模式触发的氧化爆发与幼苗生长抑制实验 拟南芥

摘要

本文介绍了两种在免疫诱导物处理后定量分析拟南芥（Arabidopsis thaliana）防御反应的方法：瞬时氧化爆发和幼苗生长抑制。

摘要

植物已进化出强大的免疫系统，以识别病原体并抵御疾病。本文介绍了两种可用于检测激发子分子处理后拟南芥（Arabidopsis thaliana）免疫激活强度的实验方法。首先介绍的是捕捉快速诱导且动态的氧化爆发的方法，该过程可通过基于鲁米诺的检测进行监测。其次介绍的是测量免疫反应引起幼苗生长抑制的方法。这些实验方案快速可靠，无需特殊培训或设备，被广泛用于研究植物免疫的遗传基础。

引言

为感知并抵御病原体，植物进化出了膜结合的模式识别受体（PRRs），可识别存在于细胞外的保守微生物分子，即微生物相关分子模式（MAMPs）。¹MAMPs 与其对应的 PRRs 结合后，会启动由蛋白激酶介导的免疫信号转导，从而产生广谱抗病性²PRR激活后最早期的响应之一是质膜整合型呼吸爆发氧化酶同源物（RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG, RBOH）蛋白的磷酸化与活化，这些蛋白催化细胞外活性氧（ROS）的产生。^3,4活性氧（ROS）在建立疾病抗性中发挥重要作用，既可作为传播免疫信号的第二信使，也可作为直接的抗菌剂。⁵首次观察到免疫诱导的氧化爆发是利用‘Rishiri’品种的马铃薯块茎进行的 Phytophthora infestans 接种⁶已利用叶圆片在多种植物物种中评估了活性氧的产生⁷细胞悬浮培养⁸和原生质体⁶. 本文介绍了一种检测叶片圆片中模式触发的活性氧（ROS）产生的简单方法 拟南芥 (拟南芥)....

方案

1. 检测ROS爆发 拟南芥 免疫诱导后的叶片圆片

1. 植物生长与养护
   1. 为同步萌发，进行层积处理 拟南芥 将约50粒种子悬浮于1 mL无菌0.1%琼脂溶液（w/v）中，混匀后储存于 4 °C （无光照）3-4 天。
      注意：对野生型背景对照（例如，Col-0）以及免疫响应高和低的基因型（例如， cpk28-1 和 bak1-5 分别作为内参对照。
   2. 将种子播种于土壤中，并在标准短日照条件下萌发（22 °C，10 小时光照， 150 μE/m²/光照强度，65-70%相对湿度）。
   3. 大约7天后，使用镊子将单株幼苗移栽至新花盆中，每株间隔至少4厘米，以保证莲座叶充分发育。每种基因型移栽6–12株幼苗，并恢复至标准短日照条件下培养。定期浇水并施肥（每两周施用一次浓度为1 g/L的20-20-20肥料）。
2. 在96孔板中收集叶盘，用于过夜恢复。
   1. 萌发后4-5周图1A），使用锋利的4 mm活检打孔器从每株植物上取下一个叶圆片，避开主脉，并注意尽量减少损伤（图1B）。将叶圆片放入未使用过的含96孔化学发光检测仪板中 100 μL 去离子水₂O，近轴面....

结果

使用突变体 cpk28-1^19,25 和 bak1-5^17,18 植株分别展示在氧化爆发和SGI检测中相对于野生型背景对照（Col-0）具有高免疫应答和低免疫应答的预期结果。为评估剂量依赖性效应，采用10倍梯度稀释系列（1–1,000 nM）的elf18多肽进行实验。与Col-0相比，cpk28-1功能缺失株系表现出更高的累积活性氧爆发水平（图3A）和平均活性氧爆发水平（图3B），而bak1-5在10 nM至1,000 nM浓度范围内则表现出降低的活性氧生成（图3）。在100 nM和1,000.......

讨论

本文介绍了两种用于检测模式触发免疫反应的方法 拟南芥，提供无需使用专业设备即可定量评估免疫输出的方法。结合使用，模式触发的活性氧（ROS）和种子萌发抑制（SGI）可分别用于评估对微生物感知的早期和晚期响应。

氧化爆发检测的主要局限性在于其变异性。由于尚未完全明确的原因，不同实验之间的绝对相对光单位（RLUs）常相差一个数量级。由于实验间变异程度较高，建议在实验中设置内部参考对照，包括氧化爆发水平较高（例如，cpk28-1）和较低（例如，bak1-5）的材料，以及野生型对照（例如，Col-0）。然而，可采取若干措施以提高实验间的可重复性。重复实验之间的环境条件，如温度、湿度、光周期和光照强度，应保持一致。取样时还应考虑植株的生长时期和健康状况。叶盘可取自生长在短日照条件（6–10 小时光照）下、4 至 7 周龄的植株。据经验观察，萌发后超过 6 周但尚未开花或衰老的植株通常能获得最一致的结果。应将植株培养在洁净的环境培养室中，以避免暴露于温室中常见的病虫害，如白粉病或咀嚼式昆虫。由于 SGI 实验中的幼苗是在无菌.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20-20-20肥料	Plant Prod	10529	每升水中加入1克，每两周施用一次，以实现最佳生长。
4 mm活检打孔器	Medical Mart	232-33-34-P	也可使用表面积为0.125 cm²的打孔器套装。
带盖48孔无菌板	Sigma-Aldrich	CLS3548
带防风罩的分析天平	VWR	VWR-225AC	任何标准分析天平均可用于生长抑制实验，但具备直接计算机输出功能者更佳。
BioHit mLine 机械式12通道移液器（30-300 uL）	Sartorius	725240	可使用任何多通道移液器，必要时也可使用单通道移液器。
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	cp7211	将10 mM储备液肽存于-80°C的低蛋白吸附管中。解冻后，将100 uM工作液存于-20°C避光保存。
镊子	Fisher Scientific	22-327379
辣根过氧化物酶	Sigma-Aldrich	P6782	溶于纯水中，-20°C避光保存。
鲁米诺	Sigma-Aldrich	A8511	溶于DMSO中，-20°C避光保存。
Murashige和Skoog基础盐	Cedarlane Labs	MSP09-100LT	4°C保存。
土壤	SunGrow Horticulture	Sunshine Mix #1	其他类型土壤也可用于拟南芥培养。装盆时与水混合使用。
配备LUM模块的SpectraMax Paradigm多功能微孔板读板仪	Molecular Devices	需索取报价	任何具备检测发光能力的微孔板读板仪均可用于此类实验。
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389-1KG	室温保存。
白色聚苯乙烯96孔板	Fisher Scientific	07-200-589