多点PCR和毛细血管电泳对鱼类致病菌的多点变量数串联重复分析

Summary

这里介绍的多位数可变数串联重复分析(MLVA)测定使鱼类致病菌Yersinia ruckeri的廉价、坚固和便携式高分辨率基因分型成为可能。从纯培养基开始,该测定采用多路PCR和毛细管电泳,为下游应用生产十位MLVA型材。

Abstract

耶尔西尼亚·鲁克里是全世界养殖鲑鱼的重要病原体,但缺乏适用于该细菌的流行病学调查(感染追踪等)的简单工具。因此,多位可变数串联重复分析 (MLVA) 测定被开发为一种易于访问且明确的工具,用于对回收的分离物进行高分辨率基因分型。对于此处介绍的MLVA测定,DNA通过在水中煮沸的细菌细胞从培养的Y.ruckeri样品中提取,然后使用上清液作为PCR的模板。以十个可变数串联重复(VNTR)位点为目标的引物对,穿插在整个Y.ruckeri基因组中,在相同的循环条件下运行的两个五丛PCR反应之间平均分布。前引种标有三种荧光染料中的任何一种。在凝胶电泳确认后,PCR产物被稀释并进行毛细血管电泳。从生成的电表图配置文件中,表示每个 VNTR 位点的峰值是大小调用的,用于计算硅中 VNTR 重复计数。然后,生成的十位 MLVA 轮廓用于生成最小生成树,以便通过聚类分析进行动物学评估。高度可移植的输出数据,以数字MLVA配置文件的形式,可以跨实验室快速比较,并放置在时空环境中。从培养菌群到动物疫病评估的整个过程可在一个工作日内完成多达48个Y.ruckeri分离物。

Introduction

耶尔西尼亚·鲁克里,一种革兰氏阴性细菌和耶尔西尼亚人家族的成员,在全世界^养殖鲑鱼中引起叶尔西尼病。它很容易通过在很多类型的琼脂培养中被感染的鱼类诊断出来,但直到最近,关于Y.ruckeri的人口结构和动物学,在全世界和不同生境(宿主物种等)中,鲜为人知。Y. ruckeri现有的血清分型系统不一致,缺乏相互兼容性,流行病学分辨率较低。对细菌进行了一些分子研究,采用多位序列打字(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)或全基因组序列(WGS)分析2、3、4等技术 ^{, 5}.然而,MLST不能为常规感染追踪提供足够高的分辨率,而PFGE需要人工,并且产生的结果不容易跨实验室移植。虽然WGS分析将提供一个接近最终的解决办法,但建立和实施这种分析将是技术和生物信息学能力的先决条件,而技术和生物信息学能力仍然局限于相对较少的实验室。

多位点可变数串联重复分析(MLVA)是一种简单易用的分子打字工具,在某些情况下提供基因分辨率几乎与WGS分析6,7的分辨率相匹配。该技术基于选定可变数串联重复 (VNTR) 位点的重复数变化,从而产生高度可传输的输出数据,因此将分析的隔离物比较直接用于在线数据库和跨实验室。虽然MLST仍然是许多细菌病原体的流行病学类型的黄金标准,但越来越多的研究发现MLVA8、9、10的歧视性能力明显较高。还公布了几种针对鱼类致病菌的规程,如弗朗西斯拉诺图尼西斯、爱德华西耶拉皮西达和雷尼巴西兰藻11、12、 ¹³.

