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方法文章

基于泊马度胺的同源PROTACs对E3泛素连接酶Cereblon的化学失活

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DOI：

10.3791/59472

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2019年5月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究描述了一种基于泊马度胺的双功能同源PROTAC分子的合成与表征，该分子作为一种新策略，可诱导E3泛素连接酶cereblon（CRBN）——沙利度胺类似物的作用靶点——发生泛素化并降解。

摘要

免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺及其类似物来那度胺和泊马度胺均为美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗多发性骨髓瘤的药物，它们通过cereblon（CRBN）E3泛素连接酶介导淋巴样转录因子Ikaros（IKZF1）和Aiolos（IKZF3）的泛素化，并使其进入蛋白酶体降解。近期，IMiDs已被用于构建双功能蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs），以利用CRBN E3连接酶对其他蛋白质进行泛素化并诱导其蛋白酶体降解。我们设计并合成了基于泊马度胺的同源双功能PROTAC分子，并分析了其诱导CRBN自身泛素化和降解的能力。在此过程中，CRBN同时作为E3泛素连接酶和被降解的靶标。同源PROTAC化合物8能够高效地降解CRBN，同时对IKZF1和IKZF3的影响极小。化合物8导致的CRBN失活对多种多发性骨髓瘤细胞系的细胞活力和增殖均无显著影响。该同源PROTAC可消除IMiDs在多发性骨髓瘤细胞中的作用效果。因此，我们开发的这种基于泊马度胺的同源二聚体化合物有助于鉴定CRBN的内源性底物及其生理功能，并深入研究IMiDs的分子作用机制。

引言

免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺及其类似物来那度胺和泊马度胺均已被批准用于治疗多发性骨髓瘤，它们可结合E3泛素连接酶cereblon（CRBN），后者是cullin4A-RING E3泛素连接酶（CRL4CRBN）的底物适配蛋白1,2,3。IMiDs的结合增强了CRL4CRBN对淋巴样转录因子Ikaros（IKZF1）和Aiolos（IKZF3）的亲和力，导致这些因子发生泛素化并被降解（图1）4,5,6,7,8。由于IKZF1和IKZF3对多发性骨髓瘤细胞至关重要，其失活可导致细胞生长受到抑制。最近发现SALL4是CRBN的另一个由IMiDs诱导产生的新底物，可能与20世纪50年代沙利度胺引起的致畸性及所谓的“反应停灾难”有关9,10。相比之下，酪蛋白激酶1α（CK1α）是来那度胺特异性的CRBN底物，与染色体5q缺失型骨髓增生异常综合征的治疗作用相关11。

小分子能够靶向特定蛋白质并促使其降解的特性，为现代药物开发带来了令人振奋的前景。尽管沙利度胺及其类似物的作用机制是在其首次用于人体之后才被发现的，这类所谓 Pr骨溶解 Targeting Chimeras（PROTACs）被设计用于特异性靶向目标蛋白（POI）(图2)12,13,14,15,16,17,18PROTAC 是异源双功能分子，由一个靶向目标蛋白（POI）的特异性配体通过连接子与一个 E3 泛素连接酶（如 CRBN 或 von-Hippel-Lindau（VHL））的配体相连组成18,19,20,21,22PROTAC 可诱导形成一种瞬时三元复合物，将靶蛋白（POI）引导至 E3 泛素连接酶，从而使其发生泛素化并被蛋白酶体降解。与传统抑制剂相比，PROTAC 的主要优势在于仅需与靶蛋白结合而无需抑制其活性，因此有望靶向更广泛类型的蛋白质，包括此前被认为不可成药的蛋白，如转录因子。15此外，嵌合分子具有催化作用，因此效力较高。在泛素转移至目标蛋白（POI）后，三元复合物解离，可继续参与新复合物的形成。因此，极低浓度的PROTAC即可实现对目标蛋白的降解。23.

本文描述了一种泊马利度胺-泊马利度胺偶联的同源PROTAC（化合物8）的合成方法，该分子可募集CRBN以实现对自身的降解24。E3泛素连接酶CRBN同时充当招募元件和降解靶点（图3）。为验证实验数据，我们还合成了一个阴性结合对照化合物（化合物9）。实验结果证实，新合成的同源PROTAC对CRBN的降解具有特异性，对其他蛋白质的影响极小。

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方案

1. PROTAC 分子的制备

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。这些合成过程中使用的多种化学品具有毒性且可能致癌。请务必采取所有适当的安全操作规范并使用个人防护装备。

