用基于异硫氰酸胍-苯酚-氯仿的提取方法或市售的病毒RNA提取试剂盒，从疑似狂犬病的脑组织、皮肤活检样本、唾液、脑脊液或RABV感染的细胞培养物中提取RNA。提取的RNA应立即使用，或于-80 °C保存备用。
2. 病毒RNA的逆转录
- 从冷冻柜中取出 表1 所列的反转录试剂，置于冰上，使用前使其充分解冻并涡旋混匀。
- 在0.2 mL PCR管中，按照 表1 所列试剂配制12 µL反转录反应体系。为避免移液误差，应配制比实际所需反应数多至少一个反应体积的预混液。
- 在模板操作间内的PCR工作站中，向反转录反应体系中加入8 µL待测样本、阳性对照RNA或阴性对照。反转录阳性对照为从感染固定毒株RABV CVS-11（challenge virus standard-11）的细胞培养物中提取的RNA，储存于-80 °C；阴性对照为无RNase的ddH2O。
- 通过涡旋充分混匀反转录反应管中....
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结果
用于检测18种丽沙病毒的巢式RT-PCR结果如图1所示。所有PCR阳性对照在第一轮扩增中均出现预期的845 bp条带，在第二轮扩增中出现371 bp条带，阴性对照无条带。全部18种丽沙病毒均产生预期的845 bp和/或371 bp条带，表明该巢式RT-PCR方法可检测所有18种丽沙病毒。其中16种丽沙病毒质粒在两轮PCR中均实现有效扩增，但ARAV和IKOV两种病毒仅在第一轮或第二轮PCR中发生扩增。该方法对不同丽沙病毒质粒的检测灵敏度存在差异，检测限范围为2.24 × 100 至2.24 × 105 分子/µL，如表6所示。这些差异可归因于病毒序列多样性导致的引物与模板之间的不完全匹配。此外，该方法对细胞培养中狂犬病病毒CVS-11的检测灵敏度为102.5 TCID50/mL。
采用巢式RT-PCR对共计9,624份临床脑组织样本进行检测，并与荧光抗体试验（FAT）结果进行比较，结果总结于
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讨论
目前，RABV 是导致中国及其他国家几乎所有人类和动物狂犬病的主要丽沙病毒。此外，2012年在中国东北吉林省的一只Murina leucogaster蝙蝠中首次鉴定出一种 IRKV 变种10，并有报道称该病毒于2017年导致中国辽宁省一只狗死亡11。最近，2017年在中国台湾的日本伏翼蝙蝠中也鉴定出一种新型丽沙病毒 TWBLV。这些结果表明，有效检测其他丽沙病毒对于预防蝙蝠传播的丽沙病毒外溢同样具有重要意义。在这方面，针对最保守的 N 基因区域设计的泛丽沙病毒巢式 RT-PCR 是一种非常有用的工具，研究结果表明，该方法能够有效检测迄今为止已发现的全部16种国际病毒分类委员会（ICTV）批准的丽沙病毒以及两种新发现的丽沙病毒物种，包括中国境内遗传差异较大的 RABV 和 IRKV（关于 IRKV 毒株的数据未展示）。然而，值得注意的是，ARAV 仅能被第二轮 PCR 引物检测到，而 IKOV 仅能被第一轮 PCR 引物检测到（图1）。为探究这一差异的原因，对全部18.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家重点研发计划（项目编号：2016YFD0500401）和国家自然科学基金（项目编号：31302043）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 × TAE | 多种 | 多种 | |
| 6 × 上样缓冲液 | TakaRa | 9156 | |
| 琼脂糖 | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | 多种 | 多种 | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| 电泳系统 | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| 凝胶成像系统 | UVITEC | Fire Reader | |
| 微量离心管 | 多种 | 多种 | |
| M-MLV 逆转录酶 (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 分光光度计 | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR 仪 | BIO-RAD | T100 | |
| PCR 管 | 多种 | 多种 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| 移液器 | 多种 | 多种 | |
| 随机引物 | TakaRa | 3801 | |
| RNase 抑制剂 (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| 无 RNase 的 ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq 缓冲液 (10×) | TakaRa | 9152A | |
| 吸头 | 多种 | 多种 | |
| 涡旋混合器 | 多种 | 多种 |
参考文献
- Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
- Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegaviral....
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重印与许可
