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方法文章

利用CRISPR/Cas9技术恢复iPSC来源的肌前体细胞中抗肌萎缩蛋白的表达

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DOI：

10.3791/59432

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2019年9月14日

 ,  ,  ,  , 
1Medical College of Georgia, Augusta University

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于Cas9的外显子23缺失方案，用于在源自Dmdmdx小鼠皮肤成纤维细胞的诱导多能干细胞（iPSC）中恢复抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的表达，并利用Tet-on MyoD激活系统将iPSC直接分化为成肌祖细胞（MPC）。

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种由抗肌萎缩蛋白基因（dystrophin gene）突变引起的严重进行性肌肉疾病，最终导致肌肉前体细胞耗竭。成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）基因编辑技术有望恢复抗肌萎缩蛋白基因的表达。自体诱导多能干细胞（iPSCs）来源的肌肉前体细胞（MPC）可补充干细胞/前体细胞库，修复损伤，并在不引发免疫反应的情况下防止DMD进一步恶化。本研究中，我们介绍了一种结合CRISPR/Cas9与非整合型iPSC技术的方法，以获得抗肌萎缩蛋白表达恢复的肌肉前体细胞。简言之，我们利用非整合型仙台病毒载体，从Dmdmdx小鼠的皮肤成纤维细胞建立iPSC细胞系。随后采用CRISPR/Cas9缺失策略，通过非同源末端连接修复移码的抗肌萎缩蛋白基因，从而恢复其表达。在94个挑选出的iPSC克隆中，我们对三个克隆进行了PCR验证，确认其外显子23缺失。随后通过多西环素（Dox）诱导MyoD（一种在调控肌肉分化中起关键作用的转录因子）的表达，将iPSC分化为MPC。我们的结果表明，利用CRISPR/Cas9缺失策略恢复iPSC来源MPC中抗肌萎缩蛋白的表达是可行的，该方法在开发未来DMD治疗策略方面具有重要意义。

引言

杜氏肌营养不良症（DMD）是最常见的肌营养不良症之一，其特征为肌营养不良蛋白缺失，在全球范围内约每5,000名新生男婴中就有1例受到影响1. 抗肌萎缩蛋白基因功能的丧失会导致肌肉结构缺陷，进而引起肌纤维进行性退化1,2重组腺相关病毒（rAAV）介导的基因治疗系统已用于恢复抗肌萎缩蛋白的表达并改善肌肉功能，例如采用微型抗肌萎缩蛋白（µ-Dys）进行基因替代治疗。然而，rAAV 方法需要重复注射以维持功能性蛋白的表达3,4因此，我们需要一种能够有效且永久恢复杜氏肌营养不良症（DMD）患者 dystrophin 基因表达的策略。 Dmdmdx 小鼠，一种DMD的小鼠模型，在外显子23中存在一个点突变 dystrophin 引入提前终止密码子的基因，导致产生缺乏C末端肌营养不良糖蛋白结合域的非功能性截短蛋白。近期研究表明，利用CRISPR/Cas9技术可通过精确基因修复或突变外显子删除，在小型和大型动物中恢复抗肌萎缩蛋白基因的表达。5,6,7. Long 等8 报道了用于校正 Dmd 基因中抗肌萎缩蛋白基因突变的方法mdx 利用基于同源定向修复（HDR）的CRISPR/Cas9基因组编辑技术对小鼠生殖系进行基因修饰。El Refaey 等9 报道称，rAAV可有效切除营养不良小鼠中突变的外显子23。在这些研究中，gRNA靶向设计于内含子20和23，以诱导双链DNA断裂，随后通过非同源末端连接（NHEJ）介导的DNA修复，部分恢复了肌营养不良蛋白的表达。更令人振奋的是，Amoasii等10 最近报道了rAAV介导的CRISPR基因编辑在犬模型中恢复抗肌萎缩蛋白表达的有效性和可行性，这是未来临床应用的关键步骤。