这里提出的十位MLVA协议,最近形成了广泛的Y.ruckeri种群^研究14的基础,涉及从琼脂培养的菌落中提取DNA,多路PCR和毛细血管电泳(CE),其次是在silico应用程序中的下游。对于每个被检查的分离物,两个多路PCR,都含有五个荧光标记引物对(6FAM,NED或VIC),每个针对单个VNTR区域,在相同的条件下并行运行。通过凝胶电泳 (GE) 验证 PCR 放大器后,PCR 产物在 CE 分析之前被稀释,表示相应 VNTR 位点的峰是从生成的电检文件中调用的。与计算 CE 迁移模式中轻微、特定于序列差异的按位特定公式一起,使用 VNTR CE 大小调用来计算与 10 位 MLVA 配置文件串联的 VNTR 重复计数。这些用作动物学评估的输入(例如,通过最小生成树 (MST) 图中的聚类分析)。

Protocol

注意:对于整个协议,建议使用实验室外套、一次性手套和无菌试剂和设备,无谓地执行所有湿实验室程序。建议在单独的房间(PCR前)中制备PCR反应,不用于PCR扩增和/或PCR产物(PCR后)的处理。根据制造商的建议储存所有试剂。有关试剂、设备和软件使用的更多信息,请参阅材料表。

1. 基因组DNA的细菌培养与提取

1. 在任何合适的琼脂类型上播种Y.ruckeri纯培养物(作者使用5%牛血琼脂),在22°C孵育1-2天,或15°C孵育3-4天。
2. 从每个琼脂板中,选择一个具有接种回路的代表性菌群,并转移到含有50μL超纯水的1.5 mL离心管。在100°C的加热块上短暂悬浮、涡旋,并在加热块上孵育7分钟。
3. 以16 000 x g离心3分钟,并使用移液器小心地将上清液转移到空的1.5 mL离心管中。继续下一步,使用上清液作为模板DNA或储存在-20°C,直到这样的时间。

2. 多路PCR设置和循环条件

注:每个多路PCR反应(每Y.ruckeri分离物2个)应包含12.5 μL的2倍多路PCR Plus主混合物,每个适当的引物对0.1至0.2 μM(表1)和3μL的模板DNA,经调整后为25μL的最终反应体积添加无RNase水。旨在将荧光标记的前引物的光线曝光保持在最低限度(例如,将其存储管包裹在铝箔中)。

1. 对于两个多路PCR测定(表1)中的每一个,根据样本数量加上一个阳性和一个阴性对照,制备上述主混合物(不含模板DNA)。此外,允许 10% 的余量。涡旋准备好的主混合在低速。
2. 根据样品数量,将每个主混合物的22 μL分别分配到PCR条或板上的单独孔中,并为每个孔添加3μL模板(对于正数和负对照,分别使用经验证的Y.ruckeri的DNA应变和超净化水)。短暂密封和离心机。
3. 在 PCR 热循环器上运行所有样品,使用以下程序:(i) 在 95°C 下运行所有样品(ii) 30 个周期,在 95°C 时运行 0.5 分钟,在 60°C 运行 1.5 分钟,在 72°C 运行 1 分钟,(iii) 在 68°C 下运行 60 分钟,然后无限期冷却至 4°C。程序将在 3 小时内完成。

3. 凝胶电泳的PCR安普利生确认

1. 根据制造商的建议,在1x三倍-硼酸盐-EDTA(TBE)缓冲液中制备1.5%(w/v)角胶凝胶,适合要测试的PCR反应数量。在铸造之前,每50μL凝胶溶液加入5μL荧光核酸染料并混合。酌情使用托盘和梳子进行铸造,为DNA参考阶梯留下适当数量的孔。
2. 设置后,将凝胶浸入 1x TBE 缓冲液中的 GE 系统中。将 PCR 产品 5 μL 与 2 μL 的加载染料混合,并转移到凝胶井中。在空井中加入5μL的DNA阶梯,供参考。
3. 以每 15 厘米 110 V 的速度运行凝胶约 1 小时,并使用基于紫外线的凝胶成像/可视化系统来验证是否存在代表 PCR 放大器的多个(最多五个)带(参见图 1中的示例)。丢弃凝胶。继续下一步,或将剩余的PCR产品储存在4°C,直到进一步加工。

