VirWaTest：一种用于水样中病毒检测的即用型方法

摘要

本文介绍了VirWaTest，这是一种简单、经济且便携的方法，可在使用现场对水样中的病毒进行浓缩和检测。

摘要

人类和动物排出的病毒可能污染水源，当这些水被用于饮用、灌溉食物、清洗等用途时，会对人类健康构成风险。传统的粪便细菌指示物并不总能检测出病毒病原体的存在，因此检测病毒病原体及病毒指示物对于采取风险缓解措施具有重要意义，尤其是在人道主义场景以及水源性病毒暴发频发的地区。

目前，已有多种可实现粪便指示菌（FIB）现场定量检测的商业试剂盒。然而，针对病毒检测的商业化试剂盒尚不可用。环境水样中病毒的检测需要将数升水样浓缩至较小体积。此外，浓缩后，病毒的检测依赖于病毒基因组的核酸提取及分子检测等方法（例如基于聚合酶链式反应[PCR]的检测）。

本文所述方法可利用简单且便携的设备，从10升水样中浓缩病毒，并在现场提取病毒核酸。该方法可在现场对多种病毒进行水样检测，在人道主义救援场景中具有重要应用价值，也适用于缺乏配备完善实验室的任何场合。此外，该方法还可用于浓缩水样中的病毒，并将浓缩物在室温条件下运送至实验室进行后续分析。

引言

在人道主义紧急事件初期，获取清洁的水源、卫生设施和保持良好的卫生条件，对受影响人群的生存至关重要。因此，监测水质是预防水源性疫情暴发的优先事项。众所周知，受污染的水往往是多种疾病的源头，但即使具备常规实验室检测手段，也常常难以确定病毒性疫情（如戊型肝炎病毒（HEV））的来源。目前水质控制主要依赖于对指示性粪便污染菌（FIB）的定量检测^1,2,3,4。然而，已有大量文献证实，FIB的缺失与水源性病毒病原体（如轮状病毒（RoV）、诺如病毒（NoV）或HEV）的存在之间并无相关性^5,6。因此，仅依据FIB来评估水质，可能会低估水源性病毒病原体带来的风险。监测指示性病毒（如人腺病毒（HAdV））或特定病原体，有助于明确病毒暴露风险、识别人类感染的潜在来源^7,8,9,10，并验证卫生措施的有效性

方案

1. 准备与包装

注意：待包装的材料/设备列于表1中。在处理过程控制试剂、浓缩试剂、核酸提取试剂 以及 检测试剂时，请佩戴手套。在处理核酸提取所需试剂时，应佩戴护目镜。

1. 过程控制
   1. 按照 ISO 10705-1:1995 程序¹⁴，在实验室中制备含有 1 × 10¹⁰ PFU/mL 的 MS2 噬菌体储备培养物（美国典型培养物保藏中心 [ATCC] 15597-B1）。
   2. 然后，将悬浮液每管分装 10 µL（每管含 1 × 10⁸ PFU）至 10 mL 管中，并在 37 °C 下使水分蒸发。每个水样使用一管。
   3. 此外，为每个采集的样品另准备一管含 10 mL 无菌蒸馏水的试管。
2. 浓缩试剂
   1. 对于预絮凝脱脂乳溶液（PSM），使用以下用量以浓缩五个 10 L 的水样。
      1. 准备一个塑料管，内含 5 g 脱脂乳。
      2. 准备一个拉链塑料袋，内含 16.66 g 海水盐。
      3. 准备一个塑料瓶，内含 500 mL 蒸馏水。

结果

方法开发

该方法由水与食品中病毒污染物实验室在GenIUL和乐施会（Oxfam Intermón）的合作下开发完成，包含三个不同步骤。第一步为病毒颗粒浓缩，是对先前描述的脱脂牛奶絮凝法的一种改进^12,17,18。原始方法经过修改，使其无需电源供应、操作更简便，且无需离心步骤。

通过在地下水中添加已知浓度的人腺病毒（HAdV）和MS2噬菌体，测试了VirWaTest浓缩方法的回收率。VirWaTest浓缩与提取方法对MS2的病毒回收率估计为3.01%至18.02%，对HAdV的回收率为17.52%至44.22%。这些.......

讨论

VirWaTest 方法使无经验的使用者能够在使用现场完成水样中病毒的浓缩及核酸提取。该方法经济、快速且操作简便。浓缩基于脱脂牛奶的有机絮凝原理：在低 pH 和高电导率条件下，脱脂牛奶中的蛋白质聚集形成絮状物，病毒可吸附于其上。当絮状物沉降后，易于收集，从而实现对 10 L 水样的浓缩，而传统的超速离心法则无法处理如此大体积的水样。

该方法已进行改进，可在采样点实施，除使用电池供电的磁力搅拌器外，无需任何其他电气设备。其他一些基于水过滤的方法也已被用于病毒浓缩，并可在使用现场操作。然而，水样中悬浮的物质常常堵塞滤膜，因此，这些系统可浓缩的样品体积较小，是一个严重的限制因素。

这是首次描述一种可在使用现场对水样中的病毒进行浓缩的方法，且不受水样浊度的影响。若有合适的材料，VirWaTest 浓缩法可同时处理多个样品。此外，已有研究表明脱脂牛奶絮凝法在细菌和寄生虫的浓缩中同样有效¹⁹。

