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使用全细胞膜片钳电生理技术评估突触多重性

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DOI：

10.3791/59461

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2019年4月23日

 , 
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用急性脑切片进行全细胞膜片钳电生理记录来评估功能性突触多样性的实验方案。

摘要

在中枢神经系统中，一对神经元通常会形成 多个突触接触点和/或功能性神经递质释放位点（突触多重性）。突触多重性具有可塑性，在发育过程及不同生理条件下会发生变化，是突触传递效能的重要决定因素。本文概述了在急性脑片中利用全细胞膜片钳电生理技术，估算终止于特定突触后神经元的突触多重性程度的实验方法。具体而言，采用电压钳记录来比较自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）与微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）的幅度差异。该方法的理论依据是：具有多重性的传入输入由于在每个突触接触点发生同步释放，会产生较大的、依赖动作电位的sEPSCs；而独立于动作电位的释放（即非同步释放）则产生幅度较小的mEPSCs。本文介绍了一套用于表征突触多重性存在的实验与分析流程，并讨论了该技术的应用要求与局限性。该技术可用于研究体内不同行为、药理或环境干预如何影响大脑不同区域突触接触的组织结构。

引言

突触传递是神经元之间通信的基本机制，因此也是大脑功能的基础。突触传递具有可塑性，其效能可依赖于神经活动模式发生变化，也可响应调节性信号而改变1。因此，研究 突触功能一直是神经科学研究的核心课题。全细胞膜片钳电生理技术是一种多功能的方法，通过设计实验方案和数据分析，能够深入揭示突触传递的生物物理和分子机制。一种常用的方法可能是由于其技术与概念的简便性，即在电压钳制模式下测量微型兴奋性/抑制性突触后电流（mE/IPSCs）2,3,4,5,6。单个mPSC代表了突触后离子型受体（例如AMPA受体和GABAA受体）在结合来自突触前末梢释放的相应神经递质后所引发的离子流动7。由于记录是在存在电压门控Na+通道阻断剂河豚毒素（TTX）的条件下进行的，因此神经递质的释放不依赖于动作电位，通常仅涉及一个含有神经递质的突触小泡。基于这一假设，mPSC的平均幅度被广泛用作量子大小的粗略估计，该参数反映了单个释放位点相对应的突触后受体的数量和功能状态。另一方面，mPSC的频率被认为代表了终止于突触后细胞上的突触总数与其平均释放概率的综合体现。然而，这些参数并未测量另一个重要变量——突触的多重性，即突触多重度——这对突触传递的效能至关重要。

根据突触传递的量子理论7,8,9，一对神经元之间特定连接的强度取决于三个因素：功能性突触的数量（N）、单个突触囊泡释放所引起的突触后反应（量子大小；Q）以及神经递质释放的概率（Pr）。突触多重性等同于 N。在发育过程以及不同疾病状态下，突触多重性的形成或多重性突触的修剪均具有可塑性3,4,6,10。因此，对突触多重性的表征对于理解健康与疾病状态下突触传递的效能具有重要意义。电子显微镜等技术可通过检测来自同一轴突在同一突触后神经元上形成的多个突触接触，从而识别突触多重性的结构证据11,12,13,14。然而，这些在结构上识别出的多突触可能在功能上是沉默的15,16。对 N 进行精确的功能性检测需要技术上具有挑战性的电生理方法，例如成对全细胞记录，可用于判断特定连接是否具有多个功能性释放位点，以及最小刺激法，旨在激活单个假定的轴突。

在本实验方案中，我们介绍了一种通过采用Hsia等人最初建立的方法来估算突触多重性（synaptic multiplicity）的简便方法2。该技术利用全细胞膜片钳电生理记录自发性突触后电流（sPSCs）和微型突触后电流（mPSCs），从而估算出投射到特定神经元上的所有输入突触的突触多重性程度。  如前所定义，突触多重性反映的是特定突触前与突触后神经元之间形成的突触数量。当一个动作电位同步激活多个突触时，各个（即量子化的）突触后电流将具有较高的时间总和概率，从而产生更大振幅的突触后电流。  在mPSC记录中（通过TTX阻断动作电位），各个独立的（非同步）mPSC发生时间总和的概率较低。基于这一原理，可通过比较sPSC振幅（依赖动作电位的递质释放）与mPSC振幅来估算突触多重性。