  1. 制备 叔丁基-丁基 N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)氨基甲酸酯（化合物1）
    1. 在100 mL圆底烧瓶中加入Boc-Gln-OH（2.46 g，10 mmol）和THF（50 mL），再加入1,1'-羰基二咪唑（1.95 g，12 mmol）及催化量的4-(二甲氨基)吡啶（5 mg），烧瓶中放入搅拌子并连接回流冷凝管。搅拌下加热回流10小时，直至形成澄清溶液。
    2. 使用旋转蒸发仪减压除去溶剂，加入乙酸乙酯（200 mL），转移至分液漏斗中。用 H2O（50 mL）和盐水（50 mL）洗涤，并用 Na 干燥2SO4.
    3. 通过一个短柱状硅胶（直径5 cm，高5 cm）过滤溶液，并用额外的乙酸乙酯（200 mL）洗脱。
    4. 蒸发溶剂，并在真空下干燥所得无色固体。
  2. 制备 叔丁基-丁基 N-(1-甲基-2,6-二氧代-3-哌啶基)氨基甲酸酯（化合物 2）
    1. 合并化合物 1 （2.28 g，10 mmol）与研细的碳酸钾（2.76 g，20 mmol）和DMF（25 mL）置于100 mL圆底烧瓶中。用注射器缓慢滴加碘甲烷（1.42 g，0.62 mL，10 mmol），并在烧瓶口配备带穿刺橡胶隔膜的装置。将反应容器放入超声波清洗仪中反应2 h。
    2. 稀释 用100 mL乙酸乙酯溶解反应混合物，转移至分液漏斗中。依次用1 N NaOH溶液（2次，每次25 mL）洗涤有机相，再用H2O（25 mL）和饱和食盐水（25 mL），用 Na 干燥2SO4.
    3. 过滤并蒸发溶剂。使用石油醚/乙酸乙酯（2:1）为洗脱剂，通过硅胶柱色谱（柱直径6 cm，柱高20 cm）纯化产物。
  3. 2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮（化合物3）的制备
    1. 将3-氟代邻苯二甲酸酐（1.25 g，7.5 mmol）与谷酰亚胺混合 1 （1.14 g，5 mmol）和乙酸钠（0.50 g，6.0 mmol）溶于冰醋酸（20 mL）的溶液置于50 mL圆底烧瓶中，加入搅拌子，并连接回流冷凝管。将混合物在120 °C加热反应6 h。
    2. 冷却后，将紫色混合物倒入 H2O（100 mL）中，搅拌10分钟。通过过滤收集析出的固体，用水洗涤2O（3 × 5 mL）和石油醚（3 × 5 mL）洗涤，并在真空下干燥。
  4. 4-氟-2-(1-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮（化合物4）的制备
    1. 将3-氟代邻苯二甲酸酐（1.25 g，7.5 mmol）与谷氨酸二酰亚胺 2 （1.21 g，5 mmol）和醋酸钠（0.50 g，6.0 mmol）溶于冰醋酸（20 mL）的溶液置于100 mL圆底烧瓶中，加入搅拌子，并连接回流冷凝管。将混合物在120 °C下加热反应6 h。
    2. 冷却后，将紫色混合物倒入 H2O（100 mL）中，搅拌10分钟。通过过滤收集析出的固体，用水洗涤2O（3 × 5 mL）和石油醚（3 × 5 mL）洗涤，真空干燥。
  5. 制备 叔-丁基 N-[2-[2-[2-[[2-(2,6-二氧代-3-哌啶基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙基]氨基甲酸酯（化合物 7）
    1. 向一个50 mL圆底烧瓶中加入 叔丁基-丁基 N-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基]氨基甲酸酯 (5，0.41 g，1.65 mmol，化合物 3 （0.41 g，1.50 mmol），干燥DMF（10 mL）和DIPEA（0.39 g，0.51 mL，3.0 mmol）。加入搅拌子和回流冷凝管，在氩气氛围下加热至90 °C反应10小时。
    2. 冷却至室温后，将深绿色混合物倒入 H2O（100 mL）混合，并用乙酸乙酯（3 × 50 mL）在分液漏斗中萃取。用 H2O（50 mL）和盐水（50 mL），用Na干燥2SO4，过滤，并在减压下浓缩。
    3. 使用硅胶柱色谱纯化粗产物（硅胶柱直径3 cm，高60 cm），以石油醚/乙酸乙酯（1:1 至 1:2）梯度洗脱。
  6. 同源二聚体（化合物 8）的制备
    1. 将α,ω-二胺连接剂混合 6 （0.22 g，0.22 mL，1.50 mmol），DIPEA（1.05 mL，6.00 mmol）和一种溶液 3 （0.83 g，3.00 mmol）溶于干燥DMSO（20 mL）中，置于50 mL圆底烧瓶内，加入搅拌子，并连接回流冷凝管。在氩气氛围下加热至90 °C，反应18 h。
    2. 冷却至室温后，将深绿色混合物倒入 H2O（100 mL）混合，用乙酸乙酯（3 × 50 mL）在分液漏斗中萃取。将合并的有机相用 H2O（50 mL）和饱和食盐水（50 mL），用Na干燥2SO4，过滤并减压浓缩.
    3. 通过硅胶柱层析纯化粗产物，硅胶柱直径为3 cm，高度为50 cm，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯（1:2）到乙酸乙酯的梯度洗脱。
  7. 异源二聚体（化合物9）的制备
    1. 溶解化合物 7 （0.83 g，1.65 mmol）溶于干燥 CH2Cl2 （10 mL）。加入三氟乙酸（10 mL），于40 °C在密闭的50 mL圆底烧瓶中搅拌黄色混合物2 h。
    2. 除去挥发性物质，并与 CH 共蒸发2Cl2 （4次，每次5 mL）。减压干燥残余物10小时。
    3. 将材料重新溶解于干燥的DMF（20 mL）中。加入化合物 4 （0.44 g，1.50 mmol）和 DIPEA（0.78 g，1.05 mL，6.00 mmol），并安装回流冷凝管。在氩气氛围下加热至 90 °C 反应 10 小时。
    4. 冷却至室温后，将深绿色混合物倒入 H2O（100 mL）混合，于分液漏斗中用乙酸乙酯（3 × 50 mL）萃取。将合并的有机相用饱和 NaHCO₃ 溶液洗涤。3 （50 mL），H2O（50 mL），10% KHSO₄4 （50 mL），H2O（50 mL）和饱和食盐水（50 mL），用 Na 干燥2SO4，过滤并在减压下浓缩。
    5. 通过硅胶柱层析纯化粗产物（硅胶柱直径3 cm，高50 cm），洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯（1:2）到乙酸乙酯的梯度体系。
    6. 阐明并验证分子结构图5A 化合物 8, 5B 化合物 9）由 1H NMR 和 13DMSO中的碳-13核磁共振谱d6 在核磁共振（NMR）波谱仪上进行检测。通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）方法，结合二极管阵列检测器（DAD）在220–500 nm波长范围内的检测，确认两种化合物的纯度均高于97%。