准备合适的材料对于正确实施该操作至关重要。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5x HOT FIREPol 探针 qPCR 混合液 Plus (ROX)	Solis BioDyne	08-14-00001	包含 Solis Biodyne 的 5x HOT FIREPol 探针 qPCR 混合液 Plus (qPCR 混合液)，适用于 50 次反应
带盖 8 孔微量离心管条	dD Biolab	840637	低轮廓，薄管壁，适用于定量和定性 PCR
磁力搅拌器用电池和电源适配器	GenIUL	900011674	包含 12V 汽车电源适配器
桶支架	GenIUL	900011648	铝制支架
10 L 桶	Cater4You	10LTR	聚丙烯材质，防篡改，透明颜色
50 mL 离心管	LabBox	CTSP-E50-050	聚丙烯材质，无菌，带刻度，带裙边
一水柠檬酸，500 g	PanReac AppliChem	1410181211	纯品，药用级，1 千克
透明 PET 瓶	LabBox	FPET-500-088	透明颜色，PET 材质，不包含瓶盖
Difco 脱脂奶粉，500 g	Becton Dickinson	232100	脱水状态
DNA/RNA Shield，250 mL	Zymo Research	R1100-250	DNA/RNA 保存液，250 mL
Easy9 移液控制器	LabBox	EAS9-001-001	0.3 μm 滤膜，适用于 0.1 至 100 mL 移液器，可高压灭菌的硅胶移液器支架
0.5 mL Eppendorf 管	Eppendorf	0030121023	聚丙烯材质，Safe-Lock
2 mL Eppendorf 管	Eppendorf	0030120094	聚丙烯材质，Safe-Lock
5 mL Eppendorf 管	dD Biolab	999542	聚丙烯材质，无菌，带刻度
96% V/V 乙醇，1 L	Panreac AppliChem	361085-1611	适用于紫外、红外 和高效液相色谱
实验室镊子	LabBox	FORS-007-002	细头，弯曲末端，长度 = 120 mm
磁力搅拌器	GenIUL	900017000	电池供电
标记笔	dD Biolab	929203	黑色，超细笔尖，防水，快干，适用于塑料和玻璃器皿
微量离心管微型旋转架	dD Biolab	37782	4 个模块，长 × 宽 × 高 = 208 × 100 × 100 mm
Mini8 实时荧光定量 PCR 仪	Coyote Biosciences, 中国	Mini-8	便携式，可使用 12V 电源或外接电池，双通道，可容纳 8 根管
NucliSens 裂解缓冲液	Biomerieux	200292	最多可用于 48 次提取，常温保存
开口尖端移液管，10 mL	Deltalab	900136N	无菌， individually 包装（纸/塑料）
PE 螺口盖 PP28	LabBox	TP28-004-020	适用于 PET 瓶
pH 指示试纸	LabBox	WSPH-001-001	检测范围 pH 2.8 至 pH 4.4，每包 50 条
塑料试管	Quimikals	300913	包含盖子
聚乙烯巴斯德移液管	LabBox	PIPP-003-500	带刻度，总体积 7 mL，非无菌
带螺口盖的聚丙烯螺口瓶，150 mL	Deltalab	409726	螺口盖，无菌，刻度至 100 mL
带螺口盖的聚丙烯螺口瓶，60 mL	Deltalab	409526G	螺口盖，无菌，刻度至 50 mL
粉末状洗涤剂	-	-	常规洗衣粉
磁力搅拌器电源线	GenIUL	900011692	用于连接电池与磁力搅拌器
QuickPick 磁性工具	BioNobile	24001	手持式磁性颗粒操作工具
盒装 QuickPick 吸头	BioNobile	24296	无 RNase，已高压灭菌，96 个
QuickPick XL gDNA 磁性颗粒	BioNobile	SN51100	3.2 mL
人工海盐	Sigma-Aldrich	S9883-500G	一种人工盐混合物，其溶解盐组成与海水非常相似
硅胶管	LabBox	SILT-006-005	5 米卷装，内径  ø × 外径  ø = 6 × 10 mm
氢氧化钠颗粒，98.5 - 100.5%	VWR Chemicals	28244295	颗粒状，1 千克
太阳能旋转平台	SOL-EXPERT Group	70020	丙烯酸板，10 RPM，最大承重 300 克
SOLIScript 一步法探针试剂盒	Solis BioDyne	08-57-00250	包含 Solis Biodyne 的 5x 一步法探针混合液 (qPCR 混合液) 和 40x 一步法 SOLIScript 混合液 (逆转录酶)，适用于 250 次反应
SPEEDTOOLS RNA 病毒提取试剂盒	BioTools	21.141-4197	包含 BioTools 的 BAW 缓冲液（洗涤缓冲液 1）、BAV3 缓冲液（洗涤缓冲液 2 和 3）和 BRE 缓冲液（洗脱缓冲液）
SpinBar 八面体搅拌子	dD Biolab	045926	带枢轴环，长 × 直径  ø = 38 × 8 mm，蓝色
封口尖端移液管，10 mL	Deltalab	PN10E1	无菌， individually 包装（纸/塑料）
封口尖端移液管，50 mL	Deltalab	900043	无菌， individually 包装（纸/塑料）
Termi-DNA-Tor - 核酸去除剂	BioTools	22001-4291	用于去除材料和表面的核酸、细菌、真菌和支原体，450 mL
分子生物学级水试剂，1L	Sigma-Aldrich	W4502-1L	无核酸酶和蛋白酶，0.1 μm 过滤
Whirl-Pak 袋，540 mL	Deltalab	200361	稳定底座
普通自封袋	LabBox	BZIP-080-100	聚乙烯材质，长 × 宽 = 120 × 80 mm