本文介绍了对小鼠小腿施加特定机械负荷以及监测伴随发生的肌内压变化的实验方案。我们开发的实验系统可用于研究体育锻炼和按摩有益作用背后的机制。
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方法文章
在小鼠小腿上施加一致的按摩样扰动并监测由此产生的肌内压变化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
按摩通常被认为有助于缓解疼痛和炎症。尽管先前的研究已报道了按摩对骨骼肌具有抗炎作用，但其背后的分子机制尚不明确。我们近期开发了一种简单的装置，用于施加局部周期性压缩（LCC），该装置可产生不同振幅的肌内压力波。利用该装置，我们已证明LCC可在原位调节巨噬细胞的炎症反应，并减轻因制动引起的肌肉萎缩。本文中，我们描述了将LCC作为类似按摩的干预手段，用于缓解小鼠后肢骨骼肌因制动所致炎症和萎缩的优化与应用方案。我们所建立的实验方案有助于研究体力活动和按摩益处背后的机制。尽管仍需进一步完善以开展更全面的研究，但我们的实验系统为解析机械力调控肌肉稳态的分析方法提供了一个原型。
引言
按摩通常被认为对竞技运动员和非运动员均有缓解疼痛和改善身体机能的作用1,2。事实上，先前的研究表明，按摩可抑制局部炎症3，并促进运动后肌肉损伤的恢复4,5。然而，按摩有益作用背后的分子机制在很大程度上仍不清楚。
关于按摩机制研究的一个难点在于按摩样干预测试方法的可重复性。在以往的研究中，模拟按摩的实验操作大多涉及使用操作者身体部位（如手掌和手指）施加物理干预6,7,8。这使得其作用强度、频率、持续时间和作用方式难以精确重复。
已有多种设备被开发用于对目标组织施加明确的机械负荷。例如，Zeng 等人开发了一种气动系统，可对大鼠后肢进行纵向机械加载9；Wang 等人开发了一种机电装置，能够以类似按摩的方式对大鼠和兔的后肢施加机械负荷，并具有实时反馈控制功能10。与这些装置相比，我们的局部周期性压缩（LCC）系统更为简单，构建成本显著降低。尽管如此，我们仍能重现轻度肌肉收缩期间产生的肌内压变化。利用该装置，我们已成功证明类似按摩的机械干预可调节局部间质液动力学，并缓解制动引起的肌肉萎缩11。
本文详细描述了我们的设备及实验方案，该方案可能有助于探索运动和按摩产生积极效应背后的分子机制。方案的示意图见补充图1。
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方案
所有动物实验均在残疾人国家康复中心机构动物护理和使用委员会的批准下进行。
1. 小鼠双侧后肢的固定
注意：实验使用雄性C57BL/6小鼠，在适应环境至少7天后，于11至12周龄时进行实验。
- 使用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）充分麻醉小鼠，确保小鼠对后肢脚趾夹捏无反应。
注意：为尽量减少对小鼠摄食活动的可能影响，固定操作应在上午10点至下午7点之间进行。 - 将小鼠仰卧固定，膝关节伸展，踝关节跖屈，在其双侧后肢上贴上手术胶带。
- 在小鼠躯干L4-5脊柱水平处放置一根铝丝（见材料表），并将铝丝以螺旋方式缠绕于后肢，每圈螺旋层之间保持5 mm间隙（图1A）。注意不要缠绕过紧，避免影响局部血流。
- 为尽量减少小鼠脱离固定的可能性，通过手动调整铝丝的形状，将髋关节固定于90°外展位。
- 将小鼠放回原有笼具。3小时后，确认其已从麻醉中恢复，并能正常进食和饮水。
- 每笼饲养3至6只固定后的小鼠，饲养密度与固定前相同。
2. 小鼠腓肠肌肌肉内压力的测量
注意：在结合LCC的压力监测实验中，测试了多种不同重量的圆柱形单位（36 g、66 g 和 200 g）。该测量与分析肌肉炎症和萎缩的实验分别进行（详见步骤3-5），即用于压力测量的小鼠不用于组织学分析。
- 由于压力测量涉及比后肢布线和负荷控制压缩（LCC）更为侵入性的操作（例如皮肤切口和针头插入），需使用三种麻醉剂的混合物（腹腔注射 medetomidine 0.75 mg/kg、midazolam 4.0 mg/kg 和 butorphanol 5.0 mg/kg）。确保小鼠对后肢脚趾夹捏无反应。
- 将小鼠置于俯卧位，在使用电动剃须刀脱毛并用70%乙醇和氯己定浸润的吸水棉对皮肤表面进行半消毒后，用手术刀在后侧小腿处做一2 mm切口。
