本文介绍了一种利用急性脑切片进行全细胞膜片钳电生理记录来评估功能性突触多样性的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
在中枢神经系统中，一对神经元通常会形成 多个突触接触点和/或功能性神经递质释放位点（突触多重性）。突触多重性具有可塑性，在发育过程及不同生理条件下会发生变化，是突触传递效能的重要决定因素。本文概述了在急性脑片中利用全细胞膜片钳电生理技术，估算终止于特定突触后神经元的突触多重性程度的实验方法。具体而言，采用电压钳记录来比较自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）与微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）的幅度差异。该方法的理论依据是：具有多重性的传入输入由于在每个突触接触点发生同步释放，会产生较大的、依赖动作电位的sEPSCs；而独立于动作电位的释放（即非同步释放）则产生幅度较小的mEPSCs。本文介绍了一套用于表征突触多重性存在的实验与分析流程，并讨论了该技术的应用要求与局限性。该技术可用于研究体内不同行为、药理或环境干预如何影响大脑不同区域突触接触的组织结构。
引言
突触传递是神经元之间通信的基本机制，因此也是大脑功能的基础。突触传递具有可塑性，其效能可依赖于神经活动模式发生变化，也可响应调节性信号而改变1。因此，研究 突触功能一直是神经科学研究的核心课题。全细胞膜片钳电生理技术是一种多功能的方法，通过设计实验方案和数据分析，能够深入揭示突触传递的生物物理和分子机制。一种常用的方法可能是由于其技术与概念的简便性，即在电压钳制模式下测量微型兴奋性/抑制性突触后电流（mE/IPSCs）2,3,4,5,6。单个mPSC代表了突触后离子型受体（例如AMPA受体和GABAA受体）在结合来自突触前末梢释放的相应神经递质后所引发的离子流动7。由于记录是在存在电压门控Na+通道阻断剂河豚毒素（TTX）的条件下进行的，因此神经递质的释放不依赖于动作电位，通常仅涉及一个含有神经递质的突触小泡。基于这一假设，mPSC的平均幅度被广泛用作量子大小的粗略估计，该参数反映了单个释放位点相对应的突触后受体的数量和功能状态。另一方面，mPSC的频率被认为代....
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方案
所有动物实验均经加拿大安大略省西部大学动物护理委员会根据加拿大动物护理委员会指南批准（AUP#2014-031）。
1. 溶液
- 切片溶液
- 切片溶液的成分见表1。
- 提前配制20倍浓缩液，4 °C保存，可保存不超过1个月。
- 配制1倍切片溶液时，将NaHCO3、葡萄糖和蔗糖溶解于ddH2O中，再加入20倍浓缩液。确保溶液渗透压在315–320 mOsm之间，4 °C保存时间不超过1周。
- 取两个烧杯，各加入100 mL切片溶液，用封口膜封口。将溶液置于-80 °C超低温冰箱中冷却至部分结冰（约20分钟）。在冰上用气体分散管向两个烧杯中的切片溶液通入95% O2/5% CO2混合气体20分钟。
| 溶液浓度（mM） | |||||
| .... | |||||
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结果
上述方案描述了一种利用全细胞膜片钳电生理技术检测突触多重性的方法，并以小鼠下丘脑神经元为例进行说明。该脑片制备技术应获得健康且具有活性的细胞，细胞膜或细胞核无肿胀现象（图1）。方案中的每一步骤对于组织的健康状态和记录质量均至关重要。
图1：切片制备后健康与不健康组织。在40倍放大倍率下，使用微分干涉对比光学系统对室旁核（PVN）进行膜片钳电生理切片制备。红色箭头指示健康细胞，黑色箭头指示不健康细胞。
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讨论
成功进行膜片钳电生理实验的一个重要前提是获得健康的脑片或细胞。本文所述方案已针对包含视上核（PVN）神经元的下丘脑脑片进行了优化。其他脑区可能需要调整溶液成分和切片方法21,22,23,24。在记录过程中，必须持续监测细胞特性（如膜电阻、电容和串联电阻），仅接受稳定的记录。串联电阻升高会降低兴奋性突触后电流（EPSC）的幅度，从而干扰幅度测量结果。因此，若细胞的串联电阻超过 20 MΩ 或在记录期间上升超过 20%，则予以剔除。同样，膜电阻降低（或本身较低）可能导致空间钳制不良，从而降低电流幅度。本研究的目标细胞（小细胞型 PVN 神经元）具有较高的膜电阻，通常介于 500 MΩ 至 1 GΩ 之间，若膜电阻低于 500 MΩ，则不予采用。应针对所研究的具体神经元类型建立相应的质量控制标准。由于本实验方案依赖于给药前后电流幅度的变化，因此必须确保幅度变化是由药物作用引起，而非膜电阻或.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
J.S. 获得了安大略省研究生奖学金。W.I. 获得了加拿大心理健康研究会新研究者奖学金。本研究工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（06106-2015 RGPIN）和加拿大健康研究院（PJT 148707）的运营基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | BD | 309659 | |
| 10 号刀片 | Fisher Scientific/其他 | 35698 | |
| 22 号刀片 | VWR/其他 | 21909-626 | |
| 22 μM 滤膜针头过滤器 | Millipore | 09-719-000 | |
| Adson 镊子 | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| 斜口剪刀 | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| 双刃刀片 | VWR | 74-0002 | |
| 滤纸 | Sigma/其他 | 1001090 | |
| 细毛刷 | Fisher/各种 | 15-183-35/各种 | |
| 气体分散管 | VWR | LG-8680-120 | |
| 异氟烷 | Fresenius Kabi/其他 | M60303 | |
| Krazy 胶水 | 各种 | 各种 | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| 渗透压仪 | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm 封口膜 | Sigma | PM-996 | |
| 巴斯德移液管 | VWR | 14672-200 | |
| pH 计 | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| 橡胶吸头 | VWR | 82024-550 | |
| 3 号手术刀柄 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| 4 号手术刀柄 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| 单刃刀片 | VWR | 55411-050 | |
| 振动切片机 | Leica | VT1200S | |
| 纯水净化系统 | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| 培养板盖 | Fisher/各种 | 07-201-590/各种 | |
| 化学药品/试剂 | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-葡萄糖酸盐 | Sigma | G4500 | |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | |
| 分子生物学级水 | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-葡萄糖酸盐 | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| 苦味毒 | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| 蔗糖 | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
参考文献
- Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
- Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
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