在小鼠小腿上施加一致的按摩样扰动并监测由此产生的肌内压变化

摘要

本文介绍了对小鼠小腿施加特定机械负荷以及监测伴随发生的肌内压变化的实验方案。我们开发的实验系统可用于研究体育锻炼和按摩有益作用背后的机制。

摘要

按摩通常被认为有助于缓解疼痛和炎症。尽管先前的研究已报道了按摩对骨骼肌具有抗炎作用，但其背后的分子机制尚不明确。我们近期开发了一种简单的装置，用于施加局部周期性压缩（LCC），该装置可产生不同振幅的肌内压力波。利用该装置，我们已证明LCC可在原位调节巨噬细胞的炎症反应，并减轻因制动引起的肌肉萎缩。本文中，我们描述了将LCC作为类似按摩的干预手段，用于缓解小鼠后肢骨骼肌因制动所致炎症和萎缩的优化与应用方案。我们所建立的实验方案有助于研究体力活动和按摩益处背后的机制。尽管仍需进一步完善以开展更全面的研究，但我们的实验系统为解析机械力调控肌肉稳态的分析方法提供了一个原型。

引言

按摩通常被认为对竞技运动员和非运动员均有缓解疼痛和改善身体机能的作用^1,2。事实上，先前的研究表明，按摩可抑制局部炎症³，并促进运动后肌肉损伤的恢复^4,5。然而，按摩有益作用背后的分子机制在很大程度上仍不清楚。

关于按摩机制研究的一个难点在于按摩样干预测试方法的可重复性。在以往的研究中，模拟按摩的实验操作大多涉及使用操作者身体部位（如手掌和手指）施加物理干预^6,7,8。这使得其作用强度、频率、持续时间和作用方式难以精确重复。

已有多种设备被开发用于对目标组织施加明确的机械负荷。例如，Zeng 等人开发了一种气动系统，可对大鼠后肢进行纵向机械加载⁹；Wang 等人开发了一种机电装置，能够以类似按摩的方式对大鼠和兔的后肢施加机械负荷，并具有实时反馈控制功能¹⁰。与这些....

方案

所有动物实验均在残疾人国家康复中心机构动物护理和使用委员会的批准下进行。

1. 小鼠双侧后肢的固定

注意：实验使用雄性C57BL/6小鼠，在适应环境至少7天后，于11至12周龄时进行实验。

1. 使用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）充分麻醉小鼠，确保小鼠对后肢脚趾夹捏无反应。
   注意：为尽量减少对小鼠摄食活动的可能影响，固定操作应在上午10点至下午7点之间进行。
2. 将小鼠仰卧固定，膝关节伸展，踝关节跖屈，在其双侧后肢上贴上手术胶带。
3. 在小鼠躯干L4-5脊柱水平处放置一根铝丝（见材料表），并将铝丝以螺旋方式缠绕于后肢，每圈螺旋层之间保持5 mm间隙（图1A）。注意不要缠绕过紧，避免影响局部血流。
4. 为尽量减少小鼠脱离固定的可能性，通过手动调整铝丝的形状，将髋关节固定于90°外展位。
5. 将小鼠放回原有笼具。3小时后，确认其已从麻醉中恢复，并能正常进食和饮水。
6. 每笼饲养3至6只固定后的小鼠，饲养密度与固定前相同。

2. 小鼠腓肠肌肌肉内压力的测量

注意：在结合LCC的压力监测实验中，测....

结果

与我们之前的观察结果一致¹²，后肢固定显著降低了腓肠肌肌纤维的横截面积（CSA）（图2A,B）。此外，我们的免疫荧光染色分析显示，在固定后肢的腓肠肌组织中，表达MCP-1和TNF-α的细胞数量显著增加；这两种因子在调控炎症过程中发挥关键作用^13,14（MCP-1：图2C,F,H；TNF-α：图2D,G,I）。结合F4/80阳性染色细胞（巨噬细胞标志物）的增加（图2C-E,H,I），后肢固定似乎引发了涉及局部炎症反应（包括巨噬细胞积聚）的小腿肌肉萎缩。随后，我们进一步探讨了LCC（一种类似按摩的机械干预）是.......

讨论

我们描述了一种施加类似按摩的机械刺激的方法，该方法具有抗炎作用。与以往报道的方法相比，我们的系统具有以下优势。首先，以往的研究未对所施加的机械力进行定量定义²，或仅基于体表测量值来确定其强度，而非组织内部的测量¹⁰。相比之下，我们使用血压遥测仪测量了肌肉内的压力。其次，我们设备的结构简单（图1B），使得我们能够以相对较低的成本构建出高度一致且可重复的系统（图3A）。第三，我们的干预措施（LCC）在肌肉内压力变化（50 mmHg¹⁵）方面与身体活动（轻度肌肉收缩）相关。我们的研究将为类似按摩的干预措施提供科学依据，使其可能成为一种减轻久坐不动弊端的治疗或预防手段¹⁶。

本方案中最关键的步骤是小鼠后肢的定位（方案步骤 3.3）。我们需要将线性压缩装置（LCC）垂直于小腿肌肉方向施.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铝线	DAISO JAPAN	B028	使用铝线以避免因导线造成的限制性逃逸
血压遥测仪	米勒	SPR-671	使用血压遥测仪测量肌内压。
DAPI	赛默飞世尔科技	D1306	DAPI 是一种常用于荧光显微镜下DNA染色的荧光探针。
山羊抗兔 Alexa Fluor 488（稀释比例，1:500）	Invitrogen	A11034	免疫组织化学染色用抗体
山羊抗大鼠 Alexa Fluor 568（稀释比例，1:500）	Invitrogen	A11077	免疫组织化学染色用抗体
ImageJ	美国国立卫生研究院	N/A	图像分析软件
LabChart8	ADInstrumens		用于获取生物信号的分析软件。
延长金	赛默飞世尔科技	P36930	Prolong Gold 用于封固染色样本。
蛋白封闭剂 无血清	Dako	X090930-2	用于免疫组织化学实验中阻断非特异性背景染色。
大鼠单克隆抗层粘连蛋白-2抗体（稀释比例，1:1000）	Sigma Aldrich	L0663	免疫组织化学染色用抗体
大鼠单克隆抗F4/80抗体（稀释比例，1:500）	Abcam	ab6640	免疫组织化学染色用抗体
兔多克隆抗MCP-1抗体（稀释比例，1:1000）	Abcam	ab25124	免疫组织化学染色用抗体
兔多克隆抗TNF-α 抗体（稀释比例，1:1000）	Abcam	ab66579	免疫组织化学染色用抗体
手术胶带	3M 日本	1530EP-0	手术胶带用于限制关节活动。