用于寡核苷酸传递的可生多孔硅纳米粒子的合成、功能化和表征

Summary

我们证明了富里多孔硅纳米粒子的合成, 以提高体外和体内寡核苷酸的传递效果。多孔硅纳米颗粒加入 siRNA 形成核心, 通过挤压包覆的杂原脂质形成外壳。包括定位功能化和粒子表征。

Abstract

随着基因治疗的出现, 开发有效的体内核苷酸-有效载荷运载系统已成为平行的重要手段。具有较高的寡核苷酸承载能力和独特的细胞吸收途径, 避免了内吞, 其具有较高的体内基因沉默效率。F-pSiNPs 的合成是一个多步骤的过程, 包括: (1) 硅孔中寡核苷酸有效载荷的加载和密封;(2) 多孔硅芯周围的致热脂质同时涂装和施胶;(3) 结合靶向肽和洗涤, 去除多余的寡核苷酸、硅碎片和肽。粒子的尺寸均匀性以动态光散射为特征, 其核壳结构可通过透射电子显微镜验证。通过将亲脂性染料 1, 1 '-二辛代基-3, 3 ' 3 ', 3 '-四甲基硫代卡宾素高氯酸盐 (DiI) 加载到热原脂质双层 (DiI) 中, 并将其体外处理到细胞中, 观察质膜染色量与质膜的对比, 从而验证了热原吸收的有效性。内细胞定位。靶向和体内基因沉默的效果以前是在金黄色葡萄球菌肺炎的小鼠模型中量化的, 在该模型中, 靶向肽有望帮助 F-pSiNPs 回家到感染部位。除了在金黄色葡萄球菌感染中的应用外, F-pSiNP 系统还可用于提供任何寡核苷酸用于广泛疾病的基因治疗, 包括病毒感染、癌症和自身免疫性疾病。

Introduction

基因治疗调节特异性基因表达, 以获得治疗效果。已经发现并研究了许多基因调控工具, 包括使用寡核苷酸的核糖核酸干扰 (rnai) (例如, 短干扰 rna (sirna)^1,2, 微 rna (mirna)^3,4)、Dna 质粒^5、6、核酸酶 (如锌指、talens)^7、8和 crispr/cas9 系统^9,10。虽然每个工具的作用机制不同, 但所有工具都必须到达细胞的细胞质或细胞核才能活跃。因此, 虽然这些工具已被证明能诱导在体外调节基因表达方面发挥显著作用, 但体内的功效却存在细胞外和细胞内障碍。由于这些工具是生物来源的, 我们的身体中存在许多酶和清除系统, 有能力降解或去除外来分子¹¹。即使在工具到达目标细胞的情况下, 它们也会出现内吞;一种细胞吸收模式, 将工具封装和捕获在酸性胃状囊泡中, 使工具降....

Protocol

1. 多孔硅纳米粒子 (pSINPs) 的合成

注意: 使用氢氟酸 (HF) 时, 请务必小心。根据安全数据表 (SDS) 遵循所有安全指南, 在烟罩中处理任何含 hf 的化学品, 并佩戴适当的个人防护设备 (PPE; 外部有带丁基手套的双手套, 下面有实验室涂层的丁基围裙下面有安全护目镜)。所有大学和研发实验室在使用前都需要进行有关高频安全的专门培训。未经当地实验室安全协调员事先批准, 请勿尝试使用 HF, 因为此处未描述的其他安全措施是必需的。

1. 蚀刻解决方案的制备
   1. 要使 3:1 hf 溶液用于蚀刻 (用于步骤1.3 和 1.4), 请在塑料刻度缸中填充30毫升的水含量48% 的 Hf 和10毫升的绝对乙醇 (Etching)。该溶液必须包含在高密度塑料 (如高密度聚乙烯) 中, 因为 HF 溶解玻璃。
   2. 要制作 1:29 hf 溶液进行升空 (在步骤1.5 中使用), 请在塑料刻度缸中填充1毫升的水含量为 48% hf, 29 毫升为绝对乙醇。该溶液必须包含在高密度塑料 (如高密度聚乙烯) 中, 因为 HF 溶解玻璃。
   3. 在 10% EtOH 中制造 1 M KOH 溶液, 以获得多余的 pSi 溶解 (在步骤1.3 和1.5 中使用)。
2. 设置蚀刻单元格
   1. 在....