为检验突触多重性（multiplicity）的存在，本文以谷氨酸能兴奋性突触后电流（EPSCs）为例，描述四项实验及其分析方法。然而，相同的方法亦可用于快速GABA能/甘氨酸能突触传递（IPSCs）的研究。以下简要说明每项实验的原理。首先，如上所述，可通过比较自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）与微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）的幅度来估算突触多重性。该方法需满足两个条件：1）记录期间，突触前轴突必须产生足够数量的动作电位；2）释放概率（P）r 必须足够高，以便在动作电位到达时多个突触能够释放神经递质。为了满足这些要求，首先在低 Ca2+ 人工脑脊液（aCSF），然后在低浓度 K 存在下进行记录+ 通道拮抗剂，4-氨基吡啶（4-AP），以增加动作电位发放和Pr。随后用TTX阻断动作电位发放，并通过电压门控Ca2+ 通道阻滞剂 Cd2+. 将sEPSCs（含4AP）的振幅与mEPSC（含4AP、TTX和Cd）的振幅进行比较2+）。在第二次实验中，Ca2+ 被等摩尔的 Sr 取代2+ 在aCSF中以去同步化囊泡释放。随着Ca2+ 对于囊泡的同步释放是必需的，用 Sr 替代2+ 应消除振幅较大的sEPSCs，因其提示存在多重性。第三，从机制上看，多重性可源于同一突触后神经元上的多个突触接触，或源于多囊泡释放（即单个突触接触内释放多个囊泡）。17,18为了区分这两种类型的多重性，第三个实验使用了一种低亲和力、快速解离的AMPA受体竞争性拮抗剂γ-D-谷氨酰甘氨酸（γ-DGG）。17,18 确定大sEPSC是源于独立突触的时间总和，还是多囊泡释放作用于重叠的突触后受体群体所致。如果大振幅事件源于多囊泡释放，则γ-DGG对较大sEPSC的抑制作用将弱于对较小sEPSC的抑制；而如果大sEPSC是由多个突触连接的时间总和产生，则γ-DGG对其影响将与对小sEPSC的影响相似。在第四项实验中，采用一种更具生理性的方法来增强动作电位发放，即传入性突触刺激。突触活动的簇发可短暂增加/易化受刺激传入纤维的自发动作电位发放及其释放概率。因此，该方法可使多重性以更符合生理条件的方式表现出来。

以下方案描述了在小鼠下丘脑组织中进行这些实验的方法。具体而言，使用下丘脑室旁核（PVN）的促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）神经元。我们介绍了进行全细胞膜片钳电生理记录的操作步骤，并详细说明了用于检测突触多重性的特定实验方法。

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方案

所有动物实验均经加拿大安大略省西部大学动物护理委员会根据加拿大动物护理委员会指南批准（AUP#2014-031）。

1. 溶液

  1. 切片溶液
    1. 切片溶液的成分见表1。
    2. 提前配制20倍浓缩液，4 °C保存，可保存不超过1个月。
    3. 配制1倍切片溶液时，将NaHCO3、葡萄糖和蔗糖溶解于ddH2O中，再加入20倍浓缩液。确保溶液渗透压在315–320 mOsm之间，4 °C保存时间不超过1周。
    4. 取两个烧杯，各加入100 mL切片溶液，用封口膜封口。将溶液置于-80 °C超低温冰箱中冷却至部分结冰（约20分钟）。在冰上用气体分散管向两个烧杯中的切片溶液通入95% O2/5% CO2混合气体20分钟。
溶液浓度（mM）
切片正常 aCSF低 Ca2+ aCSFSr+ aCSF移液管/内液
NaCl87126126126-
KCl2.52.52.52.58
CaCl20.52.50.5--
SrCl2---2.5-
MgCl271.52.51.52
NaH2PO41.251.251.251.25-
NaHCO325262626-
葡萄糖25101010-
蔗糖75----
K-gluconate----116
Na-gluconate----12
HEPES----10
K2-EGTA----1
K2ATP----4
Na3GTP----0.3