4. 毛细电泳设置和运行条件

1. 在确认PCR放大脂剂后,在纯净水中稀释PCR产物1:10(v/v)。短暂密封、混合和离心机。
2. 在烟柜中工作,准备一卷主混合物,包括9 μL的成酰胺和0.5 μL的尺寸标准每个PCR产品(允许10%剩余体积)。在加入0.5 μL稀释PCR产物之前,在适合可用CE系统的板上将9.5μL分配至孔中。短暂密封、混合和离心机。
   警告:小心处理。将形式酰胺与水混合会产生有毒甲酸。
3. 使用 PCR 热循环仪,在 95°C 下使样品变性 3 分钟,然后无限期冷却到 4°C。根据制造商的说明,将板短暂离心,并将板加载到经过校准的 CE 系统中。
4. 运行片段分析CE使用试剂,适合选择的设备及以下设置:60°C;1.6 kV(每厘米32 V)注射5次;32 分钟运行时间,运行速度为 15 kV(每厘米 300 V)。对 24 个毛细管(50 厘米)上的 24 口井进行 CE 片段分析通常需要大约 50 分钟。

5. VNTR 大小调用、重复计数计算和 MLVA 分析

注:步骤5.1描述了Y.ruckeri VNTR CE大小调用从电表文件,使用材料表中列出的特定软件。有关其他详细信息和故障排除,请参阅软件手册。有关使用其他软件,请参阅相应的手册。

1. 导入 CE 结果文件(每个Y. ruckeri隔离两个)。将分析方法设置为"微卫星默认值",并在"大小标准"下选择相应的产品选择,然后按下"分析"按钮。通过大小匹配编辑器验证大小标准片段的正确标识,并纠正任何明显错误的分配。
   1. 选择要读取的示例后,点击"显示图"按钮,然后按Ctrl+A以启用大小表的视图。在顶部面板中,按住Ctrl,同时单击表示 VNTR 放大的五个峰值(根据需要使用缩放工具)。
      注:对于每个多路PCR产品,电图将显示分布在所使用的三种染料中的五个峰值(参见表1中对前引体的5'染料标记和图2中的两个示例)。
   2. 按Ctrl_G筛选大小表,仅显示五个突出显示的峰值的特征,并记录下游应用的每个 VNTR 位置的 CE 大小调用(参照表1)。
2. 为了考虑CE期间的偏置放大位移动模式,根据下面提供的公式计算准确的VNTR重复计数,将VNTR CE大小调用与locus特定变量结合使用(见表1)。为了提高效率,建议自动执行此过程(例如,使用电子表格模板)。
   
3. 舍入计算的 VNTR 重复数倒数到最接近的整数,并串联成十位字符串,每个字符串表示单个Y. ruckeri隔离的 MLVA 轮廓。

6. MLVA 数据的最小生成树群集分析

注:步骤 6 描述了使用材料表中列出的特定软件从Y. ruckeri MLVA 数据创建的 MST 图表。有关其他详细信息和故障排除,请参阅软件手册。有关使用其他软件,请参阅相应的手册。

