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用于寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成、功能化与表征

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DOI：

10.3791/59440

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2019年4月16日

 , 
1Materials Science and Engineering Program, University of California, San Diego, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego

本文内容

摘要

我们展示了用于高效体外和体内寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成方法。多孔硅纳米颗粒负载siRNA形成核心，通过挤出法包覆融合性脂质形成外壳。本方法包括靶向配体的功能化修饰及颗粒的表征。

摘要

随着基因治疗的发展，开发一种高效的体内核酸载荷递送系统已成为同等重要的课题。近期研究表明，融合性多孔硅纳米颗粒（F-pSiNPs）具有显著的体内基因沉默效果，这归因于其高寡核苷酸负载能力以及独特的细胞摄取途径，该途径可避免内吞作用。F-pSiNPs 的合成是一个多步骤过程，包括：（1）将寡核苷酸载荷装载并封存于硅孔中；（2）在多孔硅核周围同时进行融合性脂质的包覆和粒径控制；（3）连接靶向肽并洗涤以去除过量的寡核苷酸、硅碎片及多余肽段。颗粒的粒径均一性通过动态光散射进行表征，其核壳结构可通过透射电子显微镜验证。融合性摄取的验证方法是将亲脂性染料 1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）加载至融合性脂双层中，并在体外处理细胞，观察其是否定位于细胞膜而非内吞途径。靶向能力及体内基因沉默效果此前已在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）肺炎小鼠模型中定量评估，其中靶向肽可引导 F-pSiNPs 富集于感染部位。除应用于金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染外，F-pSiNP 系统还可用于递送任何寡核苷酸，以实现多种疾病的基因治疗，包括病毒感染、癌症和自身免疫性疾病。

引言

基因治疗通过调控特定基因的表达以达到治疗效果。目前已发现并研究了多种基因调控工具，包括利用寡核苷酸的核糖核酸干扰（RNAi）（例如小干扰RNA（siRNA）1,2、微小RNA（miRNA）3,4）、DNA质粒5,6、核酸酶（例如锌指核酸酶、TALENs）7,8以及CRISPR/Cas9系统9,10。尽管每种工具的作用机制各不相同，但所有这些工具都必须进入细胞质或细胞核才能发挥活性。因此，尽管这些工具在体外已被证实可显著调控基因表达，其在体内的有效性却受到细胞外和细胞内多重障碍的限制。由于这些工具来源于生物分子，人体内存在多种酶和清除系统，能够降解或清除这些外源性分子11。即使工具成功到达靶细胞，仍会遭遇内吞作用——一种细胞摄取方式，会将这些工具包裹在类似胃酸环境的囊泡中，导致其被降解或排出细胞。事实上，研究显示脂质纳米颗粒通过巨胞饮作用被内吞后，约70%的siRNA在摄入后24小时内通过胞吐作用被排出细胞12,13。剩余大部分siRNA通过溶酶体途径被降解，最终仅有约1–2%的siRNA能够从内体中逃逸，进而可能发挥RNA干扰作用13,14。

我们近期开发了一种具有融合特性的多孔硅纳米颗粒（F-pSiNPs），其结构包含一个负载siRNA的多孔硅纳米颗粒核心以及一层具有融合能力的脂质外壳15。与传统的寡核苷酸递送系统相比，F-pSiNPs具有三大显著优势：（1）其融合性脂质包被可使颗粒绕过内吞作用，将全部载荷直接递送至细胞质中（相比之下，经内吞途径进入的颗粒效率仅为1–2%13,14）（图1）；（2）多孔硅纳米颗粒核心可实现siRNA的高载量（质量分数>20 wt%，而传统系统的载量为1–15 wt%）15，且在颗粒通过融合性摄取脱去脂质包被后，核心颗粒在细胞质中迅速降解，从而释放siRNA；（3）可通过偶联靶向肽实现体内对特定细胞类型的靶向归巢。 

F-pSiNP 系统在金黄色葡萄球菌（S. aureus）肺炎致死性小鼠模型中已显示出显著的基因沉默效果（体外 >95%；体内 >80%）及相应的治疗作用；相关结果此前已有发表15。然而，F-pSiNP 系统的复杂结构需要精细操作和优化调控，以制备均一且稳定的纳米颗粒。因此，本研究旨在提供一套完整的实验方案，并介绍F-pSiNP的合成、功能化及表征过程中的优化策略，用于实现siRNA的靶向递送，从而获得高效的基因沉默效果。

