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方法文章

模式触发的氧化爆发与幼苗生长抑制实验 拟南芥

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DOI：

10.3791/59437

⸱

2019年5月21日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Queen's University

本文内容

摘要

本文介绍了两种在免疫诱导物处理后定量分析拟南芥（Arabidopsis thaliana）防御反应的方法：瞬时氧化爆发和幼苗生长抑制。

摘要

植物已进化出强大的免疫系统，以识别病原体并抵御疾病。本文介绍了两种可用于检测激发子分子处理后拟南芥（Arabidopsis thaliana）免疫激活强度的实验方法。首先介绍的是捕捉快速诱导且动态的氧化爆发的方法，该过程可通过基于鲁米诺的检测进行监测。其次介绍的是测量免疫反应引起幼苗生长抑制的方法。这些实验方案快速可靠，无需特殊培训或设备，被广泛用于研究植物免疫的遗传基础。

引言

为感知并抵御病原体，植物进化出了膜结合的模式识别受体（PRRs），可识别存在于细胞外的保守微生物分子，即微生物相关分子模式（MAMPs）。1MAMPs 与其对应的 PRRs 结合后，会启动由蛋白激酶介导的免疫信号转导，从而产生广谱抗病性2PRR激活后最早期的响应之一是质膜整合型呼吸爆发氧化酶同源物（RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG, RBOH）蛋白的磷酸化与活化，这些蛋白催化细胞外活性氧（ROS）的产生。3,4活性氧（ROS）在建立疾病抗性中发挥重要作用，既可作为传播免疫信号的第二信使，也可作为直接的抗菌剂。5首次观察到免疫诱导的氧化爆发是利用‘Rishiri’品种的马铃薯块茎进行的 Phytophthora infestans 接种6已利用叶圆片在多种植物物种中评估了活性氧的产生7细胞悬浮培养8和原生质体6. 本文介绍了一种检测叶片圆片中模式触发的活性氧（ROS）产生的简单方法 拟南芥 (拟南芥).

在感知MAMP后，活化的RBOH蛋白会催化产生超氧阴离子自由基（O2-）、羟自由基（•OH）和单线态氧（1O2），这些物质在胞外空间转化为过氧化氢（H2O2）9。在辣根过氧化物酶（HRP）作为氧化剂存在的情况下，可通过基于鲁米诺的化学发光法对H2O2进行定量10。HRP氧化H2O2生成氢氧根离子（OH−）和氧气（O2），后者与鲁米诺反应生成不稳定的中间产物，进而释放出光子10。光子的发射可通过能够检测发光信号的酶标仪或成像仪以相对光单位（RLUs）进行定量，这类仪器已成为大多数分子生物学实验室的标准设备 。通过测量40至60分钟时间内的发光信号，可在诱导剂处理后2至5分钟内检测到短暂的氧化爆发，信号在10至20分钟达到峰值，并在约60分钟后恢复至基础水平11。该时间过程中累积的发光量可作为免疫反应强度的指标，反映RBOH蛋白的激活程度12。该检测方法无需特殊设备或繁琐的样品前处理，操作简便。

在MAMP被识别后不久即达到高峰，氧化爆发与MAPK激活和乙烯产生一同被视为早期免疫反应5后续免疫反应包括转录重编程、气孔关闭和胼胝质沉积2,5长时间暴露于MAMPs会持续激活耗能的免疫信号通路，导致植物生长受到抑制，表明发育与免疫之间存在权衡。13模式触发的幼苗生长抑制（SGI）被广泛用于评估植物免疫反应的输出水平 拟南芥 并在识别免疫信号通路中的多个关键组分（包括PRRs）方面发挥了重要作用14,15,16因此，本文还提供了一种检测方法 模式触发的 SGI 拟南芥幼苗在含有标准培养基或添加免疫诱导剂的培养基的多孔板中培养8-12天，随后使用分析天平称重。