1. 创建新数据库并选择激活 MLVA 插件。
2. 通过选择字符类型数据后跟"导入"字段和字符(根据存储格式进一步选择子选择),导入Y. ruckeri MLVA 配置文件和元数据。提示时,根据导入文件的内容指定导入规则:在"目标类型"列中,将 VNTR 重复计数分类为字符值:VNTR,并将杂项元数据分类为"条目信息:条目信息"字段.
   注:为了进行比较和上下文,还可以将整个已发布(开放访问)数据集与使用当前 MLVA 协议¹⁴的原始文件一起导入。MLVA 的配置文件和元数据,关于Y. ruckeri分离物的各种集合 (n = 484), 该研究通过以下 https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files链接可从其补充材料(表 S1 和 S2)获得
3. 在实验类型面板中,打开VNTR条目,并将每个 VNTR 位点的最小值和最大值分别设置为0和100。在"常规设置"下,将十进制位数设置为 0,并在"数据类型"下选择"数字"。检查时将缺失值视为零。
4. 选择用于 MST 群集分析的导入样本,然后单击"创建新比较"按钮(在"比较"面板中)。
   1. 如果需要对 MST 进行可视化表示,则通过使用"组"面板中提供的各种选项,将样本分配到彩色组(例如,根据特定元数据特征)。
      注:在以下步骤之后,还可以追溯创建/更改组。
   2. 选择高级群集分析...和MST 作为分类数据,以基于所选样本生成 MST 关系图。
   3. 进一步修改 MST 作为首选的可视化表示(例如,通过添加分区参数、节点/分支标记、交叉链接、图例等)。参见图3中的示例。
      注:群集(克隆复合)分区阈值为 +4/10 非相同 VNTR 位点,除了隐藏表示 >5/10 非相同 VNTR 位点的分支连接外,以前还用于基于生成的 MLVA 数据的 MST 群集分析使用^该协议14。如果导入了上述 484 Y. ruckeri MLVA 配置文件的数据集,这些样本也可以包含在 MST 群集分析中(如上所述),以提供全局和历史背景。例如,这将便于识别与先前描述的克隆复合物相关的任何样本,以及表示尚未描述的谱系的样本。根据可用的元数据,可以以不同的方式检查生成的 MST 图表,例如,发现与特定特征(地理、主机、时间等)相关联的最终聚类模式。
   4. 如果需要,请使用导出图像选择以所需的格式导出最终完成 MST。

Results

在图1中描述的多路PCR之后,一个典型的GE图像验证了每个PCR反应中是否存在多个放大素。对已验证的PCR产品执行的下游CE片段分析,对于每个被检查的Y.ruckeri分离物,将导致两个用于大小调用相应VNTR位点的电录文件(图2)。从对484种不同Y.ruckeri分离物的分析中,在相同多路反应中标有相同染料的VNTR位点之间,在放大素大小范围内没有观察到重叠(表1)14。因此,每个电泳峰都可以用颜色明确识别。

在将 MLVA 配置文件和相关元数据导入首选软件后,可以按照描述构建 MST 图表,以便对材料中任何流行病学兴趣模式进行审查。有关相应软件中提供的其他选项,请参阅相应的手册。例如,图3显示了 MST 对Y. ruckeri的 MLVA 配置文件的比较,从挪威五个不同鲑鱼养殖场的鱼类中分离。

根据本方案14,10个VNTR位点的一致重复大小,以及其体外和体内稳定性,先前已在原始研究中得到验证。简单地说,这是使用Sanger测序(重复大小),并通过MLVA键入多个分离后串行通道(体外)和从个别疾病爆发(体内)的MLVA类型。此外,通过键入多年来从持续受感染的大西洋鲑鱼淡水生产点回收的多个"室内菌株"分离物,对该位点的环境稳定性进行了检查。

图 1:凝胶电泳验证是否存在多个PCR产品。该图确认所有12条含有样本的通道中存在多个PCR放大器,第一条通道代表使用的DNA阶梯。已指明所选梯形碎片的大小,以及每个车道的 PCR 测定和应变(参见 Gulla 等人 2018¹⁴中的表 S1)的隶属关系。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:电图显示对应于VNTR放大膜的峰值。指示不同 VNTR 位点的名称,并带有染料标签(VIC = 绿色;NED = 黑色;6FAM = 蓝色)在括号中。两个电表图(PCR测定1顶部;PCR 测定 2 底部) 源自单个Y. ruckeri分离物的键入。橙色峰(染料利兹)表示采用的大小标准。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:用于流行病学评估的最小生成树示例。该图基于从Y.ruckeri分离从大西洋鲑鱼中回收的MLVA配置文件,这些鲑鱼在五个不同的挪威养殖场(1-5;见传说)中反复发生叶氏菌病爆发。可以观察到与农场原点相关的明显的聚类趋势。交叉链接显示涉及 #1/10 非相同 VNTR 位点的所有可能连接(参见图例)。请点击此处查看此图的较大版本。