- 以与皮肤表面成钝角（150°–170°）的方向将20 G留置针插入腓肠肌内。
- 以针头的塑料套管作为引导，将血压遥测仪的传感器（参见材料表）置入腓肠肌中部肌腹，随后将套管从肌肉中取出。
- 使用4-0尼龙缝线缝合皮肤后，在小鼠小腿上施加不同重量的圆柱形单元进行LCC处理（详见步骤3），并使用生物信号分析软件监测肌内压力（参见材料表）。
- 将小鼠放回原有笼具中。3小时后，确认其已从麻醉/镇痛状态中恢复 ，并能正常获取食物和饮水。
3. 小鼠小腿局部周期性压缩（LCC）
- 除肌肉内压测量和处死（即颈椎脱位）外，均使用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）进行麻醉。
- 将小鼠从后肢固定装置中松解，使其俯卧，膝关节伸展，踝关节跖屈，使小腿朝上。不要将小鼠后肢固定在平台上。
- 通过垂直移动覆盖有缓冲垫的圆柱形重物单元（图1B）对小腿施加低强度循环载荷（LCC），频率为1 Hz，每天30分钟，持续7天（图1C）。
- 每次每日LCC处理后，重新固定小鼠后肢。
4. 腓肠肌的免疫组织化学分析
- 通过腹腔注射三种麻醉剂混合物（美托咪啶 0.75 mg/kg、咪达唑仑 4.0 mg/kg 和布托啡诺 5.0 mg/kg）实施充分的麻醉/镇痛后，采用颈椎脱位法处死小鼠。
- 脱除小腿后侧毛发后，做皮肤切口，使用手术剪将腓肠肌从胫腓骨分离，并迅速将其在最佳切割温度包埋剂中冷冻。
- 使用冷冻切片机在载玻片上制备腓肠肌的冷冻切片样本，分析前将样本储存在 -80 °C 冰箱中。
- 从冰箱中取出待分析的腓肠肌冷冻切片样本，在室温下空气干燥以进行脱水处理。
- 使用液体阻断笔在载玻片上画出包含所有冷冻切片的区域，该圆圈可防止溶液从载玻片上流失。
- 将载玻片置于盛有湿水纸巾以形成湿润环境的托盘中，避免样本干燥。
- 每张切片加入 100 µL 封闭缓冲液（含 0.25% 酪蛋白、载体蛋白和 0.015 M 叠氮化钠的磷酸盐缓冲液 (PBS)），室温孵育 30 分钟。
- 用 PBS-T（含 0.1% 聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯（见材料表）的 PBS）孵育 5 分钟，重复清洗两次。
- 每份样本加入 100 µL 用 PBS 稀释的一抗溶液，盖上托盘盖子，室温孵育过夜。
- 用 PBS-T 清洗三次，每次 5 分钟。
- 每份样本加入 100 µL 用 PBS 稀释的二抗溶液，室温孵育 1 小时。
注意：进行抗层粘连蛋白染色时，使用 Alexa Fluor 568 标记的二抗；进行抗 F4/80、抗 MCP-1 和抗 TNF-α 染色时，使用 Alexa Fluor 568 或 488 标记的二抗。 - 用 PBS-T 清洗三次，每次 5 分钟。
- 每份样本加入 100 µL 用 PBS-T 稀释的 DAPI 溶液，室温孵育 3 分钟。
- 用 PBS-T 清洗三次，每次 5 分钟。
- 用封片剂封片，并加盖盖玻片。
5. 腓肠肌的组织形态计量学分析
- 将样本载玻片置于荧光显微镜（参见材料表）上，使用20×物镜及适当的滤光片观察样本（DAPI-B：激发波长360/40 nm，发射波长460/50 nm；GFP-B：激发波长470/40 nm，发射波长535/50 nm；FRITC：激发波长540/25 nm，发射波长605/55 nm）。
- 使用图像分析软件（参见材料表），测量每根肌纤维的横截面积（CSA），并计数F4/80、MCP-1和TNF-α阳性细胞的数量。
注意：通过勾画抗层粘连蛋白-2免疫染色所显示的基底膜内缘来确定每根肌纤维的横截面积。
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结果
与我们之前的观察结果一致12，后肢固定显著降低了腓肠肌肌纤维的横截面积（CSA）（图2A,B）。此外，我们的免疫荧光染色分析显示，在固定后肢的腓肠肌组织中，表达MCP-1和TNF-α的细胞数量显著增加；这两种因子在调控炎症过程中发挥关键作用13,14（MCP-1：图2C,F,H；TNF-α：图2D,G,I）。结合F4/80阳性染色细胞（巨噬细胞标志物）的增加（图2C-E,H,I），后肢固定似乎引发了涉及局部炎症反应（包括巨噬细胞积聚）的小腿肌肉萎缩。随后，我们进一步探讨了LCC（一种类似按摩的机械干预）是...
