用于寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成、功能化与表征

摘要

我们展示了用于高效体外和体内寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成方法。多孔硅纳米颗粒负载siRNA形成核心，通过挤出法包覆融合性脂质形成外壳。本方法包括靶向配体的功能化修饰及颗粒的表征。

摘要

随着基因治疗的发展，开发一种高效的体内核酸载荷递送系统已成为同等重要的课题。近期研究表明，融合性多孔硅纳米颗粒（F-pSiNPs）具有显著的体内基因沉默效果，这归因于其高寡核苷酸负载能力以及独特的细胞摄取途径，该途径可避免内吞作用。F-pSiNPs 的合成是一个多步骤过程，包括：（1）将寡核苷酸载荷装载并封存于硅孔中；（2）在多孔硅核周围同时进行融合性脂质的包覆和粒径控制；（3）连接靶向肽并洗涤以去除过量的寡核苷酸、硅碎片及多余肽段。颗粒的粒径均一性通过动态光散射进行表征，其核壳结构可通过透射电子显微镜验证。融合性摄取的验证方法是将亲脂性染料 1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）加载至融合性脂双层中，并在体外处理细胞，观察其是否定位于细胞膜而非内吞途径。靶向能力及体内基因沉默效果此前已在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）肺炎小鼠模型中定量评估，其中靶向肽可引导 F-pSiNPs 富集于感染部位。除应用于金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染外，F-pSiNP 系统还可用于递送任何寡核苷酸，以实现多种疾病的基因治疗，包括病毒感染、癌症和自身免疫性疾病。

引言

基因治疗通过调控特定基因的表达以达到治疗效果。目前已发现并研究了多种基因调控工具，包括利用寡核苷酸的核糖核酸干扰（RNAi）（例如小干扰RNA（siRNA）^1,2、微小RNA（miRNA）^3,4）、DNA质粒^5,6、核酸酶（例如锌指核酸酶、TALENs）^7,8以及CRISPR/Cas9系统^9,10。尽管每种工具的作用机制各不相同，但所有这些工具都必须进入细胞质或细胞核才能发挥活性。因此，尽管这些工具在体外已被证实可显著调控基因表达，其在体内的有效性却受到细胞外和细胞内多重障碍的限制。由于这些工具来源于生物分子，人体内存在多种酶和清除系统，能够降解或清除这些外源性分子¹¹。即使工具成功到达靶细胞，仍会遭遇内吞作用——一种细胞摄取方式，会将这些工具包裹在类似胃酸环境的囊泡中，导致其被降解或排出细胞。事实上，研....

方案

1. 多孔硅纳米颗粒（pSINPs）的合成

警告：操作氢氟酸（HF）时务必格外小心。须严格遵循其安全数据表（SDS）中的所有安全指南，在通风橱中处理含HF的化学品，并穿戴适当的个人防护装备（PPE；外层佩戴丁基手套、内层佩戴双层手套，身穿丁基围裙并在其下穿戴实验服，佩戴面罩并在其下佩戴安全护目镜）。所有大学及研究机构均须遵守相关安全规程。&D 实验室要求在使用氢氟酸（HF）前必须接受专门的安全培训。未经当地实验室安全负责人预先批准，不得擅自操作氢氟酸，因为除本文所述外，还需采取其他额外的安全防护措施。

1. 蚀刻溶液的制备
   1. 配制用于蚀刻的3:1氢氟酸（HF）溶液（用于步骤1.3和1.4），在塑料量筒中加入30 mL 48%水溶液HF和10 mL无水乙醇（EtOH）。该溶液必须盛装于高密度塑料容器（例如HDPE）中，因为HF会溶解玻璃。
   2. 配制用于剥离的1:29氢氟酸（HF）溶液（用于步骤1.5），在塑料量筒中加入1 mL 48%水溶液HF和29 mL无水乙醇。该溶液必须盛装于高密度塑料容器（例如HDPE）中，因为HF会溶解玻璃。
   3. 配制用于溶解过量多孔硅（pSi）的1 M KOH乙醇溶液（含10% EtOH）（用于步骤1.3和1.5）。
2. 蚀刻池的组装

