本文介绍了一种简单且可靠的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）饮食诱导啮齿类动物模型，通过非SPF级动物饲养环境并给予特定高脂饮食实现。我们描述了在暴露于环境微生物的小鼠中鉴定肝脏和脂肪组织免疫细胞亚群的方法，以模拟人类的免疫学状态。
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方法文章
一种与2型糖尿病相关的非酒精性脂肪性肝炎高级小鼠模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肥胖与慢性低度炎症及胰岛素抵抗相关，导致2型糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等慢性代谢性疾病发病率不断上升。近期研究表明，促炎性免疫细胞会浸润到肥胖状态下增大的脂肪组织和肝脏中。鉴于免疫细胞在代谢稳态中的作用日益凸显，迫切需要对这些细胞在2型糖尿病和NASH发展过程中的变化进行定量分析和特征描述。然而，能够诱导出典型人类NASH病理生理特征的动物模型仍较为缺乏。
本文提供了一种详细的实验方案，用于在非特定病原体（non-SPF）条件下饲养高脂饮食（HFD）小鼠至少七周后建立的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）可靠小鼠模型中，鉴定从肝脏和脂肪组织分离的免疫细胞亚群。我们展示了在非SPF条件下小鼠的操作、组织消化，以及通过流式细胞术鉴定巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞亚群的方法。文中提供了来自SPF级HFD小鼠和非SPF小鼠的代表性流式细胞术图谱。为获得可靠且可解释的数据，使用特异性抗体、准确且精确的组织消化方法，以及在流式细胞术实验中进行恰当的设门分析，是关键要素。
通过将小鼠饲养在非SPF条件下并使其非特异性地暴露于微生物抗原，以恢复其生理性抗原暴露的干预措施，可能为研究免疫学改变、饮食诱导的肥胖及其相关长期并发症之间的关联提供一种有效工具。
引言
肥胖是一种多因素疾病，也是导致心脏病、中风、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、2型糖尿病（T2D）以及某些癌症的主要风险因素。全球肥胖患病率正在迅速上升。目前，全球有21亿人——接近世界人口的30%——属于肥胖或超重1。与肥胖相关的胰岛素抵抗可导致T2D，当胰腺胰岛β细胞耗竭，无法代偿性地分泌更多胰岛素以维持葡萄糖稳态时，即发生该疾病2。
脂肪组织由多种细胞类型组成，包括脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。在肥胖发展过程中，免疫细胞的数量和活性变化可导致肥大性脂肪组织发生低度炎症3，4。具体而言，已有研究发现，过量的能量摄入伴随血糖、甘油三酯和游离脂肪酸水平长期升高，会导致脂肪细胞缺氧、内质网应激、线粒体功能受损以及细胞因子分泌增加，从而激活促炎性的脂肪组织免疫细胞5，6。以往的研究主要集中在先天免疫，但近年来适应性免疫细胞（T细胞和B细胞）也被认为是葡萄糖稳态的重要调节因子。这些细胞具有促炎功能（包括CD8+ T细胞、Th1细胞和B细胞）或以调节功能为主（包括调节性T（Treg）细胞、Th2细胞），可分别加剧或保护机体免受....
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方案
本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》和《动物福利法》，并在本机构动物护理与使用委员会的监督下进行。动物实验方案根据德国柏林夏里特医院的机构伦理准则实施，并已获得柏林州卫生与社会事务局的批准，符合ARRIVE指南的要求。
1. 非酒精性脂肪性肝炎的饮食诱导动物模型
- 在4周龄时将小鼠（C57Bl/6J，雄性）转移至非SPF级饲养环境，并使其持续暴露于广泛的环境病原体/抗原中。通过每日抓取处理实验动物以确保暴露，因为抗原可通过空气传播实现扩散。
- 将小鼠（C57Bl/6J，雄性，12周龄）饲养于开放式笼具系统中，配备常规过滤器，维持12小时光照/12小时黑暗循环，温度控制在22 °C。实验饮食和垫料不进行辐照或高压灭菌处理。进入动物饲养设施时不佩戴口罩或头套，开放动物房之间的门，不使用风淋设备。
- 确保每日对实验动物进行抓取处理，并定期更换饲养房间，以促进抗原通过空气传播。同时补充非特异性微生物暴露，每日将邻近房间内哺乳类实验动物使用的垫料引入饲养环境，以增强抗原暴露。
- 采用流式细胞术检测血液和脾脏中CD44-CD62L-效应记忆型CD4+和CD8+ T细胞的比例（方法见参考文献13）。
注意：在此，....
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结果
本方案描述了在饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型中，对源自雄性小鼠腹股沟脂肪组织和肝脏的先天性及适应性免疫细胞表面标志物进行表征的方法。在该模型中，通过给予C57Bl/6J小鼠高脂饮食（HFD）并辅以含6%蔗糖的饮水，持续7至15周，以诱导NASH，方法如先前报道13。重要的是，小鼠饲养于半无菌环境中，因此在整个实验过程中持续暴露于环境抗原。以HFD喂养并在SPF条件下饲养的小鼠，以及分别在SPF和非SPF条件下饲养的普通饲料喂养小鼠作为对照组。两组小鼠在喂食HFD 7周后即出现显著的体重增加。体重差异最早在第4周时显现（P < 0.001），并在后续实验周中持续显著。然而，在喂食HFD 7周后，SPF与非SPF小鼠之间的体重增长未表现出显著差异13。对喂食HFD 7周的雄性小鼠，通过胶原酶消化法分离其腹股沟脂肪组织和肝脏中的基质血管组分及免疫细胞。免疫细胞使用荧光标记的一抗进行染色，并通过流式细胞术分析T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞和粒细胞的比例。在小鼠腹股沟脂肪组织中对T细胞亚群的设门策略，包括双联体排.......