图 4: 电象图可视化口吃和分裂峰。在这种情况下,两者都同时发生,但情况并非总是如此。代表YR1070 VNTR位点的更长和更高的峰可以很容易区分。显示屏被放大,只显示蓝色染料峰值。请点击此处查看此图的较大版本。

表1:VNTR 位点特性。本MLVA协议中针对的10个Y.ruckeri VNTR区域的相关特征。

Discussion

这里介绍的两种多路多路PCR在模板DNA质量差的情况下显得相对稳健,但在使用DNA浓度极高的模板时,偶尔也会观察到PCR扩增的缺乏。这些问题通过在 PCR 之前稀释模板而很容易解决。也可以使用除此处采用的DNA提取方法外的其他脱氧核糖核酸(DNA提取方法),例如商业试剂盒。

尽管每个多倍 PCR 反应预期有 5 个倍数,但不应始终期望 GE 提供五个视觉可区分的频段,因为相同反应中的一些(不同标记的)VNTR 位点具有重叠的大小范围。如果需要,最终 PCR 延长时间可能会缩短 60 分钟,但可能导致后续 CE 电表中分裂峰的发生增加(见下文)。值得注意的是,由于 GE 步骤的目的纯粹是 PCR 放大器的定性验证,因此运行时间、电压和/或凝胶配方可以作为首选调整。如果 GE 观察到特别弱的带,则建议在 CE 之前降低这些样品的稀释系数。

虽然此处描述的 CE 协议运行在特定的商业毛细管电泳装置上(参见材料表),但不同的 CE 系统可能具有不同的样本要求,这反过来又会提示对协议进行一些修改.有关相应试剂/设备、校准等的说明,请参阅相应 CE 系统制造商的手册,以便进行片段分析。也有可能,在CE期间观察到的偏置放大子移动模式在CE系统和/或机器之间可能相对不同,正如之前在其他MLVA协议15、16中已经记载的那样。如果发生最终(四舍五入)VNTR重复计数受到影响的程度,这意味着用于确定VNTR重复计数的点点特定变量s和i(表1),必须重新校准。 这涉及到在比较精确序列大小和CE大小调用的绘图上的线性回归,如Gulla等人2018¹⁴所述。

在尺寸调用期间,可在电图中观察到分裂峰和口吃峰,这两种基于 CE 的 MLVA 类型¹⁷中都有著名的人工制品。图4。虽然应忽略口吃峰,但在拆分峰值由单个基对分隔的情况下,应始终为下游应用选择较长的峰值。此外,表示缺少特定 VNTR 位点的缺失峰值很少见,但可能发生,在这种情况下,应分配重复计数"0"。如果提取DNA的起始培养物不纯(即包含多个Y. ruckeri子类型),则 CE 之后可以观察到多个对应于同一位点/位点的多个高峰。然后,必须在新的DNA提取之前从单个菌落进行二次培养,以便重新键入。

如协议所述,PCR的模板DNA默认情况下应从Y.ruckeri的纯培养物中提取。然而,在少数情况下,通过qPCR(Ct值<27)对Y.ruckeri检测呈阳性的卵液样品,在未事先培养的情况下,使用增加的基因组DNA(用商业试剂盒提取)作为模板,成功地直接进行了MLVA类型化。虽然这种方法没有经过广泛的测试或验证,但它确实表明这种MLVA测定的潜力,检查复杂的生物基质含有从一系列不同的生物体,除了Y.ruckeri的DNA。