结果

成功的融合性pSiNPs合成应产生均匀且略带浑浊的溶液（图3a）。若未能优化pSiNPs : siRNA : CaCl₂的比例和浓度，则在载药过程中可能发生聚集（图3b）。由于颗粒需通过200 nm的膜进行挤出，因此通过DLS测得的融合性pSiNPs的平均流体动力学直径应约为200 nm，平均zeta电位约为+7 mV，如图4所示。在用靶向肽进行表面修饰后，总体直径应增加至小于230 nm，平均zeta电位则应降低至-3.4 mV¹⁵。若颗粒尺寸显著偏离挤出尺寸，则提示挤出失败（d_particle >> d_extrusion），或载药失败（d_particle << d_extrusion）。聚集现象也可通过DLS进行定量分析。此外，冷冻分装样品.......

讨论

多孔硅纳米颗粒的合成过程如图5所示。融合性pSiNPs合成中的关键步骤在于载药环节（步骤3）。如果在合成后发现融合性纳米颗粒发生聚集（图3），可能原因如下：（1）氯化钙储备液未均匀配制，因此必须严格遵循或优化步骤3.1.2；或（2）pSiNP : siRNA : CaCl₂ 的比例，或三者中一种或多种组分的浓度未达到最优。建议从CaCl­₂ ­浓度开始重新优化（例如，将浓度从2 M调整为1 M或3 M）。此外，务必确保所用CaCl₂来自同一供应商，因为我们发现不同供应商提供的相同化学品会导致载药步骤中pH值偏低，进而导致siRNA载入失败。在步骤1.6.6之后，将颗粒悬浮于无RNase水中放置2天，可能导致pSiNPs在载药前发生浓缩、稀释或进一步降解。

载药后，由于颗粒的浓度或密度较高，脂质包被常导致挤出困难（步骤4）。若挤出膜发生堵塞，强行挤出可能导致膜破裂。一旦发生堵塞，应.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）	Avanti Polar Lipids	850345P	粉末
1,2-二油酰-3-三甲铵基丙烷（氯化物盐）（DOTAP）	Avanti Polar Lipids	890890P	粉末
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（DSPE-PEG(2000) 马来酰亚胺）	Avanti Polar Lipids	880126P	粉末
铝箔	VWR International, LLC	12175-001
氯化钙（CaCl₂）	Spectrum	C1977	无水，颗粒状
氯仿	Fisher Scientific	C6061
计算机	Dell	Dimension 9200	任何带有 PCI 插槽的计算机均可使用
Dil 染料（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（“DiI”；DiIC18(3)））	Life Technologies	D3911
乙醇（EtOH）	UCSD Store	111	200 证明（纯度）
氢氟酸（HF）	VWR International, LLC	MK264008	纯度：48%
Keithley 2651a 源表	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		示例程序可从以下网址获取：http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
带加热块的脂质体挤出装置	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa 离心过滤单元	EMD Millipore	MRCF0R030
O型圈	ChemGlass	CG-305-220
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	10010-049
铂金线圈	VWR International, LLC	AA10285-BU
氢氧化钾（KOH）	Fisher Scientific	P250-3
硅晶圆	Siltronix	定制订单
siRNA	Dharmacon	定制订单	IRF5，正义链 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’，反义链 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
超声波破碎仪	VWR International, LLC	97043-960
靶向肽（CRV）	CPC Scientific	定制订单	序列 CRVLRSGSC；通过两个半胱氨酸残基侧链之间的二硫键形成环状结构
聚四氟乙烯刻蚀池	Interface Performance Materials, Inc.	定制订单
UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水	Thermo Fisher Scientific	10977015