2. PROTAC 分子的功能验证

  1. PROTAC介导CRBN降解的蛋白质印迹分析
    注意：化合物的作用 8 和化合物 9 通过蛋白质印迹分析检测了CRBN蛋白水平的变化。此外，还可证实对IKZF1和IKZF3水平的影响（图6).
    1. 样品制备
      1. 溶解化合物 8 和 9，来那度胺（Len）、泊马度胺（Pom）、MG132 和 MLN-4924 溶于 DMSO，浓度为 10 mM，分装后于 -80 °C 保存备用。
      2. 接种 1 × 106 6孔板中的MM1S细胞加入2.5 mL培养基，并用100 nM或1 µM化合物处理细胞 8 或 9 24 小时。
      3. 处理后收集细胞，在700 x g下离心 g，5 分钟，4 °C。用预冷的 1x PBS 洗涤细胞沉淀以去除残留培养基，700 x g 离心 g，4 °C下5分钟，弃上清液。重复此步骤一次。
      4. 在裂解缓冲液（25 mM Tris HCl pH 7.4，150 mM NaCl，1% NP-40，1 mM EDTA，5% 甘油，1×蛋白酶抑制剂）中裂解细胞 & 磷酸酶抑制剂混合物）冰浴 10 分钟，320 × g 离心 g 4 °C下孵育10分钟，收集上清液，按照制造商说明书使用二辛可宁酸蛋白检测试剂盒（BCA检测）测定蛋白浓度。
      5. 变性蛋白质（15–30 µg/样本），加入1x LDS上样缓冲液（含5% 2-巯基乙醇），75 °C煮沸10分钟。
    2. SDS-PAGE
      1. 用10%分离胶固定凝胶三明治［3×分离胶缓冲液（3 M Tris/HCl，0.3% (w/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS)，pH 8.45）4 mL，30%丙烯酰胺 4 mL，50%甘油 2.52 mL，H₂O 1.395 mL］2O，75 µL 11% 过硫酸铵（APS）和 9.75 µL TEMED] 以及 4% 浓缩胶 [1.992 mL 3x 凝胶缓冲液，0.792 mL 30% 丙烯酰胺，3.168 mL H₂O]2O、36 µL 11% APS 和 6 µL TEMED] 加入电极组件中。取出梳子，用阴极缓冲液（100 mM Tris/HCl，100 mM 三羟甲基甘氨酸，0.1% (w/v) SDS）冲洗加样孔，然后上样。
      2. 将阳极缓冲液（100 mM Tris/HCl，pH 8.9）加入电泳槽中。加载步骤2.1.1.4中的蛋白样品，在恒定电压下进行SDS-PAGE电泳：先以70 V运行20分钟，再以115 V运行150分钟。
    3. 免疫印迹及CRBN、IKZF1和IKZF3的检测
      1. 将 PVDF 膜（0.45 µm）在 100% 甲醇中活化 1 分钟。用 1× 转膜缓冲液 [10× 转膜缓冲液（192 mM 甘氨酸，25 mM Tris-碱/HCl，900 mL H₂O）加甲醇] 平衡 PVDF 膜和分离胶。2O)，20% 甲醇，0.1% SDS，pH 8.3]
      2. 按照制造商说明书组装转印夹心盒。以180 mA电流转膜90分钟。
      3. 用1×TBS-T（25 mM Tris/HCl，150 mM NaCl，pH 7.6，0.1% Tween 20）在室温下洗涤膜3次，每次5–10分钟。在含5%脱脂奶粉（NFDM）的TBS-T中于室温封闭膜1小时。用1×TBS-T在室温下洗涤膜3次，每次5–10分钟。
      4. 在4 °C下，用含5% BSA的TBS-T缓冲液按1:500比例稀释CRBN一抗，将膜置于该溶液中轻摇孵育过夜。