表1：各种溶液的组成。

  1. aCSF（用于脑片恢复与维持）
    1. 参考 表1 用于aCSF的配制。
    2. 提前配制20倍浓度的储存液，4 °C保存，可使用1个月内。
    3. 对于1x aCSF，将NaHCO₃溶解于3 和 ddH₂O 中的葡萄糖2O，并加入20倍浓缩储备液。确保渗透压在298–300 mOsm之间。溶液需在1天内使用完毕。
  2. aCSF（低 Ca）2+ 用于记录
    1. 参考 表1 低钙成分2+ aCSF
    2. 提前配制20倍浓缩贮存液，4 °C保存，可使用1个月内。
    3. 对于1x低钙2+ aCSF，溶解 NaHCO₃3 以及葡萄糖溶于ddH2O中，加入20x（CaCl2 和 MgCl2 无）储备液，CaCl2 和 MgCl2 调整至指定浓度。确保渗透压在298-300之间。溶液需在1天内使用完毕。
  3. aCSF (Sr2+ 用于记录
    1. 参考 表1 用于Sr的组成2+ aCSF
    2. 提前配制20倍浓缩贮存液，4 °C保存，可使用1个月内。
    3. 对于1x Sr2+ aCSF，溶解 NaHCO₃3 和 ddH₂O 中的葡萄糖2O，并加入20倍体积的（CaCl2 和 MgCl2 无）储备液，SrCl2 和 MgCl2 调整至指定浓度，确保渗透压在298-300之间。溶液需在1天内使用完毕。
  4. 内液
    1. 参见 表1 用于K-葡萄糖酸盐为基础的内液配制。
    2. 配制20 mL内液，先将15 mL分子生物学级水加入50 mL离心管中。后续步骤均在冰上操作。
    3. 提前配制以下溶液，用分子生物学级水配成 1 M 的母液。加入（单位：mL）：2.32 K-葡萄糖酸盐，0.24 Na-葡萄糖酸盐，0.20 HEPES，0.16 KCl，0.05 K₂-EGTA，0.04 MgCl₂2 加入50 mL离心管中。
    4. 加入 100 µL 的 0.3 M Na3GTP
    5. 称取 44.08 mg 的 K2在2 mL 微离心管中加入ATP，再加入1 mL分子生物学级水，然后转移至50 mL管中。
    6. 用 1 M KOH 调节 pH 至 7.2–7.4。确保渗透压在 283–289 mOsm 之间。

2. 切片制备

  1. 准备工具
    1. 向恢复室（由一个带有4个孔和网状结构的250 mL烧杯制成）中加入200 mL aCSF，并将恢复室置于35 °C水浴中。
    2. 用石蜡膜覆盖容器，并使用玻璃分散管持续向aCSF中通入95% O2/5% CO2，至少20分钟。
    3. 准备好解剖工具（手术刀、弯头精细剪刀、镊子、细毛刷、塑料小勺），以进行解剖操作。
    4. 用60 mL注射器从步骤1.1.4中取出约15 mL冰冻切片液。
    5. 在培养板盖上放置滤纸，制备解剖平台。
    6. 将切片室放入冰盒中，并在冰盒内加满冰，以准备切片室。
    7. 将一次性刀片固定在振动切片机的刀片夹持器中，设置好振动切片机。
    8. 通过折断巴斯德移液管的尖端并在断裂端套上橡胶吸头，制作一个转移移液管。
  2. 解剖小鼠脑组织
    1. 将动物置于充满4%异氟烷的麻醉室中，直至脊髓反射消失。
    2. 使用断头器对动物进行断头处理，并迅速取出脑组织。
      1. 使用22号手术刀片从头侧至尾侧沿中线做切口。
      2. 将头部两侧的头皮向侧方剥离。
      3. 使用精细剪刀从尾侧向头侧（包括额骨侧面）剪开一侧颅骨，注意避免损伤脑组织。
      4. 用镊子抬起颅骨碎片，并使用步骤2.1.4中的注射器迅速用15 mL冰冻切片液冷却脑组织。
      5. 将脑组织从颅骨中取出。
      6. 将脑组织放入盛有冰冻切片液（来自步骤1.1.4）并持续通入95% O2/5% CO2的烧杯之一中。
  3. 制备小鼠下丘脑切片
    1. 根据目标脑区和所需切角对脑组织进行修块（例如，制备冠状面下丘脑切片时，使用刀片切除视交叉前方和脑桥后方的组织，并确保尾侧脑块的切面与脑底垂直且平整）。
    2. 使用一小块滤纸从脑组织前侧将其拾起，并用瞬干胶将后侧粘附到固定板上。
    3. 迅速将固定板放入切片室，并用步骤1.1.4中第二个烧杯的切片液填充切片室。
    4. 将切片室和冰盒固定在振动切片机上。
    5. 定义切片区域（脑组织的前部和后部），开始切取厚度为250 µm的冠状切片。推荐参数：速度0.10 mm/s，振幅2 mm。
    6. 将切片修剪至目标脑区所需的适当大小。
    7. 在35 °C条件下恢复切片30–45分钟。随后将恢复室从温浴中取出，使切片在室温下继续恢复30分钟。当天其余时间将切片保持在室温，并持续向浴液中通入95% O2/5% CO2。