为了展示如何利用ROS和SGI检测方法监测PRR介导的信号通路，本研究选择了三种代表不同免疫反应水平的基因型：（1）野生型Arabidopsis 品系Columbia（Col-0）；（2）显性负性bak1-5突变体，其多功能PRR共受体BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1)在免疫信号传导中失去功能17,18；以及（3）隐性cpk28-1突变体，该突变体缺失调控蛋白CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28（CPK28），表现出增强的免疫触发反应19,20。 ROS和SGI检测是针对人工合成的细菌延伸因子Tu（EF-Tu）肽表位elf18所引发的反应而展示的，该表位在Arabidopsis中由PRR EF-Tu RECEPTOR（EFR）识别15。这些实验方案也可用于其他免疫诱导子，例如细菌运动蛋白鞭毛素14或内源性植物诱导蛋白（AtPeps）16，但需注意植物对不同诱导子的响应能力存在差异21。综上，ROS和SGI检测可用于对PRR介导的早期和晚期响应进行快速且定量的评估 。

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方案

1. 检测ROS爆发 拟南芥 免疫诱导后的叶片圆片

  1. 植物生长与养护
    1. 为同步萌发，进行层积处理 拟南芥 将约50粒种子悬浮于1 mL无菌0.1%琼脂溶液（w/v）中，混匀后储存于 4 °C （无光照）3-4 天。
      注意：对野生型背景对照（例如，Col-0）以及免疫响应高和低的基因型（例如， cpk28-1 和 bak1-5 分别作为内参对照。
    2. 将种子播种于土壤中，并在标准短日照条件下萌发（22 °C，10 小时光照， 150 μE/m2/光照强度，65-70%相对湿度）。
    3. 大约7天后，使用镊子将单株幼苗移栽至新花盆中，每株间隔至少4厘米，以保证莲座叶充分发育。每种基因型移栽6–12株幼苗，并恢复至标准短日照条件下培养。定期浇水并施肥（每两周施用一次浓度为1 g/L的20-20-20肥料）。
  2. 在96孔板中收集叶盘，用于过夜恢复。
    1. 萌发后4-5周图1A），使用锋利的4 mm活检打孔器从每株植物上取下一个叶圆片，避开主脉，并注意尽量减少损伤（图1B）。将叶圆片放入未使用过的含96孔化学发光检测仪板中 100 μL 去离子水2O，近轴面朝上放置，以防止干燥22 (图1C）。若需评估多种激发子，应从同一叶片上为每种激发子处理各取一个叶盘。
      注意：选择完全展开、位于莲座顶端第三至第五位、大小和年龄相近的叶片作为样品，以减少变异性。如有可能，在过夜恢复前使用剃刀刀片将叶片圆片切成两半，以增加其暴露于诱导剂溶液的表面积。23.
    2. 在室温下过夜恢复，以避免叶片圆片采集过程中因机械损伤产生的活性氧干扰。用盖子盖好培养板，防止蒸发。
  3. 进行激发子处理并检测ROS的产生。
    1. 在加入反应溶液前预先设置好酶标仪，以减少活性氧爆发启动与首次记录测量值之间的时间。使用与酶标仪匹配的商用软件。在本实验中（见 目录），点击 设置，并选择 LUM96 盒式磁带和 动力学 读取类型。点击 读取区域 类别中拖动以选择要读取的部分孔或整块板。在下方 光电倍增管与光学系统 标签页中，将积分时间设置为 1,000 ms。在 时间安排 标签，设置 总运行时间 40-60 分钟 间隔 至 2 分钟。
    2. 使用多通道移液器从每个孔中移除水。
      注意：不要刺穿叶圆片，因为这可能会造成损伤应激，导致活性氧（ROS）的产生更加不稳定。
    3. 配制含有以下成分的反应溶液 100 μM 鲁米诺, 10 μg/mL HRP，以及所需浓度的诱导子（例如：elf18，浓度分别为 1 nM、10 nM、100 nM 或 1,000 nM），溶于无菌 ddH₂O 中2使用10 mL溶液用于一块96孔板。
      注意：将冻干肽溶解于无菌 H2在低吸附离心管中配制成10 mM母液，液氮速冻2，并于 -80 °C使用前，将储备液用无菌 H2O 以生成一个 100 μM 工作液，于 -20 °C.
    4. 使用多通道移液器进行分液 100 μL 将反应混合物分别加入每个孔中，同时将溶液加入到同一种处理的所有叶圆片中22为每种基因型设置对照反应（不加激发子），以评估无激发条件下的基础ROS水平。使用酶标仪立即检测可见光谱范围内所有波长的发光信号。
      注意：由于鲁米诺（luminol）和辣根过氧化物酶（HRP）为光敏试剂，反应溶液的配制和使用应在弱光条件下进行。试剂应置于冰上或-20°C 除非正在使用，否则应存放好。
    5. 使用酶标仪，在40至60分钟内，每隔2分钟以1,000毫秒的积分时间测量光信号，以捕获动态的氧化爆发图1D).
      注意：使用较长的积分时间以提高检测灵敏度11同时确保96孔板中的所有样本均能在同一时间段内完成检测。
  4. 数据分析与解释。
    1. 对于每种基因型，使用电子表格应用程序计算每个时间点的平均光子数和标准误，并通过散点图将活性氧生成量表示为时间的函数。
      平均光子数计算公式、计算方法、光合作用研究分析方程
      其中，t = 每个时间点
    2. 或者，对每个叶圆片的光子计数求和，并使用带有标准误差线的柱状图或箱线图，展示每种基因型的平均值。
      累积光子计数方程 Σ（叶圆片光子计数），光子测量分析