DMD 还会导致干细胞功能障碍11。当肌肉受损时，组织驻留的肌肉干细胞会在肌肉分化后补充死亡的肌细胞。然而，反复的损伤与修复循环会导致肌肉干细胞中的端粒缩短12，并引起干细胞库的过早耗竭13,14。因此，将自体干细胞治疗与基因组编辑相结合以恢复抗肌萎缩蛋白的表达，可能是治疗 DMD 的一种可行策略。CRISPR/Cas9 技术为生成自体基因纠正的诱导性多能干细胞（iPSC）提供了可能，从而实现功能性肌肉再生，并在不引发免疫排斥的情况下防止 DMD 的进一步并发症。然而，iPSC 存在致瘤风险，这一问题可通过将 iPSC 分化为成肌祖细胞来缓解。

在本实验方案中，我们描述了使用非整合型仙台病毒将 Dmdmdx 小鼠的皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），然后通过 CRISPR/Cas9 基因组删除恢复抗肌萎缩蛋白的表达。在通过基因分型验证 iPSC 中外显子 23 的删除后，我们通过 MyoD 诱导的成肌分化，将基因组修复的 iPSCs 分化为成肌祖细胞（MPC）。

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方案

所有动物操作和手术程序均按照奥古斯塔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。小鼠自由摄取标准饮食和水。

1. 从成年 Dmdmdx 小鼠中分离原代小鼠成纤维细胞

  1. 根据奥古斯塔大学佐治亚医学院动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案，通过 CO2 窒息法和开胸术处死成年 Dmdmdx 小鼠（雄性，2 月龄）。在超净工作台的无菌条件下，使用无菌手术刀剪下尾部。用 70% 乙醇冲洗尾部 5 分钟，然后在 6 cm 培养皿中用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。
  2. 沿尾部皮肤从基部至尾尖做一锐性切口，剥离尾部皮肤，再用镊子轻轻将皮肤撕下。使用无菌手术刀将皮肤组织剪碎至约 1 mm3 大小，并将剪碎的皮肤组织转移至含有 0.1% 胶原酶 IV 和 1 U/mL 分散酶的杜尔贝科改良必需培养基/汉姆 F12 培养基（DMEM/F12）的 6 cm 培养皿中。
  3. 将皮肤组织置于培养皿中，在 37 °C、5% CO2 培养箱中消化 2 小时。
  4. 用纤连蛋白和 0.2% 明胶（1 mL 纤连蛋白溶于 199 mL 0.2% 明胶中；材料表）包被 6 孔板，并在 37 °C 下孵育 1 小时。
  5. 用 1 mL 移液枪头将消化后的皮肤组织吹打分散，转移组织及上清液至无菌 15 mL 圆锥形离心管中。在室温下以 217 × g 离心 3 分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于 1.5 mL 成纤维细胞培养基中（材料表）。
  6. 将包含未完全消化皮肤组织的沉淀物接种于第 1.4 步中已用纤连蛋白和 0.2% 明胶包被的 6 孔板中，在 37 °C、5% CO2 培养箱中进行培养。初次接种后 24 小时更换培养基以去除未贴壁细胞，之后每 48 小时更换一次培养基。

2. 将小鼠皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞

  1. 转导前两天，用细胞脱离溶液（材料表）在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中消化步骤1.6获得的小鼠真皮成纤维细胞，持续5分钟。
  2. 使用血细胞计数板计数细胞，并在217 × g 条件下离心3分钟。
  3. 以每孔1−2 × 105个细胞的密度将细胞接种至6孔板中，加入成纤维细胞培养基（材料表），在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养。
  4. 转导当天（第0天），估算细胞数量，根据商品化说明书计算每种病毒所需的体积，以达到目标感染复数（MOI）分别为5、5和3（即KOS MOI = 5，hc-Myc MOI = 5，hKlf4 MOI = 3）。

