基于泊马度胺的同源PROTACs对E3泛素连接酶Cereblon的化学失活

摘要

本研究描述了一种基于泊马度胺的双功能同源PROTAC分子的合成与表征，该分子作为一种新策略，可诱导E3泛素连接酶cereblon（CRBN）——沙利度胺类似物的作用靶点——发生泛素化并降解。

摘要

免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺及其类似物来那度胺和泊马度胺均为美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗多发性骨髓瘤的药物，它们通过cereblon（CRBN）E3泛素连接酶介导淋巴样转录因子Ikaros（IKZF1）和Aiolos（IKZF3）的泛素化，并使其进入蛋白酶体降解。近期，IMiDs已被用于构建双功能蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs），以利用CRBN E3连接酶对其他蛋白质进行泛素化并诱导其蛋白酶体降解。我们设计并合成了基于泊马度胺的同源双功能PROTAC分子，并分析了其诱导CRBN自身泛素化和降解的能力。在此过程中，CRBN同时作为E3泛素连接酶和被降解的靶标。同源PROTAC化合物8能够高效地降解CRBN，同时对IKZF1和IKZF3的影响极小。化合物8导致的CRBN失活对多种多发性骨髓瘤细胞系的细胞活力和增殖均无显著影响。该同源PROTAC可消除IMiDs在多发性骨髓瘤细胞中的作用效果。因此，我们开发的这种基于泊马度胺的同源二聚体化合物有助于鉴定CRBN的内源性底物及其生理功能，并深入研究IMiDs的分子作用机制。

引言

免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺及其类似物来那度胺和泊马度胺均已被批准用于治疗多发性骨髓瘤，它们可结合E3泛素连接酶cereblon（CRBN），后者是cullin4A-RING E3泛素连接酶（CRL4^CRBN）的底物适配蛋白^1,2,3。IMiDs的结合增强了CRL4^CRBN对淋巴样转录因子Ikaros（IKZF1）和Aiolos（IKZF3）的亲和力，导致这些因子发生泛素化并被降解（图1）^4,5,6,7,8。由于IKZF1和IKZF3对多发性骨髓瘤细胞至关重要，其失活可导致细胞生长受到抑制。最近发现SALL4是CRBN的另一个由IMiDs诱导产生的新底物，可能与20世纪50年代沙利度胺引起的致畸性及所谓的“反应停灾难”有关^9,

方案

1. PROTAC 分子的制备

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。这些合成过程中使用的多种化学品具有毒性且可能致癌。请务必采取所有适当的安全操作规范并使用个人防护装备。

1. 制备 叔丁基-丁基 N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)氨基甲酸酯（化合物1）
   1. 在100 mL圆底烧瓶中加入Boc-Gln-OH（2.46 g，10 mmol）和THF（50 mL），再加入1,1'-羰基二咪唑（1.95 g，12 mmol）及催化量的4-(二甲氨基)吡啶（5 mg），烧瓶中放入搅拌子并连接回流冷凝管。搅拌下加热回流10小时，直至形成澄清溶液。
   2. 使用旋转蒸发仪减压除去溶剂，加入乙酸乙酯（200 mL），转移至分液漏斗中。用 H₂O（50 mL）和盐水（50 mL）洗涤，并用 Na 干燥₂SO₄.
   3. 通过一个短柱状硅胶（直径5 cm，高5 cm）过滤溶液，并用额外的乙酸乙酯（200 mL）洗脱。
   4. 蒸发溶剂，并在真空下干燥所得无色固体。
2. 制备 叔丁基-丁基 N-(1-甲基-2,6-二氧代-3-哌啶基)氨基甲酸酯（化合物 2）

结果

本文描述了一种基于泊马利度胺的同源二聚体PROTAC的设计、合成及其针对CRBN降解的生物学评价。该PROTAC可同时与两个CRBN分子结合，形成诱导CRBN自身泛素化及蛋白酶体降解的三元复合物，同时对泊马利度胺诱导的新底物IKZF1或IKZF3的影响极小。

一系列已发表的基于泊马利度胺的PROTAC分子²⁴，化合物 8 在CRBN的化学诱导降解中表现出特别高效的效果。其合成可按如下方法进行（图4）。在1,1'-羰基二咪唑促进下，Boc保护的L-谷氨酰胺发生缩合反应生成环化酰亚胺 1。该 N-甲基化类似物 2 可通过碘甲烷烷基化获得。两种结构单元（1 和 2）经.......