      5. 用1×TBS-T室温洗膜，每次5–10分钟，共洗3次。将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠二抗（1:10,000，溶于5%脱脂奶粉TBS-T）或抗兔二抗（1:5,000，溶于5%脱脂奶粉TBS-T）在室温下孵育1小时。
      6. 室温下用 1X TBS-T 洗涤膜 2 次，每次 5–10 分钟。用 1x TBS 重复此步骤两次。
      7. 根据制造商说明书，用HRP底物溶液孵育膜2分钟，并在化学发光检测仪中检测化学发光信号。
      8. 用1×TBS在室温下洗涤膜1次，每次5–10分钟。为洗脱抗体，将膜置于市售的抗体 stripping 缓冲液中孵育15分钟。随后用1×TBS在室温下洗涤膜3次，每次5–10分钟。
      9. 用5%脱脂奶粉TBS-T室温封闭膜1小时。室温下用1×TBS-T洗涤膜3次，每次5–10分钟，然后根据步骤2.1.3.4，重新用IKZF1、IKZF3或tubulin探针检测。
  2. MG132、MLN4924 或泊马度胺的竞争实验
    注意：为了确认CRBN是否通过泛素-蛋白酶体途径降解，我们使用蛋白酶体抑制剂MG132和NEDD化激活酶（NAE）抑制剂MLN4942进行了竞争实验图7).
    1. 种子 1 x 106 每孔加入MM1S细胞至6孔板中。用10 µM MG132、10 µM MLN4942或来那度胺（100倍浓度）预处理细胞，于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。2.
    2. 加入100 nM化合物 8 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 3 小时2.
    3. 按照步骤 2.1.1 收集细胞用于 Western 印迹。
  3. 多发性骨髓瘤细胞系中的细胞活力检测
    注意：本实验用于检测化合物对细胞活力的影响，并通过在使用IMiDs前用该化合物对细胞进行预处理，以拮抗IMiDs对多发性骨髓瘤细胞的作用 8 (图8, 图9A,B).
    1. 接种 5 × 104 每孔接种MM1S细胞，置于96孔板中，每个样本设三个生物学重复，用于细胞活力检测。进行蛋白质印迹分析时，接种量为1 × 10⁶6 6孔板中每孔MM1S细胞，设三个生物学重复。
    2. 用 DMSO 或 100 nM、1 µM 或 10 µM 化合物处理细胞 8，化合物 9 或泊马度胺，于37 °C、5% CO₂条件下孵育24 h、48 h或96 h2对于挽救实验，用100 nM化合物处理细胞 8 孵育3小时，然后加入或孵育3小时后加入1 µM来那度胺，并继续孵育96小时。
    3. 使用化学发光细胞活力检测试剂盒，按照制造商说明书在酶标仪上测定96孔板的发光值；或从6孔板中收集细胞用于蛋白质印迹分析。

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结果

本文描述了一种基于泊马利度胺的同源二聚体PROTAC的设计、合成及其针对CRBN降解的生物学评价。该PROTAC可同时与两个CRBN分子结合，形成诱导CRBN自身泛素化及蛋白酶体降解的三元复合物，同时对泊马利度胺诱导的新底物IKZF1或IKZF3的影响极小。

一系列已发表的基于泊马利度胺的PROTAC分子24，化合物 8 在CRBN的化学诱导降解中表现出特别高效的效果。其合成可按如下方法进行（图4）。在1,1'-羰基二咪唑促进下，Boc保护的L-谷氨酰胺发生缩合反应生成环化酰亚胺 1。该 N-甲基化类似物 2 可通过碘甲烷烷基化获得。两种结构单元（1 和 2）经...