病毒体积计算公式；病毒学研究中的感染复数（MOI）公式示意图。

  1. 将三管仙台病毒在 37 °C 水浴中解冻 5−10 秒，并将每管仙台病毒按计算体积加入 1 mL 成纤维细胞培养基中（材料表）。
  2. 移除步骤 2.3 中的成纤维细胞培养基，将重编程病毒混合液加入含细胞的孔中。将细胞置于 37 °C、5% CO2 湿润环境的培养箱中过夜培养。
  3. 转导后 24 小时更换为新鲜的成纤维细胞培养基。此后每两天更换一次培养基，继续培养细胞一周。
  4. 转导后第 7 天，用 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 收集感染的小鼠成纤维细胞，并接种至预先包被纤维连接蛋白和 0.2% 明胶的培养皿中。
  5. 将步骤 2.6 中获得的感染小鼠成纤维细胞置于含完全小鼠胚胎干细胞（ES）生长培养基（材料表）的培养皿中，在 37 °C、5% CO2 湿润环境的培养箱中培养，并每天更换培养基。
  6. 从第 8 天开始，每隔一天在倒置显微镜下观察培养皿，识别具有小鼠胚胎干细胞形态的细胞集落的出现。

3. 使用碱性磷酸酶活细胞染色与流式细胞术定量重编程效率

  1. 移除每个孔中的培养基，并用DMEM/F-12冲洗1−3分钟。
  2. 向贴壁细胞中加入2 mL 1×碱性磷酸酶（AP）活细胞染色工作液（以DMEM/F-12按1:500稀释），在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育30分钟。
  3. 吸去AP活细胞染色液，用PBS洗涤两次，每次5分钟。
  4. 使用细胞解离液（材料表）在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中消化细胞5分钟。进行流式细胞术以测定重编程效率。

4. 选择与收获类胚胎干细胞

  1. 在倒置显微镜下观察步骤 2.8 中的菌落。
  2. 使用自印式标记笔在培养皿底部标记菌落位置。
  3. 将涂有油脂的克隆环置于标记的细胞菌落上。每个克隆环中加入 100 μL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA，于 37 °C 孵育 5 分钟，然后用 100 μL 移液枪头将消化后的细胞转移至含有 mES 生长培养基的 48 孔培养板中。
  4. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 湿润环境的培养箱中，在 48 孔培养板中继续培养。当细胞融合度达到 70% 时，传代至 6 cm 培养皿中。
  5. 重复步骤 4.3 和 4.4 数次，直至获得形态均一的穹顶状克隆。

5. 冻存诱导多能干细胞以进行低温保存

  1. 在37 °C、5% CO2培养箱中，使用胰蛋白酶、versene和鸡血浆（TVP；材料表）溶液处理第4.5步选定的iPSCs，消化30分钟。
  2. 将细胞收集至无菌15 mL锥形管中，在室温下以217 × g离心3分钟。
  3. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL小鼠ES冻存液（材料表）中，每支冻存管分装1 mL。
  4. 将细胞加入冻存管中，并使用冷冻容器进行冷冻，确保以-1 °C/min的关键降温速率在-80 °C过夜冷冻，以满足冻存要求。
  5. 将冻存管转移至液氮罐中保存。

6. iPSCs中干细胞标志物的免疫荧光染色

  1. 将5.1步骤中使用mES培养基培养的iPSCs以适当密度接种于涂有聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白的8孔腔室载玻片上（材料表），每孔细胞数控制在1−2 × 104个，随后在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育48小时。
  2. 室温下将载玻片浸入4%多聚甲醛中固定15分钟，再将载玻片浸入PBS中洗涤两次，每次5分钟。
  3. 在室温下用小鼠IgG封闭试剂（材料表）和5%山羊血清孵育切片1小时。
  4. 用蛋白稀释液稀释一抗（小鼠抗SSEA1抗体，1:100；兔抗Nanog抗体，1:500；兔抗POU类5同源框1 [OCT4] 抗体，1:500；兔抗SRY-box 2 [SOX2] 抗体，1:500；兔抗Lin-28同源物A [Lin28A] 抗体，1:400）（材料表），将抗体溶液加入细胞样本，于湿化 chamber 中4 °C孵育过夜。
  5. 弃去一抗溶液，用PBS洗涤载玻片3次。
  6. 将二抗（Alexa488标记的山羊抗小鼠抗体和Alexa555标记的山羊抗兔抗体，均按1:400稀释）溶于M.O.M.蛋白稀释液后加入载玻片，室温孵育45分钟。
  7. 用PBS洗涤载玻片3次，然后使用含4’6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片。
  8. 使用共聚焦显微镜拍摄图像。