讨论

本文所述针对CRBN的同源PROTAC（homo-PROTAC）设计依赖于泊马度胺对CRBN的特异性亲和力，该特性已在多种异双功能PROTAC中成功应用，并由此开发出PROTAC 8，作为高度选择性的CRBN降解剂。我们分子的特异性已通过蛋白质组学分析得到证实²⁴。对于基因介导的基因敲除，排除和验证副作用具有挑战性且耗时较长。此外，化学诱导的基因表达下调具有可逆性、快速性，并可直接应用于多种细胞和组织类型²⁸。

免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺、来那度胺和泊马度胺已成为多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤及骨髓增生异常综合征治疗中的主要手段。IMiDs通过调节CRBN-CRL4 E3连接酶的特异性，介导新底物IKZF1、IKZF3或CK1α的降解，从而发挥其生物学活性^6,11,29

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,1'-羰基二咪唑	TCI chemicals	C0119
2,2′-(乙二氧基)双(乙胺)	Sigma-Aldrich	385506	化合物 6
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
3-氟代邻苯二甲酸酐，98%	Alfa Aesar	A12275
4-二甲氨基吡啶，99%	阿克罗斯	148270250	有毒的
丙烯酰胺储备液ösung/ 双丙烯酰胺 (30%/0.8%)	卡尔·罗斯	3029.1
Aiolos (D1C1E) 单克隆抗体	细胞信号传导	15103S
兔源抗CRBN抗体	Sigma	HPA045910
抗兔IgG HRP标记抗体	Sigma	7074S
过硫酸铵	Roth	9592.2
Boc-Gln-OH	TCI chemicals	B1649
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906-100G
CellTiter-Glo 发光法细胞活力检测	Promega	G7571
ChemiDoc XRS+	伯乐（Bio-Rad）	1708265
DMF，无水，99.8%	阿克罗斯	348435000	分子筛上过干燥处理
DMSO，无水，99.7 %	阿克罗斯	348445000	分子筛上过干燥处理
甘氨酸	Sigma-Aldrich	15523-1L-R
山羊抗小鼠（HRP标记）	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
蛋白酶抑制剂 &磷酸酶抑制剂单次使用混合液（100X）	赛默飞世尔科技	1861280
Ikaros (D6N9Y) 单克隆抗体	细胞信号传导	14859S
ImmobilonP 转印膜（0.45）µm)	默克	IPVH000010
碘甲烷，99 %	Sigma-Aldrich	I8507	剧毒
甲醇	Sigma-Aldrich	32213-2.5L
Mg132	Selleckchem	S2619
小型转印电泳转移槽	Bio-Rad	1703930
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽	伯乐（Bio-Rad）	1658004
MLN4942	biomol (cayman)	Cay15217-1
单克隆抗-α-小鼠来源的微管蛋白抗体（B512）	Sigma	T5168
N-乙基二异丙基胺，99 %	Alfa Aesar	A11801
脱脂奶粉	PanReac AppliChem	A0830,0500
Nunc F96 微孔白板聚苯乙烯板	赛默飞世尔科技	136101
NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X)	赛默飞世尔科技	NP0008
Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23225
泊马利度胺	Selleckchem	S1567
RestoreTM 蛋白质印迹膜再生缓冲液	赛默飞世尔科技	46430
十二烷基硫酸钠	卡尔·罗特	183.1
氯化钠	Sigma-Aldrich	A9539-500g
TEMED	卡尔·罗斯	2367.3
tert-丁基 N-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基]氨基甲酸酯	Sigma-Aldrich	89761	化合物5
Tricin	卡尔·罗特	6977.4
Trizma 碱	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949-500ml
WesternBright ECL 喷雾	Advansta	K-12049-D50