2. 幼苗生长抑制实验

  1. 对种子进行灭菌处理，并播种于MS培养基平板上。
    1. 配制含有0.8%琼脂（w/v）的无菌半倍浓度（0.5x）MS培养基（2.16 g/L）。在超净工作台中将培养基倒入培养皿（90 × 15 mm）中。
    2. 取约100粒种子置于微量离心管中，加入1 mL 70%乙醇振荡洗涤2分钟，随后吸弃乙醇；再加入1 mL 40%次氯酸钠溶液，室温下轻柔摇动17分钟。吸除次氯酸钠溶液后，用1 mL无菌水洗涤三次，每次5分钟。最后将种子重悬于1 mL无菌0.1%琼脂溶液中。
      注：也可采用氯气气体法对种子进行灭菌处理24。
    3. 在超净工作台中，使用移液器将每种基因型约100粒种子播种于MS琼脂平板上，并用微孔胶带密封。
      注：避免种子之间距离过近，以免后续幼苗移栽困难。
    4. 将平板置于4 °C（避光）条件下进行春化处理3–4天，以同步萌发（图2A）。
  2. 将幼苗移栽至含有免疫诱导肽的48孔板中。
    1. 春化处理结束后，将平板转移至短日照光照条件下（22 °C，光照10小时，光照强度150 μE/m2/s，相对湿度65–70%），培养3–4天，以促进种子萌发。
    2. 在超净工作台中，使用含1%蔗糖（w/v）的无菌0.5x MS液体培养基配制诱导肽梯度稀释液（0 nM、1 nM、10 nM、100 nM 和 1,000 nM），每块48孔板准备25 mL MS培养基。用移液器向每个孔中加入500 µL MS液体培养基或含肽的MS培养基。如有条件，可使用多通道重复移液器以加快操作速度。
      注：每种基因型均需设置不含诱导肽的MS培养基对照组，以排除幼苗生长固有差异的影响。
    3. 使用无菌镊子小心地将大小和生长时期一致的单株幼苗移栽至各孔中，确保幼苗无损伤、根部未断裂，且根完全浸没于培养基中。每种基因型在每种肽浓度下至少移栽6–8株幼苗（图2B）。
      注：建议在萌发后第4天进行移栽，此时根较短，易于操作；过老的幼苗可能导致实验结果不理想。
    4. 用微孔胶带密封培养板，重新放回标准短日照光照条件下（22 °C，光照10小时，光照强度150 μE/m2/s，相对湿度65–70%），继续培养8–12天。
  3. 测定生长抑制率。
    1. 小心从48孔板中取出幼苗，用纸巾轻轻吸干表面水分。使用分析天平称量幼苗鲜重并记录数据。如有条件，可使用配备USB输出功能的分析天平，直接将鲜重数据导入电子表格。在称重前拍摄照片，以直观展示生长抑制情况（图2C）。
    2. 根据以下公式计算诱导肽处理组幼苗相对于仅在MS培养基中生长的对照组幼苗的生长抑制率（图2D）：
      生长抑制率计算公式，处理组与对照组幼苗重量比值，方程。
    3. 使用带有标准误差线的柱状图或箱形图（箱线图）绘制数据，以更清晰地展示实验间变异情况。