7. 体内研究诱导多能干细胞的多能性

  1. 使用TVP溶液在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中将第5.1步的iPSCs消化为单细胞，孵育30分钟。
  2. 用血细胞计数板计数细胞，并在217 × g 条件下离心3分钟。
  3. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1.5 mL无菌离心管中的mES培养基中，浓度为5 × 105 个细胞/30 μL，用于细胞移植。
  4. 使用毛发修剪器去除免疫缺陷小鼠双侧后肢的毛发。
  5. 用氯胺酮（100 mg/kg）麻醉小鼠，并用75%酒精清洁注射部位。
  6. 使用31 G针头将第7.3步制备的30 μL iPSC悬液注射至腓肠肌内。
  7. 注射后两周，取小鼠腓肠肌组织，包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，速冻后切成5-μm厚的切片15,16。
  8. 室温下用4%多聚甲醛固定切片15分钟，然后将载玻片在PBS中洗涤两次，每次5分钟。
  9. 用5%山羊血清蛋白稀释液在室温下封闭细胞1小时。
  10. 向载玻片上加入稀释的一抗（兔抗AFP抗体，1:50；兔抗SMA抗体，1:50；兔抗TH抗体，1:50），在湿盒中4 °C孵育过夜。
  11. 弃去一抗溶液，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟；加入1:400稀释的Alexa555标记的山羊抗兔抗体，室温孵育45分钟。
  12. 用PBS洗涤载玻片3次，每次5分钟，然后用含DAPI的封片剂封片。

8. 靶向 dystrophin 外显子 23 侧翼内含子的 CRISPR/Cas9 慢病毒载体的构建

  1. 通过 http://crispor.tefor.net/crispor.py 设计两对靶向内含子包围的抗肌萎缩蛋白外显子23的gRNA寡核苷酸。
    注意：设计的引物对如下：
    i22sense: 5’-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3’
    i22anti-sense: 5’-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3’
    i23sense: 5’-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT- 3’
    i23anti-sense: 5’-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3’）。
  2. 使用BsmB1/Esp3I在37 °C下对5 µg慢病毒CRISPR质粒（lenti-CRISPRv2-blast [由Mohan Babu惠赠] 和 lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [由Kristen Brennand惠赠]）（材料表）进行消化和去磷酸化处理，反应30分钟。对于5 µg质粒，加入3 µL BsmB1限制性内切酶、3 µL快速碱性磷酸酶、6 µL 10x酶切缓冲液和0.6 µL 100 mM DTT，总体积为60 µL。
  3. 将反应产物上样至0.8%琼脂糖凝胶中，在100−150 V电压下电泳30分钟。
  4. 使用凝胶回收试剂盒（材料表）从凝胶中纯化消化后的质粒，并用20 µL H2O洗脱。
  5. 对每对gRNA寡核苷酸进行磷酸化和退火处理：每对包含1 µL 100 µM的寡核苷酸、1 µL 10x T4连接酶缓冲液、0.5 µL T4多核苷酸激酶（PNK）和6.5 µL ddH2O，在37 °C孵育30分钟，随后95 °C加热5分钟，再以5 °C/min速率降温至25 °C。
  6. 将退火后的gRNA寡核苷酸稀释200倍后连接至plentiCRISPR V2-Blast或plentiGuide-Hygro-iRFP670载体中。在11 µL反应体系中混合50 ng经BsmB1/Esp3I消化的载体、1 µL稀释后的寡核苷酸双链以及5 µL 2x连接酶缓冲液和1 µL连接酶，在室温下孵育10分钟。
  7. 按照生产商说明书，将3 µL连接产物转化至50 µL感受态细胞（材料表）中。
  8. 将转化后的感受态细胞涂布于含100 µg/mL羧苄青霉素的琼脂平板上，在31.5 °C培养18小时。
  9. 用10 µL无菌枪头挑取单克隆，在含100 µg/mL羧苄青霉素的5 mL优质肉汤培养基（材料表）中，于31.5 °C、185 rpm摇床培养箱中培养21小时。
  10. 使用质粒小提和中提试剂盒（材料表）纯化质粒DNA。
  11. 通过限制性酶切验证小提质粒。在20 µL反应体系中加入1 µg质粒DNA、2 µL酶切反应缓冲液（材料表）和1 µL限制性内切酶混合液（plentiCRISPR V2-Blast-i22使用0.5 µL KpnI-HF和0.5 µL AgeI-HF；plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23使用0.5 µL NotI-HF和0.5 µL EcoRI-HF），在37 °C孵育1小时。
  12. 将反应产物上样至0.8%琼脂糖凝胶中，在100−150 V电压下电泳30分钟。
    注意：plentiCRISPR V2-Blast-i22的正确条带应为622 bp和12.2 kb，plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23的正确条带应为2.6 kb和7.1 kb。