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方案

1. 多孔硅纳米颗粒（pSINPs）的合成

警告：操作氢氟酸（HF）时务必格外小心。须严格遵循其安全数据表（SDS）中的所有安全指南，在通风橱中处理含HF的化学品，并穿戴适当的个人防护装备（PPE；外层佩戴丁基手套、内层佩戴双层手套，身穿丁基围裙并在其下穿戴实验服，佩戴面罩并在其下佩戴安全护目镜）。所有大学及研究机构均须遵守相关安全规程。&D 实验室要求在使用氢氟酸（HF）前必须接受专门的安全培训。未经当地实验室安全负责人预先批准，不得擅自操作氢氟酸，因为除本文所述外，还需采取其他额外的安全防护措施。

  1. 蚀刻溶液的制备
    1. 配制用于蚀刻的3:1氢氟酸（HF）溶液（用于步骤1.3和1.4），在塑料量筒中加入30 mL 48%水溶液HF和10 mL无水乙醇（EtOH）。该溶液必须盛装于高密度塑料容器（例如HDPE）中，因为HF会溶解玻璃。
    2. 配制用于剥离的1:29氢氟酸（HF）溶液（用于步骤1.5），在塑料量筒中加入1 mL 48%水溶液HF和29 mL无水乙醇。该溶液必须盛装于高密度塑料容器（例如HDPE）中，因为HF会溶解玻璃。
    3. 配制用于溶解过量多孔硅（pSi）的1 M KOH乙醇溶液（含10% EtOH）（用于步骤1.3和1.5）。
  2. 蚀刻池的组装
    1. 在聚四氟乙烯（Teflon）蚀刻池中设置蚀刻腔，其蚀刻面积为8.6 cm2（面积通过测量O型圈内可用于蚀刻的硅片表面直径，并按A = πr2计算得出），按自上而下的顺序放置（图2a）：（1）Teflon池盖；（2）O型圈；（3）将单晶（1 0 0）取向p++型硅片用金刚石切割器切成四等份后的一块；（4）铝箔；（5）Teflon池底座，并轻轻拧紧螺丝以防止泄漏。
    2. 向腔内加入EtOH。用擦拭纸插入Teflon池盖与底座之间的缝隙中。若取出时擦拭纸干燥，则说明蚀刻池已密封；若湿润，则说明存在泄漏，需进一步拧紧螺丝直至密封。
  3. 硅片的电化学抛光
    1. 将组装好的蚀刻池移入通风橱中。
    2. 向腔内加入10 mL 3:1 HF溶液。
    3. 将正极导线连接至蚀刻池中的铝箔（电极），负极导线连接至浸没在蚀刻池3:1 HF溶液中的铂丝（对电极），以构成完整电路（图2b）。
    4. 以50 mA cm-2的恒定电流进行电蚀刻，持续60秒。蚀刻完成后，断开电路，用注射器小心冲洗去除3:1 HF溶液，并用EtOH冲洗三次。
    5. 缓慢向腔内加入10 mL 1 M KOH溶液，溶解已蚀刻的表层，等待气泡反应停止。
    6. 用水冲洗KOH溶液三次，再用EtOH冲洗三次。
  4. 在硅片上电化学蚀刻形成多孔层
    1. 施加方波交流电，低电流密度为50 mA/cm2，持续0.6秒，高电流密度为400 mA/cm2，持续0.36秒，重复500个循环。
    2. 蚀刻完成后，断开电路，用注射器小心冲洗去除3:1 HF溶液，并用EtOH冲洗三次。
  5. 将多孔层从硅片上剥离
    1. 向腔内加入10 mL 1:29 HF溶液。
    2. 以3.7 mA/cm2的恒定电流进行电蚀刻，持续250秒。蚀刻完成后，断开电路。此时多孔硅（pSi）层可能出现可见的波纹，表明其已从单晶硅片上脱离。轻轻冲洗去除1:29 HF溶液，用EtOH冲洗三次，再用水冲洗三次。
    3. 使用移液枪头用力沿pSi层边缘划裂，使其完全脱离。用EtOH将pSi碎片（芯片）从Teflon蚀刻池中收集至称量舟中，再转移至玻璃小瓶中。pSi芯片可在EtOH中室温保存超过6个月。
    4. 缓慢向腔内加入10 mL 1 M KOH溶液，溶解硅片上残留的多孔硅，等待气泡反应停止。
    5. 用水冲洗KOH溶液三次，再用EtOH冲洗三次。
    6. 重复步骤1.3–1.5，直至整个硅片厚度被完全蚀刻。
  6. 超声处理多孔层以形成纳米颗粒
    1. 将含有pSi芯片的玻璃小瓶中的溶剂由EtOH更换为2 mL去离子水（DI水）。
    2. 牢固盖紧瓶盖，并用Parafilm密封。
    3. 将玻璃小瓶放入超声清洗槽中，调整位置使其内pSi芯片完全浸没于液面以下。
    4. 在35 kHz频率和48 W射频功率下超声处理12小时。为防止超声过程中水分大量蒸发，可将一个装满水的容量瓶倒置，使其瓶口接触水浴液面。
    5. 将玻璃小瓶静置于水平台面上1小时，使较大颗粒沉降到底部。用移液枪吸取上清液，该悬浮液中含有粒径小于100 nm的pSi纳米颗粒（pSiNPs）。