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讨论

本文所述针对CRBN的同源PROTAC（homo-PROTAC）设计依赖于泊马度胺对CRBN的特异性亲和力，该特性已在多种异双功能PROTAC中成功应用，并由此开发出PROTAC 8，作为高度选择性的CRBN降解剂。我们分子的特异性已通过蛋白质组学分析得到证实24。对于基因介导的基因敲除，排除和验证副作用具有挑战性且耗时较长。此外，化学诱导的基因表达下调具有可逆性、快速性，并可直接应用于多种细胞和组织类型28。

免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺、来那度胺和泊马度胺已成为多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤及骨髓增生异常综合征治疗中的主要手段。IMiDs通过调节CRBN-CRL4 E3连接酶的特异性，介导新底物IKZF1、IKZF3或CK1α的降解，从而发挥其生物学活性6,11,29

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披露

作者声明不存在潜在的经济利益冲突。

致谢

本工作由德国研究基金会（德意志研究联合会）资助（Emmy-Noether 计划项目号 Kr-3886/2-1 和 SFB-1074，资助 J.K.；FOR2372，资助 M.G.）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,1'-羰基二咪唑TCI chemicalsC0119
2,2′-(乙二氧基)双(乙胺)Sigma-Aldrich385506化合物 6
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM6250
3-氟代邻苯二甲酸酐，98%Alfa AesarA12275
4-二甲氨基吡啶，99%阿克罗斯148270250有毒的
丙烯酰胺储备液ösung/ 双丙烯酰胺 (30%/0.8%)卡尔·罗斯3029.1
Aiolos (D1C1E) 单克隆抗体细胞信号传导15103S
兔源抗CRBN抗体SigmaHPA045910
抗兔IgG HRP标记抗体Sigma7074S
过硫酸铵Roth9592.2
Boc-Gln-OHTCI chemicalsB1649
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo 发光法细胞活力检测PromegaG7571
ChemiDoc XRS+伯乐（Bio-Rad）1708265
DMF，无水，99.8%阿克罗斯348435000分子筛上过干燥处理
DMSO，无水，99.7 %阿克罗斯348445000分子筛上过干燥处理
甘氨酸Sigma-Aldrich15523-1L-R
山羊抗小鼠（HRP标记）Santa Cruz Biotechnologysc-2005
蛋白酶抑制剂 &磷酸酶抑制剂单次使用混合液（100X）赛默飞世尔科技1861280
Ikaros (D6N9Y) 单克隆抗体细胞信号传导14859S
ImmobilonP 转印膜（0.45）µm)默克IPVH000010
碘甲烷，99 %Sigma-AldrichI8507剧毒
甲醇Sigma-Aldrich32213-2.5L
Mg132SelleckchemS2619
小型转印电泳转移槽Bio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽伯乐（Bio-Rad）1658004
MLN4942biomol (cayman)Cay15217-1
单克隆抗-α-小鼠来源的微管蛋白抗体（B512）SigmaT5168
N-乙基二异丙基胺，99 %Alfa AesarA11801
脱脂奶粉PanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 微孔白板聚苯乙烯板赛默飞世尔科技136101
NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X)赛默飞世尔科技NP0008
Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒赛默飞世尔科技23225
泊马利度胺SelleckchemS1567
RestoreTM 蛋白质印迹膜再生缓冲液赛默飞世尔科技46430
十二烷基硫酸钠卡尔·罗特183.1
氯化钠Sigma-AldrichA9539-500g
TEMED卡尔·罗斯2367.3
tert-丁基 N-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基]氨基甲酸酯Sigma-Aldrich89761化合物5
Tricin卡尔·罗特6977.4
Trizma 碱Sigma-AldrichT1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL 喷雾AdvanstaK-12049-D50

参考文献

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脑源性神经营养因子降解基于泊马度胺的PROTAC分子同源PROTAC化合物8CRBN失活蛋白质印迹分析细胞活力检测多发性骨髓瘤细胞IKZF1和IKZF3降解蛋白酶体抑制核磁共振结构确证
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