9. 慢病毒载体包装

  1. 在6 cm培养皿中，将7 × 105个293FT细胞接种于5 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。
  2. 配制转染混合液（在100 µL低血清MEM培养基中加入1 µg plentiCRISPR V2-Blast-i22或plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23质粒、750 ng psPAX2包装质粒、250 ng pMD2.G包膜质粒，以及5 µL转染试剂A [材料表]）。
  3. 在100 µL低血清MEM培养基中加入5 µL转染试剂B（材料表），配制混合液。
  4. 将100 µL转染试剂B混合液加入步骤9.2中的质粒混合液中，室温孵育5分钟。
  5. 将步骤9.4中形成的DNA-脂质复合物逐滴加入293FT细胞中，于37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。
  6. 次日向每块培养皿中加入病毒生产增强剂（500倍浓缩液）（材料表），于37 °C、5% CO2条件下继续孵育24小时。
  7. 在接下来的两天中，使用移液器收集细胞培养上清液，并通过0.45 µm滤膜过滤，以去除细胞。

10. 慢病毒载体的浓缩与纯化

  1. 在4 °C条件下，用5倍体积的聚乙二醇4000（PEG4000，终浓度为8.5%）和4 M NaCl（终浓度为0.4 M）将第9.7步培养基中的慢病毒载体沉淀过夜。
  2. 将含有PEG4000溶液的病毒培养基在2,095 × g、4 °C条件下离心30分钟，弃去上清液。
  3. 用500 µL低血清MEM培养基重悬沉淀（慢病毒滴度：lenti-CRISPR V2-gRNAi22：1.56 × 108，lenti-iRFP670-gRNAi23：1.3 × 108，lenti-CRISPR V2-control：3.13 × 107，lenti-iRFP670-control：5.9 × 107）。保存于-80 °C，待用。

11. 利用两种向导RNA（gRNA）与Cas9联用在小鼠iPSCs中删除第23外显子

  1. 将步骤 4.5 中的小鼠诱导多能干细胞（iPSCs）接种于经纤连蛋白和明胶包被的 24 孔板中。
  2. 待细胞达到 50% 汇合度后，更换为新鲜培养基（完全小鼠胚胎干细胞生长培养基），其中含有 8 µg/mL 多聚素（polybrene）。
  3. 向小鼠 iPSCs 中加入 100 µL 来自步骤 10.3 的慢病毒颗粒溶液，包括 lenti-CRISPR V2-gRNAi22、lenti-iRFP670-gRNAi23 以及对照（空载体：lenti-CRISPR V2、lenti-iRFP670）。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育细胞 3 天。
  4. 使用含有 2.5 µg/mL 杀稻瘟菌素（blasticidin）和 100 µg/mL 潮霉素 B 的培养基筛选稳定感染的细胞，筛选浓度依据杀死未感染细胞所需的最低杀稻瘟菌素和潮霉素 B 浓度确定。
    注意：未感染的细胞会被杀稻瘟菌素和潮霉素 B 杀死。
  5. 每孔（24 孔板）加入 0.5 mL TVP 溶液消化筛选后的小鼠 iPSCs，并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。
  6. 通过移液将 iPSCs 解离为单细胞，使用细胞计数板计数细胞，然后将约 150 个消化后的单细胞用 mES 培养基稀释后接种至 10 cm 培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养。
  7. 约 10 天后，在倒置显微镜下使用 10 µL 无菌移液器吸头挑取单克隆（需挑取 96 个克隆）。
  8. 将挑取的克隆转移至 96 孔板中，每孔加入 50 µL TVP 溶液（每孔一个克隆），在 37 °C 下消化 30 分钟，然后将消化后的细胞接种至两个 96 孔培养板中继续培养（其中一个用于基因型鉴定）。
  9. 在 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育，直至细胞汇合度达到 70%。