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讨论
我们描述了一种施加类似按摩的机械刺激的方法，该方法具有抗炎作用。与以往报道的方法相比，我们的系统具有以下优势。首先，以往的研究未对所施加的机械力进行定量定义2，或仅基于体表测量值来确定其强度，而非组织内部的测量10。相比之下，我们使用血压遥测仪测量了肌肉内的压力。其次，我们设备的结构简单（图1B），使得我们能够以相对较低的成本构建出高度一致且可重复的系统（图3A）。第三，我们的干预措施（LCC）在肌肉内压力变化（50 mmHg15）方面与身体活动（轻度肌肉收缩）相关。我们的研究将为类似按摩的干预措施提供科学依据，使其可能成为一种减轻久坐不动弊端的治疗或预防手段16。
本方案中最关键的步骤是小鼠后肢的定位（方案步骤 3.3）。我们需要将线性压缩装置（LCC）垂直于小腿肌肉方向施...
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披露
作者声明，本稿件不存在任何利益冲突。
致谢
我们感谢中西K.、滨本K.、久米N.和鹤见K.在项目全程中的一贯支持。本工作部分得到了日本厚生劳动省内部研究基金、日本学术振兴会科学研究费补助金以及日本文部科学省2015-2019年度私立大学战略研究基础强化推进事业（S1511017）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铝线 | DAISO JAPAN | B028 | 使用铝线以避免因导线造成的限制性逃逸 |
| 血压遥测仪 | 米勒 | SPR-671 | 使用血压遥测仪测量肌内压。 |
| DAPI | 赛默飞世尔科技 | D1306 | DAPI 是一种常用于荧光显微镜下DNA染色的荧光探针。 |
| 山羊抗兔 Alexa Fluor 488（稀释比例，1:500） | Invitrogen | A11034 | 免疫组织化学染色用抗体 |
| 山羊抗大鼠 Alexa Fluor 568（稀释比例，1:500） | Invitrogen | A11077 | 免疫组织化学染色用抗体 |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | N/A | 图像分析软件 |
| LabChart8 | ADInstrumens | 用于获取生物信号的分析软件。 | |
| 延长金 | 赛默飞世尔科技 | P36930 | Prolong Gold 用于封固染色样本。 |
| 蛋白封闭剂 无血清 | Dako | X090930-2 | 用于免疫组织化学实验中阻断非特异性背景染色。 |
| 大鼠单克隆抗层粘连蛋白-2抗体（稀释比例，1:1000） | Sigma Aldrich | L0663 | 免疫组织化学染色用抗体 |
| 大鼠单克隆抗F4/80抗体（稀释比例，1:500） | Abcam | ab6640 | 免疫组织化学染色用抗体 |
| 兔多克隆抗MCP-1抗体（稀释比例，1:1000） | Abcam | ab25124 | 免疫组织化学染色用抗体 |
| 兔多克隆抗TNF-α 抗体（稀释比例，1:1000） | Abcam | ab66579 | 免疫组织化学染色用抗体 |
| 手术胶带 | 3M 日本 | 1530EP-0 | 手术胶带用于限制关节活动。 |
参考文献
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