2. 融合性脂质膜的制备

  1. 脂质储备液的制备
    1. 在通风橱中，将DMPC、DSPE-PEG-MAL和DOTAP脂质溶于氯仿，配制成10 mg/mL的储备液。这些储备液在用封口膜严密封闭后可于-20 °C保存最多6个月。
  2. 制备融合性脂质膜
    注意：融合性脂质组成为DMPC、DSPE-PEG和DOTAP，其摩尔比分别为76.2:3.8:20和96.2:3.8:0。
    1. 在玻璃小瓶中，用移液器加入72.55 μL DMPC、15.16 μL DSPE-PEG和19.63 μL DOTAP，混合均匀。
    2. 可选步骤：如需对脂质包被进行荧光标记，可额外加入20 µL浓度为1 mg/mL的DiI乙醇溶液。
    3. 将小瓶置于通风橱中，瓶盖松开，使氯仿过夜挥发。干燥后形成的脂质膜将呈现为瓶底浑浊、坚硬的凝胶状物质。

3. 将siRNA装载并封入pSiNPs

  1. 氯化钙负载储备液的制备
    1. 将 1.11 g 的 CaCl­2 溶解于 10 mL 无 RNA 酶的水中，配制成 2 M 的 CaCl2 溶液。
    2. 将溶液在 > 10,000 x g 条件下离心 1 分钟，使聚集体沉淀，并用移液器收集上清液。或者，可通过 0.22 µm 滤膜过滤溶液。
  2. siRNA 负载储备液的制备
    1. 用无 RNA 酶的水将 siRNA 水化或稀释至 150 µM。该储备液可分装后于 -20 °C 冷冻保存至少 30 天，前提是避免频繁冻融。
  3. 使用氯化钙将 siRNA 负载至 pSiNPs 中
    1. 准备一个冰浴超声装置。
    2. 在 15 分钟超声过程中，轻轻将 150 µL siRNA 和 700 µL 的 2 M CaCl2 加入 150 µL 的 pSiNP 中。确保微量离心管的管盖保持打开，以释放产生的气体。
    3. 从超声仪中取出含有 1 mL 负载 siRNA 且包被氯化钙的 pSiNPs 的离心管。

4. 用融合性脂质包被载有siRNA的pSiNPs

  1. 脂质体挤出装置的准备
    1. 用去离子水装满一个宽口烧杯。将1张聚碳酸酯膜（200 nm孔径）和4个滤膜支撑架漂浮在水面上浸泡。按照制造商的说明组装脂质体挤出装置。
  2. 用载有siRNA的pSiNps水合脂质膜
    1. 在玻璃小瓶中，加入1 mL步骤3.3.3获得的载有siRNA的钙涂层pSiNPs，以水合干燥的脂质膜。用移液器反复吹打，直至所有脂质膜从瓶底脱离，并形成浑浊且均匀的溶液。
    2. 将磁力搅拌子放入玻璃小瓶中，将小瓶置于加热板上，加热至40 °C（或高于脂质相变温度足够高的温度，以保持脂质处于流动性更强的液晶相），同时磁力搅拌溶液20分钟。
  3. 挤出脂质包被的pSiNPs以控制粒径
    1. 用挤出器注射器吸取1 mL脂质包被的pSiNP-siRNA溶液。将空注射器安装在挤出器的一端，装有样品的注射器安装在另一端。
    2. 通过缓慢推动活塞，开始挤出过程，使颗粒从一个注射器经聚碳酸酯膜挤入另一个注射器。重复此过程20次。若活塞卡住，可能是滤膜或支撑架堵塞。此时应拆开挤出器，更换膜和滤膜支撑架。如果问题仍然存在，可将颗粒溶液稀释至不再发生堵塞为止。
    3. 将挤出后的颗粒收集至微量离心管中。

5. 靶向肽的偶联

  1. 将靶向肽偶联至脂质包衣
    1. 用无RNA酶的水配制肽储备液，使肽浓度为1 mg/mL。
    2. 在含有融合性脂质包被pSiNPs的微量离心管中，加入100 µL 1 mg/mL的肽储备液，轻轻吹打混匀。室温下静置20分钟（或 alternatively，> 4 °C下放置2小时）。
    3. 为去除多余的肽、siRNA及其他辅料，使用30 kDa离心过滤器，在25 °C下以5,000 x g离心1小时进行洗涤。再在相同条件下，用1 mL PBS重复离心洗涤两次。
    4. 将最终的肽偶联融合性脂质包被pSiNPs重悬于PBS中，调整至所需浓度。粒子可分装后于-80 °C冷冻保存，至少可稳定30天。