12. 鉴定外显子23缺失的iPSC克隆

  1. 当细胞集落达到70%融合度时，移除96孔板中的培养基。
  2. 向每孔加入含有蛋白酶K溶液的裂解试剂（25 µL）（材料表）（每100 mL裂解试剂中含1 mL蛋白酶K），并将裂解液转移至96孔PCR板中。
  3. 密封PCR板，先在55 °C孵育30分钟，然后在95 °C孵育45分钟，以裂解细胞并使蛋白酶K失活。
  4. 取步骤12.3中获得的2 µL裂解液进行PCR反应。对于20 µL的PCR反应体系，加入2 µL裂解液、10 µL 2x DNA聚合酶预混液（材料表）、7 µL无DNase水和1 µL DMD外显子23引物（表1）。
  5. PCR反应程序如下：98 °C预变性1分钟，随后进行35个循环（98 °C变性10秒、60 °C退火15秒、72 °C延伸30秒），最后在72 °C延伸1分钟。
  6. 将PCR产物上样至2%琼脂糖凝胶，在100−150 V电压下电泳30分钟。
  7. 在紫外光下观察凝胶结果（敲除效率为3/94）。

13. 使用 Tet-on MyoD 激活系统将诱导多能干细胞直接分化为成肌祖细胞（MPC）

  1. 按照第9和第10节中针对lenti-CRISPRv2-blast和lenti-gRNA-iRFP670载体所述的方法，包装LV-TRE-VP64-小鼠MyoD-T2A-dsRedExpress2和LV-TRE-VP16小鼠MyoD-T2A-dsRedExpress2（由Charles Gersbach惠赠）（材料表）。
  2. 按照步骤11.1−11.3中针对lenti-CRISPRv2-blast和lenti-gRNA-iRFP670载体所述的方法，用慢病毒-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2或慢病毒-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2感染小鼠iPSC。
  3. 感染三天后，使用1 μg/mL嘌呤霉素筛选细胞，以获得纯化的转导细胞群体。
  4. 向培养基（含10% FBS的DMEM）中添加3 μg/mL多西环素以诱导MPC分化。每两天更换一次含多西环素的新鲜培养基。

14. 定量逆转录 PCR 用于评估动态肌肉分化及 DMD 外显子 22-24 的表达

  1. 使用RNA提取试剂，在多西环素处理后的第0、3、6和10天提取细胞RNA，并利用第一链cDNA合成试剂盒（材料表）将RNA逆转录为cDNA。
  2. 对于20 µL的qPCR反应体系，加入1 µL cDNA、10 µL PCR反应缓冲液（材料表）、8 µL DNA H2O，以及1 µL的上下游引物混合物（甘油醛-3-磷酸脱氢酶[GAPDH]、骨骼肌肌动蛋白[ACTA1]、OCT4以及DMD外显子22、DMD外显子23和DMD外显子24，见表1）。
  3. PCR反应使用以下参数：50 °C 2分钟，95 °C 2分钟，40个循环（95 °C 15秒，60 °C 1分钟），熔解曲线分析从65.0 °C升至95.0 °C，增量为0.5 °C。

15. 肌球蛋白重链2（MYH2）和肌营养不良蛋白表达的免疫荧光染色

  1. 将步骤13.4中经强力霉素诱导并用lenti-TRE-MyoD修饰的细胞接种至8孔培养载玻片上。
  2. 在室温下用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，然后用PBS洗涤载玻片两次，每次5分钟。
  3. 用5%山羊血清蛋白稀释液在室温下封闭细胞1小时。
  4. 向载玻片上加入兔抗dystrophin抗体（1:300）和鼠抗MYH2抗体（1:100），于4 °C湿盒中孵育过夜。
  5. 弃去一抗溶液，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟；然后向载玻片加入1:400稀释的Alexa488标记的山羊抗兔抗体和Alexa555标记的山羊抗鼠抗体，室温孵育45分钟。
  6. 用PBS洗涤载玻片3次，每次5分钟，最后用含DAPI的封片剂封片。