3. 全细胞膜片钳记录

  1. 拉制膜片电极
    1. 根据膜片钳电极拉制仪手册中建议的全细胞记录参数，使用厚壁玻璃管拉制膜片电极，使其电阻达到 3–5 MΩ。
    2. 使用微量注射器（商用或自制）将过滤后的细胞内液注入电极尖端。制作微量注射器的方法：将 1 mL 注射器的尖端烧熔，使其自然下坠形成细长的尖端。
  2. 获得全细胞记录构型
    1. 将记录电极置于脑片上方，在电压钳模式下调整电极电流。向电极施加轻微正压，并锁定旋塞阀。
    2. 选择膜结构完整、状态良好的细胞，用电极接近该细胞。正压应引起组织轻微扰动（例如，进入组织时产生缓慢的波动）。
    3. 继续以对角线方式缓慢将电极向细胞靠近，直至电极在细胞表面形成微小凹陷。
    4. 释放正压锁定。细胞将开始形成封接，电阻升至 1 GΩ 以上。在电压钳模式下，将细胞钳制在 -68 mV。
    5. 沿对角线方向轻微将电极从细胞上拉开，以释放细胞上的多余压力。
    6. 补偿电极的快速和慢速电容。
    7. 通过连接电极夹持器的管路短暂施加吸力，击穿细胞膜，获得全细胞记录构型。
    8. 在电生理数据采集与分析软件（例如 Clampex）的膜测试窗口中切换至 Cell 模式。
    9. 每次电压钳记录前，使用相同软件进行膜测试，并在实验记录本中记录相关参数（膜电阻、接入电阻和电容）。
    10. 后续实验中，维持记录浴槽温度在 27–30 °C，灌流速度保持在 1.5–2.0 mL/min。

4. 多重性实验

  1. 实验1：利用4-AP估计多重性
    1. 在电压钳制下，将细胞钳制在 -68 mV。使用相同软件，在用低钙人工脑脊液灌流浴槽的同时记录自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）。2+ aCSF。形成全细胞记录模式后，至少记录5分钟，以确保获得稳定的基线记录，因为在膜破裂后短时间内突触活动可能较强。
    2. 使用微量移液器将4-AP加入aCSF中，以30 µM 4-AP进行灌流给药。记录至少10分钟的sEPSCs，以获得药物的完全效应。
    3. 加入 0.5 µM TTX 和 10 µM Cd2+ 向aCSF中加入4-AP并记录mEPSCs至少10分钟。
    4. 用于离线分析时，采用施加4-AP（在低Ca²⁺人工脑脊液中）前即刻的最后1分钟基线数据2+ aCSF）、4-AP 给药第 10 分钟和 TTX 给药第 10 分钟。
  2. 实验2：使用Sr去同步化囊泡释放2+
    1. 在用正常 Ca2+ 使用与灌流aCSF相同的aCSF记录sEPSCs至少5分钟。
    2. 从正常 Ca 切换2+ aCSF 并开始灌注 Sr2+ aCSF（来自步骤1.4）并记录sEPSCs。
    3. 对于离线分析，为确定大振幅sEPSCs是否源于囊泡的同步释放，需比较正常aCSF中基线期最后1分钟与给药后10分钟内的事件频率和波形特征。th Sr的分钟2+ aCSF 应用
  3. 实验3：利用多囊泡释放检测 γ-DGG
    1. 在低钙条件下2+ 使用 aCSF 记录 sEPSCs 至少 5 分钟。
    2. 通过灌流系统向aCSF中加入30 µM 4-AP，记录sEPSCs至少10分钟。
    3. 在含4-AP的aCSF中加入200 µM γ-DGG，并记录sEPSCs至少10分钟。
    4. 作为对照实验，在另一个细胞中执行步骤1-3，但使用低浓度（125 nM）的DNQX代替γ-DGG。
    5. 用于离线分析时，分析每次药物应用的最后1分钟。
  4. 实验4：刺激传入输入以增加动作电位发放
    1. 在正常 Ca 条件下记录 sEPSCs2+ aCSF
    2. 使用充满人工脑脊液（aCSF）的单极玻璃电极，以20 Hz的频率刺激传入纤维2秒，重复10次，每次刺激间隔为20秒。
    3. 分析时，以首个刺激前5,000毫秒作为基线，与末次刺激后10至300毫秒的信号进行比较，然后计算10次试验的平均振幅和频率变化。