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结果

使用突变体 cpk28-119,25 和 bak1-517,18 植株分别展示在氧化爆发和SGI检测中相对于野生型背景对照（Col-0）具有高免疫应答和低免疫应答的预期结果。为评估剂量依赖性效应，采用10倍梯度稀释系列（1–1,000 nM）的elf18多肽进行实验。与Col-0相比，cpk28-1功能缺失株系表现出更高的累积活性氧爆发水平（图3A）和平均活性氧爆发水平（图3B），而bak1-5在10 nM至1,000 nM浓度范围内则表现出降低的活性氧生成（图3）。在100 nM和1,000...

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讨论

本文介绍了两种用于检测模式触发免疫反应的方法 拟南芥，提供无需使用专业设备即可定量评估免疫输出的方法。结合使用，模式触发的活性氧（ROS）和种子萌发抑制（SGI）可分别用于评估对微生物感知的早期和晚期响应。

氧化爆发检测的主要局限性在于其变异性。由于尚未完全明确的原因，不同实验之间的绝对相对光单位（RLUs）常相差一个数量级。由于实验间变异程度较高，建议在实验中设置内部参考对照，包括氧化爆发水平较高（例如，cpk28-1）和较低（例如，bak1-5）的材料，以及野生型对照（例如，Col-0）。然而，可采取若干措施以提高实验间的可重复性。重复实验之间的环境条件，如温度、湿度、光周期和光照强度，应保持一致。取样时还应考虑植株的生长时期和健康状况。叶盘可取自生长在短日照条件（6–10 小时光照）下、4 至 7 周龄的植株。据经验观察，萌发后超过 6 周但尚未开花或衰老的植株通常能获得最一致的结果。应将植株培养在洁净的环境培养室中，以避免暴露于温室中常见的病虫害，如白粉病或咀嚼式昆虫。由于 SGI 实验中的幼苗是在无菌...

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致谢

本实验室的研究工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现计划、加拿大创新基金会约翰·R·埃文斯领袖基金以及女王大学资助。KS 和 IS 获得了安大略省研究生奖学金和加拿大自然科学与工程研究理事会硕士研究生奖学金（CGS-M）的联合资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20-20-20肥料Plant Prod10529每升水中加入1克，每两周施用一次，以实现最佳生长。
4 mm活检打孔器Medical Mart232-33-34-P也可使用表面积为0.125 cm²的打孔器套装。
带盖48孔无菌板Sigma-AldrichCLS3548
带防风罩的分析天平VWRVWR-225AC任何标准分析天平均可用于生长抑制实验，但具备直接计算机输出功能者更佳。
BioHit mLine 机械式12通道移液器（30-300 uL）Sartorius725240可使用任何多通道移液器，必要时也可使用单通道移液器。
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)EZ Biolabcp7211将10 mM储备液肽存于-80°C的低蛋白吸附管中。解冻后，将100 uM工作液存于-20°C避光保存。
镊子Fisher Scientific22-327379
辣根过氧化物酶Sigma-AldrichP6782溶于纯水中，-20°C避光保存。
鲁米诺Sigma-AldrichA8511溶于DMSO中，-20°C避光保存。
Murashige和Skoog基础盐Cedarlane LabsMSP09-100LT4°C保存。
土壤SunGrow HorticultureSunshine Mix #1其他类型土壤也可用于拟南芥培养。装盆时与水混合使用。
配备LUM模块的SpectraMax Paradigm多功能微孔板读板仪Molecular Devices需索取报价任何具备检测发光能力的微孔板读板仪均可用于此类实验。
蔗糖Sigma-AldrichS0389-1KG室温保存。
白色聚苯乙烯96孔板Fisher Scientific07-200-589

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