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结果

Dmdmdx 皮肤成纤维细胞来源的诱导多能干细胞的建立。 我们展示了利用无整合重编程载体从小鼠 Dmdmdx 模型来源的皮肤成纤维细胞高效生成诱导多能干细胞（iPSC）的方法。图1A 显示，感染后三周出现类似胚胎干细胞（ESC）的克隆集落。我们通过活细胞碱性磷酸酶（AP）染色评估iPSC诱导效率；图1B 显示，流式细胞术（FACS）分析表明AP阳性细胞比例约为1.8%。免疫荧光染色结果显示，iPSC克隆表达小鼠胚胎干细胞的多能性标志物SSEA1、Lin28、Nanog、OCT4和SOX2（图1C）。为研究iPSC在体内的三胚层分化能力，我们将iPSC直接注射至小鼠腓肠肌中。观察发现，注射的iPSC分化为肝细胞（内胚层）、平滑肌细胞（中胚层）和肾上腺素能神经元细胞（外胚层）（图1D），表明其具有多能性。

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讨论

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种破坏性且最终致命的遗传性疾病，其特征是缺乏抗肌萎缩蛋白，导致进行性肌肉萎缩1，2。我们的结果表明，通过CRISPR/Cas9介导的外显子23删除方法，可在Dmdmdx诱导多能干细胞来源的成肌祖细胞中恢复抗肌萎缩蛋白基因的表达。该方法具有三个优势。

首先，我们利用非整合型RNA载体，从小鼠Dmdmdx模型来源的皮肤成纤维细胞中生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。目前已有多种方法可用于生成iPSCs，例如使用慢病毒和逆转录病毒载体，这些载体可整合到宿主染色体中以表达重编程基因，因而存在一定的安全性问题。基于DNA的载体，如质粒载体、腺相关病毒和腺病毒，虽以非整合形式存在，但仍可能以较低频率整合入宿主染色体。在本研究中，我们采用了一种经过修饰的、无传染性的仙台病毒——一种非整合型RNA载体，以安全高效地将干细胞转录因子递送至成纤维细胞，实现重编程。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

