在小鼠小腿上应用一致的按摩样扰动，并监测由此产生的肌肉压力变化

摘要

在这里，我们描述了将定义的机械载荷应用于小鼠小腿和监测伴随的肌肉压力变化的协议。我们开发的实验系统对于研究体育锻炼和按摩的有益作用背后的机制非常有用。

摘要

按摩被普遍认为有助于缓解疼痛和炎症。虽然以前的研究已经报道了按摩对骨骼肌肉的抗炎作用，但背后的分子机制却知之甚少。我们最近开发了一种简单的装置来应用局部周期性压缩（LCC），它可以产生不同振幅的肌肉压力波。使用该装置，我们已经证明LCC调节巨噬细胞的原位炎症反应，并减轻固定引起的肌肉萎缩。在这里，我们描述了LCC的优化和应用方案，作为一种按摩样干预固定引起的炎症和小鼠后肢骨骼肌肉萎缩。我们开发的协议可用于研究运动和按摩的有益作用的机理。我们的实验系统提供了分析方法的原型，以阐明肌肉平衡的机械调节，虽然需要进一步的发展，以进行更全面的研究。

引言

按摩被普遍认为对减轻疼痛和提高竞技运动员和非运动员的身体表现都是有益的。事实上，以前的研究表明，按摩抑制局部^炎症3，并促使从运动后肌肉^损伤4，5恢复。按摩有益作用的分子机制在很大程度上仍不为人所知。

按摩机械学调查的一个困难是，通过实验技术对按摩样干预进行试验的可重复性。在以前的研究中，模仿按摩的实验程序主要涉及使用练习者身体部位（如手掌和手指6、7、8）进行身体干预。这使得很难精确再现其大小、频率、持续时间和模式。

许多设备已被开发用于将定义的机械载荷应用于目标组织。例如，曾等人开发了一种气动系统，用于对大鼠的后肢进行长度机械^加载，王等人也开发了一种机电一体化装置，可以将按摩般的机械载荷应用于大鼠和兔子的后肢。实时反馈^控制10。与它们相比，我们的局部循环压缩 （LCC） 系统要简单得多，对施工成本的要求要低得多。尽管如此，我们可以重现在轻度肌肉收缩期间产生的肌肉压力变化。利用该装置，我们已经成功地证明，按摩样的机械干预调节局部间质流体动力学，缓解固定引起的肌肉^萎缩11。

在这里，我们描述了我们的设备和协议的细节，这可能有助于探索运动和按摩的积极作用背后的分子机制。该协议的原理图作为补充图1提出。

方案

所有动物实验都是经国家残疾人康复中心动物护理和使用委员会批准进行的。

1. 固定小鼠双边后肢

注:雄性C57BL/6小鼠在适应后至少7天11-12周时用于实验。

1. 使用五巴比妥钠（50毫克/千克i.p.）对小鼠进行充分麻醉。确保小鼠对后肢脚趾捏没有反应。
   注:在上午10时至下午7时之间进行固定程序，以尽量减少对小鼠进食活动的可能影响。
2. 将手术胶带涂在小鼠的双边后肢上，放在一个苏皮内位置，膝盖关节延长，踝关节弯曲。
3. 在 L4-5 脊柱水平的树干上放置一根铝线（参见材料表），并在螺旋结构中绕后肢旋转导线，螺旋层每圈之间有 5 mm 的间隙（图 1A）。确保不要将导线卷得太紧，避免干扰当地的血流。
4. 为了尽量减少从接线中逸出的可能性，通过手动调整铝线的配置，将髋关节固定在 90° 绑架的位置。
5. 把老鼠送回原来的笼子里。3小时后，确保他们从麻醉中恢复，并像往常一样获得食物和水。
6. 每个笼子3-6只固定小鼠，如固定前一样。

2. 小鼠胃内肌肉肌肉肌肉肌肉压力的测量

注:在与LCC结合的压力监测实验中，测试了几种不同重量的圆柱体单元（36克、66克和200克）。该测量与分析肌肉炎症和萎缩的实验分开进行（详情见步骤 3 - 5），即接受压力测量的小鼠未用于组织学分析。