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结果

成功的融合性pSiNP合成应产生均匀、略呈浑浊的溶液（图3a）。若未能优化pSiNPs : siRNA : CaCl2 的比例和浓度，则在负载过程中可能发生聚集（图3b）。当颗粒通过200 nm的膜挤出时，通过DLS测得的融合性pSiNPs的平均流体动力学直径应约为200 nm，平均zeta电位约为+7 mV，如图4所示。在用靶向肽进行表面修饰后，总体直径应增加至小于230 nm，平均zeta电位降低至-3.4 mV15。若颗粒尺寸与挤出尺寸存在显著偏差，则表明挤出失败（dparticle >> dextrusion），或负载失败（dparticle << dextrusion）。聚集现象也可通过DLS进行定量分析。此外，冷冻分装样品仅可解冻一次，因为反复冻融循环会...

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讨论

多孔硅纳米颗粒的合成过程如图5所示。融合性pSiNPs合成中的关键步骤在于载药环节（步骤3）。如果在合成后发现融合性纳米颗粒发生聚集（图3），可能原因如下：（1）氯化钙储备液未均匀配制，因此必须严格遵循或优化步骤3.1.2；或（2）pSiNP : siRNA : CaCl2 的比例，或三者中一种或多种组分的浓度未达到最优。建议从CaCl­2 ­浓度开始重新优化（例如，将浓度从2 M调整为1 M或3 M）。此外，务必确保所用CaCl2来自同一供应商，因为我们发现不同供应商提供的相同化学品会导致载药步骤中pH值偏低，进而导致siRNA载入失败。在步骤1.6.6之后，将颗粒悬浮于无RNase水中放置2天，可能导致pSiNPs在载药前发生浓缩、稀释或进一步降解。

载药后，由于颗粒的浓度或密度较高，脂质包被常导致挤出困难（步骤4）。若挤出膜发生堵塞，强行挤出可能导致膜破裂。一旦发生堵塞，应...

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披露

MJS 是 Spinnaker Biosciences, Inc. 的科学创始人，并持有该公司的股权利益。  尽管本资助项目已根据其整体研究范围及对 Spinnaker Biosciences, Inc. 的潜在利益被认定存在利益冲突并纳入管理，但本篇出版物中所包含的研究结果未必与 Spinnaker Biosciences, Inc. 的利益相关。该安排的条款已根据加州大学圣地亚哥分校的利益冲突政策进行了审查并获得批准。其他作者无任何需要披露的内容。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院通过合同编号 R01 AI132413-01 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）Avanti Polar Lipids850345P粉末
1,2-二油酰-3-三甲铵基丙烷（氯化物盐）（DOTAP）Avanti Polar Lipids890890P粉末
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（DSPE-PEG(2000) 马来酰亚胺）Avanti Polar Lipids880126P粉末
铝箔VWR International, LLC12175-001
氯化钙（CaCl₂）SpectrumC1977无水，颗粒状
氯仿Fisher ScientificC6061
计算机DellDimension 9200任何带有 PCI 插槽的计算机均可使用
Dil 染料（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（“DiI”；DiIC18(3)））Life TechnologiesD3911
乙醇（EtOH）UCSD Store111200 证明（纯度）
氢氟酸（HF）VWR International, LLCMK264008 纯度：48%
Keithley 2651a 源表Keithley2651A
LabVIEWNational Instruments示例程序可从以下网址获取：http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26Thermo Fisher ScientificL7526
带加热块的脂质体挤出装置Avanti Polar Lipids610000
Microcon-30kDa 离心过滤单元EMD MilliporeMRCF0R030
O型圈ChemGlassCG-305-220
磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher Scientific10010-049
铂金线圈VWR International, LLCAA10285-BU
氢氧化钾（KOH）Fisher ScientificP250-3
硅晶圆Siltronix定制订单
siRNADharmacon定制订单IRF5，正义链 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’，反义链 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
超声波破碎仪VWR International, LLC97043-960
靶向肽（CRV）CPC Scientific定制订单序列 CRVLRSGSC；通过两个半胱氨酸残基侧链之间的二硫键形成环状结构
聚四氟乙烯刻蚀池Interface Performance Materials, Inc.定制订单
UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水 Thermo Fisher Scientific10977015

参考文献

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siRNA Zeta

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