唐和温特劳布部分得到了 NIH-AR070029、NIH-HL086555、NIH-HL134354 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
手术器械
31号针头Various 
锐性切开工具Various 
无菌手术刀Various 
镊子Various 
成纤维细胞培养基（配制100 mL完全培养基）公司货号体积
2-巯基乙醇（55 mM）Gibco21-985-0230.1 mL
抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩）CORNINGMT30004CI1 mL
DMEM高糖培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose）SIGMAD642987 mL
经鉴定的胎牛血清HyCloneSH30396.0310 mL
L-谷氨酰胺溶液SIGMAG75131 mL
MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩） Gibco111400761 mL
TVP溶液（配制500 mL完全溶液）公司货号体积
鸡血清Gibco16110-0825 mL
EDTASigma-AldrichE6758186 mg
磷酸盐缓冲液加至500 mL
胰蛋白酶（2.5%）Thermo150900465 mL
mES细胞生长培养基（配制500 mL完全溶液）公司货号体积
2-巯基乙醇（55 mM）Gibco21-985-0230.5 mL
抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩）CORNINGMT30004CI5 mL
DMEM高糖培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose）SIGMAD6429408.5 mL
经鉴定的胎牛血清HyCloneSH30396.0375 mL
L-谷氨酰胺溶液SIGMAG75135 mL
小鼠重组白血病抑制因子（LIF），0.5 × 10⁶ U/mLEMD Millipore CorpCS210511500 μL
MEK/GSK3抑制剂补充剂EMD Millipore CorpCS210510-500UL500 μL
MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩） Gibco111400765 mL
ES细胞培养基储存时间不应超过4周，含抑制剂的培养基不应超过2周。
mES细胞冻存培养基（配制50 mL完全溶液）公司货号体积
二甲基亚砜（DMSO）SIGMAD26505 mL
DMEM高糖培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose）SIGMAD642924.9 mL
经鉴定的胎牛血清HyCloneSH30396.0325 mL
小鼠重组白血病抑制因子（LIF），0.5 × 10⁶ U/mLEMD Millipore CorpCS21051150 μL
材料/设备名称公司货号RRID
0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTACORNING25-052-CI
4%多聚甲醛Thermo scientificJ19943-k2
Accutase溶液SIGMAA6964细胞解离溶液
AgeI-HFNEBR3552L
Alexa488标记的山羊抗小鼠抗体InvitrogenA32723AB_2633275
Alexa488标记的山羊抗兔抗体InvitrogenA32731AB_2633280
Alexa555标记的山羊抗兔抗体InvitrogenA32732AB_2633281
抗AFP抗体Thermo scientificRB-365-A1AB_59574
抗-α-平滑肌肌动蛋白（D4K9N）XP抗体CST19245SAB_2734735
抗肌营养不良蛋白抗体ThermoPA5-32388AB_2549858
抗LIN28A（D1A1A）XP抗体   CST8641SAB_10997528
抗MYH2抗体DSHBmAb2F7AB_1157865
抗Nanog-XP抗体CST8822SAB_11217637
抗Oct-4A（D6C8T）抗体CST83932SAB_2721046
抗Sox2抗体abcamab97959AB_2341193
抗SSEA1（MC480）抗体 CST4744sAB_1264258
抗TH（H-196）抗体SANTA CRUZ sc-14007AB_671397
碱性磷酸酶活细胞染色试剂（500倍浓缩）ThermoA14353
杀稻瘟菌素S（Blasticidin S）Sigma-Aldrich203350
BsmBI/Esp3INEBR0580L/R0734L
羧苄青霉素Millipore205805-250MG
IV型胶原酶 Worthington Biochemical CorporationLS004189
感受态细胞TakaRa636763
CutSmart NEBB7204S
CytoTune-iPS 2.0仙台病毒重编程试剂盒ThermoA16517
DirectPCR裂解试剂（细胞用）VIAGEN BIOTECH302-C
分散酶（1 U/mL）STEMCELL Technologies7923
盐酸多西环素Fisher BioReagentsBP26535
EcoRI-HFNEBR3101L
牛血浆纤维连接蛋白SIGMAF1141
 
QIAEX II凝胶回收试剂盒（500）		QIAGEN20051
猪皮来源A型明胶SIGMAG1890
含DAPI的HardSet抗荧光淬灭封片剂VectorH-1500
潮霉素B（50 mg/mL）Invitrogen10687010
盐酸氯胺酮注射液HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH45822
KpnI-HFNEBR3142L
lenti-CRISPRv2-blastAddgene83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670Addgene99377
Lipofectamin 3000转染试剂盒InvitrogenL3000015
LV-TRE-VP64-小鼠MyoD-T2A-dsRedExpress2  Addgene60625
LV-TRE-VP16小鼠MyoD-T2A-dsRedExpress2Addgene60626
小鼠抗小鼠（M.O.M.）基础试剂盒VectorBMK-2202
NotI-HFNEBR3189L
Opti-MEM I减血清培养基ThermoFisher31985070
聚乙二醇4,000Alfa AesarAAA161510B
聚凝胺（Polybrene）SIGMATR1003
Corning BioCoat多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白培养载玻片CORNINGCB354688
PowerUp SYBR Green Master MixThermoFisherA25742
PrimeSTAR Max PremixTakaRaR045
蛋白酶KVIAGEN BIOTECH507-PKP
盐酸嘌呤霉素MP BiomedicalsICN19453980
qPCR慢病毒滴度测定试剂盒abmLV900
快速连接试剂盒NEBM2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit（250）QIAGEN27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit（100）QIAGEN12945
RevertAid RT反转录试剂盒Thermo scientificK1691
RNAzol RTMolecular Research Center, INCRN 190
T4 DNA连接酶反应缓冲液NEBB0202S
T4多核苷酸激酶NEBM0201S
改良优质肉汤（Terrific Broth Modified）Fisher BioReagentsBP9729-600
ViralBoost试剂（500倍浓缩）ALSTEMVB100

参考文献

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
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  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
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  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
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CRISPR Cas9 23 MyoD PCR
利用CRISPR/Cas9技术恢复iPSC来源的肌前体细胞中抗肌萎缩蛋白的表达
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