这里介绍的整个MLVA打字程序,从DNA提取到动物动物学评估,可以在一个工作日内完成。然而,所检查的样本数量与DNA提取、PCR和CE所需的时间处于子线性关系,因此,当同时运行多个样本时,该方法的效率要高得多。然而,对于大多数基于实验室的方法来说,这是情况,并且作为Y.ruckeri的流行病学子分型工具,高分辨率、简单性和可移植性的结合使得这种MLVA测定优于先前公布的^{协议4 , 5}.它也被用来验证Y.ruckeri血清14的有限流行病学相关性。

通过基于MLVA的综合种群研究,涉及从一系列时空起源和栖息地(宿主鱼类、环境等)中回收的484个Y.ruckeri分离物,我们对动物的表皮和种群的理解这种重要的鱼类病原体的结构大幅增加14。MLVA打字能够追踪几十年来人类传播的克隆,大概是通过运输鱼类,以及鉴定当地有限的菌株。此外,虽然细菌的某些克隆复合物显然可能与疾病,特别是鱼类宿主(虹鳟鱼和大西洋鲑鱼,分别)有关,但其他仅从环境来源和/或临床上未受影响的鱼类中恢复标本。因此,该方法的适用性不仅仅限于感染追踪,因为它还可能提供具有潜在相关性的信息,例如疫苗开发、风险评估和维护国家生物安全。它目前正积极在挪威兽医研究所使用,作为调查挪威水产养殖中Y.ruckeri诊断的工具。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 度C/15°C 培养箱	首选。
5' 标记引物、10K PMOL、脱盐、干燥Thermo	Fisher Scientific	450007	序列和标记见表 1。在 TE 缓冲液中准备工作等分试样。
琼脂糖，通用型，peqGOLD	VWR	732-2789P/732-2788	用于凝胶电泳。
Avant 3500xL 基因分析仪	Thermo Fisher Scientific	A30469	用于毛细管电泳片段分析。
BioNumerics7 模块	应用数学	NA	用于从 MLVA 数据生成最小生成树。
离心	首选。
定制 DNA 寡核苷酸，25N，脱盐，干燥的	Thermo Fisher Scientific	A15612	序列见表 1。在 TE 缓冲液中准备工作等分试样。
DNA 凝胶上样染料 （6X）	Thermo Fisher Scientific	R0611	凝胶电泳中使用的上样染料。
Eppendorf Safe-Lock Tubes， 1.5 mL	Eppendorf	30120086	DNA 提取过程中使用的离心管。
冷冻室	首选。
通风柜	首选。
Gel 电泳系统	首选。
GelRed 核酸染色剂，10,000X 水溶液	Biotium	41003	凝胶电泳中使用的荧光核酸染料。
GeneMapper 软件 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	用于从毛细管电泳中读取电泳图。
GeneRuler 50 bp DNA 分子量标准，即用	Thermo Fisher Scientific	SM0373	DNA 分子量标准，用于凝胶电泳。
GeneScan 600 LIZ 染料大小标准品 v2.0	细管电泳中使用的	Thermo Fisher Scientific	4408399
加热块	首选。
Hi-Di 甲酰胺	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	细管电泳中使用的去离子甲酰胺。准备工作等分试样。
Milli-Q water	NA	NA	和毛细管电泳过程中使用的纯化水。标准配方;内部生产。
多重 PCR 加号 Kit	Qiagen	206151/206152
PCR 热循环仪	首选。
用于 3500 dx/3500xL Dx 基因分析仪的 NA POP-7 聚合物	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	细管电泳中使用的分离基质。
纯培养物 Yersinia ruckeri	NA	NA 例如	，冷冻保存或新鲜。
不含 RNase 的水	Qiagen	NA	In：多重 PCR 加号 Kit
Tris-硼酸盐-EDTA （TBE）  缓冲液	NA	NA	标准配方;内部生产。
胰蛋白酶大豆琼脂/牛血琼脂	NA	NA	标准配方;内部生产。
基于紫外线的凝胶成像/可视化系统	首选。
Vortexer	首选。	那