1. 由于压力测量涉及与后肢布线和LCC相比更具侵入性的程序（例如皮肤切口和针插入），因此使用三种麻醉剂的混合物（麦地霉胺0.75毫克/千克，中氨基4.0毫克/千克，丁醇5.0毫克/千克，i.p.）。确保小鼠对后肢脚趾捏合没有反应。
2. 将鼠标放在易感位置，用电动刮刀脱毛后，用手术刀在后小腿上切开2毫米切口，用70%乙醇和氯西丁浸泡的吸水棉对皮肤表面进行半消毒。
3. 将20G的插入针头以钝角（150°~170°）插入胃肠肌中，以钝角（150°~170°）插入皮肤表面。
4. 以针的塑料护套为指导，在胃肠肌肉的中腹放置血压遥测仪的传感器（见材料表），然后从肌肉上取下护套。
5. 用4-0尼龙缝合缝合皮肤后，在小鼠的小腿上涂上几个不同重量的圆柱形单位的LCC（详情见步骤3），并使用用于生物信号分析的软件监测肌肉压力（见表材料）。
6. 把老鼠送回原来的笼子里。3小时后，确保他们从麻醉/麻醉中恢复，并像往常一样获得食物和水。

3. 小鼠小腿上的局部周期性压缩 （LCC）

1. 除肌肉压力测量和安乐死（即宫颈脱位）外，使用五巴比妥钠（50毫克/千克i.p.）进行麻醉。
2. 将鼠标从后肢接线中分离，并将其置于一个容易的位置，膝盖关节伸展，踝关节弯曲，使小腿朝上。不要在舞台上固定鼠标后肢。
3. 通过垂直移动圆柱形重量单元（图1B），在1Hz（图1C）上，每天30分钟，7天，将LCC施加到小腿上。
4. 每天每次LCC后，重新连接鼠标后肢。

4. 胃肠免疫性化学分析

1. 在适当的麻醉/麻醉下，通过注射三种麻醉剂的混合物（麦地那米胺0.75毫克/千克，中子胺4.0毫克/千克，以及丁醇5.0毫克/千克），在适当的麻醉/麻醉下使小鼠安乐死。
2. 脱毛后小腿表面，做皮肤切口，并解剖胃肠肌肉，通过分离从头骨纤维骨使用手术剪刀，并迅速冻结他们在一个最佳的切割温度复合溶液。
3. 使用低温器，在玻璃滑梯上制备胃肠肌肉的低温截面样本。将样品储存在-80°C冷冻室中，直到分析。
4. 从冷冻箱中取出胃肠冷冻部分样品，在室温下通过空气干燥脱水。
5. 使用液体阻滞笔绘制包含幻灯片上所有低温部分的区域。圆圈将防止解决方案从幻灯片上流出。
6. 将滑轨放入使用浸水纸布营造潮湿环境的托盘中，避免样品干燥。
7. 在室温下涂抹100μL的阻断缓冲液（含0.25%卡辛、载体蛋白和0.015 M阿齐德钠的磷酸盐缓冲盐（PBS）。
8. 用PBS-T（含有0.1%聚乙烯环一醇的PBS）冲洗幻灯片两次（见材料表）5分钟。
9. 在每个样品上涂抹100μL原抗体，用PBS稀释，盖上盖子盖住托盘，在室温下孵育过夜。
10. 用 PBS-T 洗涤 3 次（每次洗涤 5 分钟）。
11. 在每个样品上涂抹100μL的二级抗体，用PBS稀释，并在室温下孵育1小时。
    注:对于抗拉米宁染色，使用Alexa Fluor 568-结合二级抗体。对于抗F4/80、抗MCP-1和抗TNF-α，使用Alexa Fluor 568-或488偶发二次抗体。
12. 用 PBS-T 洗涤 3 次（每次洗涤 5 分钟）。
13. 在每个样品上涂抹100μL的DAPI溶液，用PBS-T稀释，并在室温下孵育3分钟。
14. 用 PBS-T 洗涤 3 次（每次 5 分钟）。
15. 使用安装介质安装样品，并盖上盖板。