Results

成功合成杂生 pSiNPs 应能产生均匀、略显不透明的溶液 (图 3a)。如果不能优化 pSiNPs 的比例和浓度: Sirn:ccol₂可能会导致加载时聚集 (图 3b)。当颗粒通过200纳米膜挤出时, DLS 测量的致熔剂 pSiNPs 的平均流体动力直径应为约200纳米, 平均 zeta 电位约为 + 7 mV, 如图 4所示。在靶向肽表面改性后, 总直径应增加到230纳米以下, 平均 zeta 电位下降到-3.4 mV¹⁵。与挤出尺寸的任何大范围偏差都表明挤出失败 (d_颗粒> > d挤出) 或加载失败 (d 颗粒 < < d_挤出).还可以使用 DLS 对聚合进行量化。此外, 冷冻等价物必须只解冻一次, 因为反复的冻融周期会破坏脂质膜和.......

Discussion

多孔硅纳米粒子的合成如图 5所示。在合成杂源 pSiNPs 的关键步骤是在加载步骤 (步骤 3)。如果机身纳米颗粒聚集后合成 (图 3), 原因可能是: (1) 氯化钙库存不是均匀制备的, 因此步骤3.1.2 必须仔细跟踪或细化;或 (2) Psin:sirn:cicl 2 的比率或三个成分中的一个或多个成分的浓度可能不是最佳的。建议从 Ccl 2 浓度开始重新优化 (例如, 从2m 更改为 1 m 或 3 m)。此外, 重要的是要确保 Ccl₂是来自同一供应商, 因为我们发现, 相同的化学品从不同的供应商导致较低的 ph 值在加载步骤, 并随后未能加载 sirna。在加载过程之前, pSiNPs 也可能被浓缩、稀释或进一步降解, 方法是在步骤1.6.6 后将悬浮在无 rnase 水中的颗粒保持2天。

加载后, 由于颗粒的浓度或密度, 脂质涂层经常会导致挤出困难 (第4步)。如果挤出膜堵塞, 强迫挤.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avanti 极性脂质	850345P	粉末	-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DMPC） （DOTAP
）	Avanti 极性脂质	890890P	粉末
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺（聚乙二醇）-2000] （铵盐） （DSPE-PEG（2000） 马来酰亚胺）	Avanti 极性脂质	880126P	粉末
铝箔	VWR International， LLC	12175-001
氯化钙 （CaCl2）	光谱	C1977	无水颗粒
氯仿	Fisher Scientific	C6061
计算机	Dell	Dimension 9200	任何带有 PCI 卡插槽的计算机都是可以接受
的二醇染色剂（1,1'-二十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（'DiI';DiIC18（3）））	Life Technologies	D3911
乙醇 （EtOH）	UCSD Store	111	200 证明
氢氟酸 （HF）	VWR International， LLC	MK264008	纯度： 48%
Keithley 2651a 源计	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		样品程序可从以下网址获得：
http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
脂质体挤出套件，带加热块	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa 离心过滤装置	EMD Millipore	MRCF0R030
O 形圈	ChemGlass	CG-305-220
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Thermo	Fisher Scientific	10010-049
铂线圈	VWR International， LLC	AA10285-BU
氢氧化钾 （KOH）	Fisher Scientific	P250-3
硅晶片	Siltronix	定制顺序
siRNA	Dharmacon	定制顺序	IRF5、正义 5'-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3' 和反义 5'-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3'
Sonicator	VWR International， LLC	97043-960
靶向肽 （CRV）	CPC 科学	定制顺序	序列 CRVLRSGSC;由两个半胱氨酸残基的侧链之间的二硫键呈环
特氟龙刻蚀细胞	Interface Performance Materials， Inc.	定制订购
UltraPure DNase/RNase Free 蒸馏水	Thermo Fisher Scientific	10977015