Method Article

全细胞膜片电生理方法对突触倍数的评价

DOI:

10.3791/59461

⸱

April 23rd, 2019

 , 
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里, 我们提出了一个评估功能突触多样性的方案, 使用全细胞膜片夹具电生理学在急性脑片。

Abstract

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在中枢神经系统中, 一对神经元通常形成多个突触触点和/或功能神经递质释放位点 (突触多样性)。突触多样性是可塑性的, 在整个发育过程中和不同的生理条件下都会发生变化, 是突触传递效果的重要决定因素。在这里, 我们概述了实验, 以估计多度突触终止到特定的突触后神经元使用全细胞膜片钳电生理学在急性脑片。具体而言, 电压夹具记录用于比较自发兴奋突触后电流 (sEPSCs) 和微型兴奋突触后电流 (mEPSCs) 的振幅之间的差异。这种方法背后的理论是, 由于在每个突触接触中发生的同步释放, 表现出多样性的传入输入将显示出巨大的、作用潜力相关的 sEPSCs。相反, 与动作电位无关的释放 (异步) 将产生较小的振幅 mEPSCs。本文概述了一组实验和分析, 以表征突触多样性的存在, 并讨论了该技术的要求和局限性。这项技术可用于研究不同的行为、药理或环境干预如何影响不同大脑区域突触的组织。

Introduction

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突触传递是神经元之间沟通的基本机制, 因此也是大脑功能的基本机制。突触传输也是不稳定的, 可以改变其疗效在活动依赖的方式, 以及在对模块信号1的反应.因此, 检查突触功能一直是神经科学研究的重点。全细胞膜片钳电生理学是一种多功能的技术, 使我们能够了解, 通过设计实验设计和数据分析, 深入的生物物理和分子机制的突触传输。一个常用的方法, 也许是由于简单的技术和概念, 是测量微型兴奋器-抑制后电流 (me/ipsc) 下的电压夹配置 2,3,4 个,5,6. 单个 Mpsc 代表离子通过突触后电离受体 (如 AMPA 和 gaba a 受体) 的流动, 以响应从突触端子释放的各自神经递质的结合7.因为记录是在电压门控 na+通道阻滞剂河豚毒素 (ttx) 的存在下获得的, 所以释放是与作用电位无关的, 通常涉及一个包含神经递质的单突状囊泡。基于这一假设, Mpsc 的平均振幅被广泛用作量子大小的粗略估计, 它表示相对于单个释放位点的突触后受体的数量和功能。另一方面, Mps....

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Protocol

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所有动物实验均由西安大略大学动物护理委员会根据加拿大动物护理理事会指南 (AUP#2014-031) 批准。

1. 解决方案

  1. 切片解决方案
    1. 有关切片解决方案的组成, 请参阅表 1 。
    2. 提前准备20x 库存解决方案, 并将其存放在 4°c, 最长1个月。
    3. 对于1x 切片液, 在 Ddh2o中溶解 NaHCO 3、葡萄糖和蔗糖,并添加20x 库存。确保渗透度在315-320 平方米之间, 并在4°c 下将溶液存储不超过1周。
    4. 用100毫升的切片溶液填充两个烧杯, 并用副体覆盖它们。将溶液冷却在冰柜中, 直到溶液部分冻结 (在-80°c 的冰柜中大约 20分钟)。使用气体分散管, 用 95% O2/5% co2 在冰上泡上 95%o2/5% co 2的切片溶液的两个烧杯20分钟。
溶液浓度 (mM)

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Results

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上述协议描述了一种使用全细胞膜片钳电生理学的方法, 以小鼠下丘脑神经元为例, 检查突触多样性的程度。这种切片制备技术应产生健康的活细胞, 没有肿胀的膜或细胞核 (图 1)。协议中的每一步都对组织的健康和录音质量很重要。

figure-results-1
图 1: 切片制备后的健康和不健康组织.在40x 放大倍率下, 在差分干涉对比度光学作用下对 PVN 进行切片电生理制备。红色箭头表示健康的细胞, 黑色箭头表示不正常的细胞。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

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一个成功的膜片钳电生理学实验的一个重要要求是获得健康的切片细胞。我们描述的协议针对含有 PVN 神经元的下丘脑切片进行了优化。其他大脑区域可能需要修改溶液和切片方法21,22, 23,24.对于录音来说, 只有通过不断监测电池特性 (如膜电阻、电容和访问电阻), 才能接受稳定的记录是至关重要的。访问电阻的增加会降低 EPSC 振幅, 从而混淆振幅测量。因此, 访问电阻值超过 20 MΩ或在记录过程中增加20% 以上的电池将被丢弃。同样, 膜电阻的降低 (或较低) 可能会导致空间夹具不足, 因此会降低振幅。我们目标系统中的神经元 (parvocellular PVN 神经元) 具有 500 MΩ和 1 GΩ之间的高膜电阻, 我们丢弃膜电阻低于 500 MΩ的细胞。应针对正在研究的特定类型的神经元建立质量控制截断。由于该协议依赖于药物应用前后振幅的差异, 因此必须确保振幅的变化是由于药物.......

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Disclosures

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作者们没有什么可以透露的

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J. s. 获得安大略省研究生奖学金。我们收到了加拿大心理健康研究机构的新调查团契。这项工作得到加拿大自然科学和工程研究理事会 (06106-2015 RGPIN) 和加拿大卫生研究所 (PJT 148707) 向 wi 提供的业务赠款的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL 注射器BD309659
10 刀片Fisher Scientific /其他35698
22 刀片VWR/其他21909-626
22 μM 针式过滤器Milipore09-719-000
Adson foreceps哈佛仪器72-8547
斜角尖剪刀哈佛仪器72-8437
ClampexMolecular DevicespClamp 10
双刃刀片VWR74-0002
滤纸Sigma/其他1001090
细画笔Fisher /各种15-183-35 /各种
气体分散管VWRLG-8680-120
异氟烷Fresenius Kabi/其他M60303
Krazy 胶水各种
迷你分析SynaptosoftMiniAnalysis 6
OsmomoterWescor Inc型号 5600
石蜡膜SigmaPM-996
巴斯德移液器VWR14672-200
ph 计梅特勒-托利多FE20-ATC
橡胶球VWR82024-550
手术刀手柄 3 号哈佛仪器72-8350
手术刀手柄 4 号哈佛仪器72-8356
单刃刀片VWR55411-050
振动切片机徕卡VT1200S
净水系统MilliporeMilli-Q 学术 A10
孔板盖费舍尔/各种07-201-590/各种
<强>化学品/试剂
4-APSigma275875
BAPTA分子探针B1204
CaCl2*2H2OSigmaC7902
CdCl2sigma202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
葡萄糖SigmaG5767
HEPESSigmaH3375
K2-ATPSigmaA8937
KClSigmaP9333
K-葡萄糖酸盐SigmaG4500
MgCl2*6H2OSigmaM2670
分子生物学级水SigmaW4502-1L
Na3GTPSigmaG8877
NaClBioshopSOD001.1
葡萄糖酸钠SigmaS2054
NaH2PO4Sigma71504
NaHCO3SigmaS6014
印交酚毒素sigmaP1675
SrClSigma255521
蔗糖BioshopSUC507.1
河豚毒素Alamone LabsT-550
yDGGTocris6729-55-1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).

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Synaptic MultiplicityWhole cell Patch clampSpontaneous EPSCsMiniature EPSCsAction Potential dependent ReleaseTTX Cadmium BlockadeStrontium ACSF ApplicationGamma DGG Antagonist TestAfferent Stimulation ProtocolAccess Resistance Monitoring

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