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讨论
脂肪性肝炎与肥胖、胰岛素抵抗和血脂异常等代谢异常密切相关15。多项研究表明，脂肪组织炎症可促进2型糖尿病的发病过程，其中包括先天性和适应性免疫系统的多种细胞水平发生改变4,5,16,17。此外，研究发现肥胖可调节免疫通路的活化，进而导致肝脏并发症18。目前，人们对脂肪组织和肝脏炎症反应中免疫细胞表型的特征日益关注，因为不同的免疫细胞亚群在胰岛素抵抗和脂肪性肝炎的发生发展中发挥着各自不同的作用。
该方法详细介绍了如何从腹股沟周围脂肪组织和肝脏中分离并定量相对数量的免疫细胞。此外，该方法还展示了如何在非SPF条件下维持高脂饮食喂养的小鼠，以诱导脂肪性肝炎。本方案可用于研究免疫细胞功能，并在微生物环境标准化的条件下，探究不同组织间特定免疫细.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Anke Jurisch、Diana Woellner、Kathrin Witte博士和Cornelia Heckmann在实验操作方面的协助，以及Biolegend公司Benjamin Tiburzy对设门策略提出的有益建议。J.S. 获得了亥姆霍兹基金会（ICEMED）的资助。本研究得到了柏林健康研究所（BIH）临床研究单元、德国联邦教育与研究部的“BCRT项目资助”以及爱因斯坦基金会的资助。K.S.-B. 和 H.-D.V. 由FOR2165项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 µm细胞滤筛 | Falcon | 352340 | |
| 1 mL注射器 | BD | 309659 | |
| 26 G × 5/8 针头 | BD | 305115 | |
| 35 mm 培养皿 | Falcon | 353001 | |
| 40 µm细胞滤筛 | Falcon | 352340 | |
| ACK裂解缓冲液 | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 标记的抗小鼠 CD45 抗体 | Biolegend | 103127 | AB_493714（BioLegend 货号：103127） |
| 分析软件 | FlowJo 10.0.8 软件 | ||
| APC 抗小鼠 CD11c 抗体 | Biolegend | 117309 | AB_313778（BioLegend 货号：117309） |
| APC 抗小鼠 KLRG1（MAFA）抗体 | Biolegend | 138411 | AB_10645509（BioLegend 货号：138411） |
| BV421抗小鼠CD127抗体 | Biolegend | 135023 | AB_10897948（BioLegend 货号：135023） |
| BV421 抗小鼠 F4/80 抗体 | Biolegend | 123131 | AB_10901171（BioLegend 货号：123131） |
| BV605 抗小鼠 CD279（PD-1）抗体 | Biolegend | 135219 | AB_11125371（BioLegend 货号：135219） |
| BV605 抗小鼠 NK-1.1 抗体 | Biolegend | 108739 | AB_2562273（BioLegend 货号：108739） |
| BV650 抗小鼠/人 CD11b 抗体 | Biolegend | 101239 | AB_11125575（BioLegend 货号：101239） |
| BV711 抗小鼠/人 B220 抗体 | Biolegend | 103255 | AB_2563491（BioLegend 货号：103255） |
| BV785 抗小鼠 CD8a 抗体 | Biolegend | 100749 | AB_11218801（BioLegend 货号：100749） |
| C57Bl/6J小鼠，雄性，5周龄 | 研究机构ü实验医学基金会（FEM） | ||
| CaCl2 | 查里特é - 大学ä柏林工业大学医学院 | A119.1 | |
| 胶原酶 NB 4G 验证级 | SERVA | 11427513 | |
| I 型胶原酶 | 沃辛顿 | LS004197 | |
| 15 mL 锥形离心管 | Falcon | 352096 | |
| 50 mL 锥形离心管 | Falcon | 352070 | |
| DNA酶 | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| 胎牛血清 | Biochrom | S0115 | |
| 过滤 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC标记的抗小鼠CD3抗体 | Biolegend | 100203 | AB_312660（BioLegend 货号：100203） |
| 流式细胞术 | BD-LSR Fortessa | ||
| 镊子 | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| 高脂饮食 | SSNIF | E15741–34 | 脂肪供能占60 kJ%，19 蛋白质提供的能量占总能量的21% 碳水化合物供能百分比（kJ%） |
| 显微解剖剪 | Sigma-Aldrich | S3146 | 用于解剖目的 |
| PE 抗小鼠 CD25 抗体 | Biolegend | 101903 | AB_312846（BioLegend 货号：101903） |
| PE/Cy7 抗小鼠 CD62L 抗体 | Biolegend | 104417 | AB_313102（BioLegend 货号：104417） |
| PE/Cy7 抗小鼠 I-A/I-E（MHCII）抗体 | Biolegend | 107629 | AB_2290801（BioLegend 货号：107629） |
| PE/Dazzle 594 抗小鼠 CD4 抗体 | Biolegend | 100565 | AB_2563684（BioLegend 货号：100565） |
| Percoll 溶液 | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD44 抗体 | Biolegend | 103031 | AB_2076206（BioLegend 货号：103031） |
| PerCP/Cy5.5 抗小鼠 Gr-1 抗体 | Biolegend | 108427 | AB_893561（BioLegend 货号：108427） |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 12559069 | |
| 带细胞滤网盖的圆底管 | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX 抗小鼠 CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800（BioLegend 货号：101301） |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR 可固定活力检测试剂盒 | Biolegend | 423105 | 活力染色 |
参考文献
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88(2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 ....
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重印与许可