5. 分析

  1. 使用能够检测和分析突触电流的程序（例如 Mini Analysis 软件）分析 sEPSCs 和 mEPSCs。
    1. 在该软件中，使用推荐的检测参数来识别 AMPA 受体介导的 EPSCs（如果记录的是抑制性电流，则使用 GABA 受体介导的 EPSCs 的参数）。
    2. 使用 Nonstop Analysis 功能 在记录中检测 EPSCs。
    3. 手动浏览每段记录，确保程序准确识别每个事件（例如，确保没有遗漏事件或重复计数）。
    4. 通过将事件数据复制到剪贴板，导出数据并粘贴至数据管理软件（例如 Excel）中。
    5. 计算每种药物处理条件下的平均频率和/或幅度，并进行相应的统计分析。

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结果

上述方案描述了一种利用全细胞膜片钳电生理技术检测突触多重性的方法，并以小鼠下丘脑神经元为例进行说明。该脑片制备技术应获得健康且具有活性的细胞，细胞膜或细胞核无肿胀现象（图1）。方案中的每一步骤对于组织的健康状态和记录质量均至关重要。

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图1：切片制备后健康与不健康组织的形态。 在40倍放大倍率下，使用微分干涉相差光学显微镜观察视上核（PVN）脑片电生理制备样本。红色箭头指示健康细胞，黑色箭头指示不健康细胞。请点击此处查看该图的高清版本。

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讨论

成功进行膜片钳电生理实验的一个重要前提是获得健康的脑片或细胞。本文所述方案已针对包含视上核（PVN）神经元的下丘脑脑片进行了优化。其他脑区可能需要调整溶液成分和切片方法21,22,23,24。在记录过程中，必须持续监测细胞特性（如膜电阻、电容和串联电阻），仅接受稳定的记录。串联电阻升高会降低兴奋性突触后电流（EPSC）的幅度，从而干扰幅度测量结果。因此，若细胞的串联电阻超过 20 MΩ 或在记录期间上升超过 20%，则予以剔除。同样，膜电阻降低（或本身较低）可能导致空间钳制不良，从而降低电流幅度。本研究的目标细胞（小细胞型 PVN 神经元）具有较高的膜电阻，通常介于 500 MΩ 至 1 GΩ 之间，若膜电阻低于 500 MΩ，则不予采用。应针对所研究的具体神经元类型建立相应的质量控制标准。由于本实验方案依赖于给药前后电流幅度的变化，因此必须确保幅度变化是由药物作用引起，而非膜电阻或...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

J.S. 获得了安大略省研究生奖学金。W.I. 获得了加拿大心理健康研究会新研究者奖学金。本研究工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（06106-2015 RGPIN）和加拿大健康研究院（PJT 148707）的运营基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器BD309659
10 号刀片Fisher Scientific/其他35698
22 号刀片VWR/其他21909-626
22 μM 滤膜针头过滤器Millipore09-719-000
Adson 镊子Harvard Instruments72-8547
斜口剪刀Harvard Instruments72-8437
ClampexMolecular DevicespClamp 10
双刃刀片VWR74-0002
滤纸Sigma/其他1001090
细毛刷Fisher/各种15-183-35/各种
气体分散管VWRLG-8680-120
异氟烷Fresenius Kabi/其他M60303
Krazy 胶水各种各种
Mini analysisSynaptosoftMiniAnalysis 6
渗透压仪Wescor IncModel 5600
Parafilm 封口膜SigmaPM-996
巴斯德移液管VWR14672-200
pH 计Mettler ToledoFE20-ATC
橡胶吸头VWR82024-550
3 号手术刀柄Harvard Instruments72-8350
4 号手术刀柄Harvard Instruments72-8356
单刃刀片VWR55411-050
振动切片机LeicaVT1200S
纯水净化系统MilliporeMilli-Q Academic A10
培养板盖Fisher/各种07-201-590/各种
化学药品/试剂
4-APSigma275875
BAPTAmolecular probesB1204
CaCl2·2H2OSigmaC7902
CdCl2sigma202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
葡萄糖SigmaG5767
HEPESSigmaH3375
K2-ATPSigmaA8937
KClSigmaP9333
K-葡萄糖酸盐SigmaG4500
MgCl2·6H2OSigmaM2670
分子生物学级水SigmaW4502-1L
Na3GTPSigmaG8877
NaClBioshopSOD001.1
Na-葡萄糖酸盐SigmaS2054
NaH2PO4Sigma71504
NaHCO3SigmaS6014
苦味毒sigmaP1675
SrClSigma255521
蔗糖BioshopSUC507.1
TTXAlamone LabsT-550
yDGGTocris6729-55-1

参考文献

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