5. 胃肠的形态分析

1. 将样品幻灯片放在荧光显微镜上（见材料表），并使用带适当过滤器的 20° 物（DAPI-B、360/40 nm 用于激发和 460/50 nm 进行发射）查看样品;GFP-B，470/40 nm 用于激励，535/50 nm 用于排放;FRITC，540/25 nm 用于激励，605/55 nm 用于排放。
2. 使用该软件进行图像分析（见材料表），测量每个肌纤维的横截面面积（CSA），并计算F4/80-、MCP-1-和TNF-β阳性细胞的数量。
   注:通过跟踪基底膜的内缘，通过抗拉米宁-2免疫染色进行可视化，确定每个肌纤维的CSA。

结果

与我们以前的^观察12一致，胃肠肌纤维的CSA因后肢固定而显著减少（图2A，B）。此外，我们的免疫荧光染色分析表明，表达MCP-1和TNF-α的细胞在调节炎症过程方面起着^{关键作用13，14，}在胃肠肌中显著增加固定后肢组织（MCP-1:图2C，F，H;TNF-α:图2D，G，I。加上正染为F4/80的细胞的增加，巨噬细胞的标记物（图2C-E，H，I），后肢固定似乎刺激小腿肌肉萎缩，涉及局部炎症反应，包括巨噬菌体积累。然后，我们试图检查LCC，按摩一样的机械干预，调节这种固定引起的肌肉炎症和萎缩。

讨论

我们描述了一种应用按摩样机械刺激的方法，这种方法具有抗炎作用。与之前报告的系统相比，我们的系统具有以下优势。首先，以前的研究没有定量定义施加^{的机械力2}或根据人体表面的测量确定其幅度，而不是^组织10内。相比之下，我们使用血压遥测仪测量肌肉压力。其次，我们设备的简单结构（图1B）使我们能够以相对较低的成本构建具有高一致性和可重复性的系统（图3A）。第三，我们的干预（LCC）与肌肉压力变化（50毫米汞^柱15）相关的身体活动（轻度肌肉收缩）我们的方法将提供一个科学的基础，按摩样的干预作为一个可能的治疗/预防程序，减少缺乏身体活动的^缺点16。

我们协议中最关键的步骤是定位鼠标后肢（协议步骤3.3）。我们需要在垂直于小腿肌肉的方向应用LCC;否则，肌肉组织将被部分挤压和损坏，即使使用66...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铝丝	DAISO JAPAN	B028	铝丝用于避免被电线逃逸限制
血压遥测仪	Millar	SPR-671	血压遥测仪用于测量肌内压。
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI 是一种荧光探针，常用于荧光显微镜检查 DNA 染色。
山羊抗兔 Alexa Fluor 488 （稀释比例，1：500）	Invitrogen	A11034	抗体，用于免疫组织化学染色。
山羊抗大鼠 Alexa Fluor 568 （稀释比例，1：500））	Invitrogen	A11077	抗体，用于免疫组织化学染色。
ImageJ	NIH	N/A	图像分析软件
LabChart8	ADInstrumens		用于获取生物信号的分析软件。
Prolong gold	Thermo Fisher Scientific	P36930	Prolong gold 用于封片染色样品。
Protein Block 无血清	Dako	X090930-2	用于阻断免疫组织化学程序中的非特异性背景染色。
大鼠单克隆抗层粘连蛋白-2 抗体（稀释比，1：1000）	Sigma Aldrich	L0663	抗体，用于免疫组织化学染色。
大鼠单克隆抗 F4/80 抗体（稀释比，1：500）	Abcam	ab6640	免疫组织化学染色抗体。
兔多克隆抗 MCP-1 抗体（稀释比，1：1000）	Abcam	ab25124	免疫组织化学染色抗体。
兔多克隆抗 TNF-α; 抗体（稀释比，1：1000）	Abcam	ab66579	免疫组织化学染色抗体。
手术胶带	3M 日本	1530EP-0	手术胶带用于限制关节运动。