整合素张力在多种细胞功能中发挥重要作用。利用一种整合式张力传感器，可对整合素张力进行皮牛顿（pN）级灵敏度的校准，并以亚微米分辨率成像。
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本文内容
摘要
摘要
由整合素-配体键传递的分子张力是整合素通路中的基本力学信号，在多种细胞功能与行为中发挥重要作用。为了以高力敏感度和空间分辨率对整合素张力进行校准与成像，我们开发了一种整合式张力传感器（ITS），这是一种基于DNA的荧光张力传感器。当ITS承受分子张力时会被激活并产生荧光，从而在分子水平上将力学信号转化为荧光信号。ITS激活的张力阈值可在10–60 pN范围内调节，恰好覆盖细胞内整合素张力的动态范围。在修饰有ITS的基底上，可通过荧光对贴壁细胞的整合素张力进行可视化，并以亚微米分辨率成像。ITS还可与活细胞和固定细胞的细胞结构成像兼容。该传感器已成功应用于血小板收缩和细胞迁移的研究。本文详细描述了ITS的合成及其在整合素介导的细胞力研究中的应用流程。
引言
细胞依赖整合素与细胞外基质黏附并施加细胞力。整合素介导的细胞黏附和力传递对细胞铺展1,2、迁移3,4以及存活5,6,7至关重要。从长期来看，整合素生物力学信号还影响细胞增殖8,9,10和分化11,12。研究人员已开发出多种方法用于测量和绘制细胞-基质界面处整合素传递的细胞力。这些方法基于弹性基底13、微柱阵列14或原子力显微镜（AFM）15,16。弹性基底和微柱方法依赖于基底的形变来报告细胞应力，在空间分....
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方案
本研究所述所有方法均已获得爱荷华州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC，8-16-8333-I）的批准。
1. 整合张力传感器的合成
- 定制并订购ssDNA（参见材料表）。
注意：ssDNA序列如下。上链为 /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2/。下链序列如下：
12 pN ITS：/5Cy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/
23 pN ITS：/5Cy3/GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT/ CCC
33 pN ITS：/5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/ CCT CCC
43 pN ITS：/5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
54 pN ITS：/5Biosg//iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
其中，/5ThioMC6-D/ 表示5'端的硫醇修饰C6 S-S（二硫键），/3BHQ_2/ 表示3'端的Black Hole Quencher 2。/3Bio/、/5Biosg/ 和 /iBiodT/ 分别表示在3'端、5'端以及内部DNA胸腺嘧啶上的生物素化修饰。/iCy3/ 表示Cy3荧光染料插入ssDNA的内部骨架。这些代码由本实验所用的特....
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结果
利用ITS技术，捕获了鱼类角质细胞的整合素张力图谱。结果显示，角质细胞在迁移过程中沿两条受力轨迹产生整合素张力（图2A）。该受力图谱的空间分辨率为0.4 µm（图2B）。高整合素张力主要集中于细胞后缘（图3A）。ITS还揭示了不同类型细胞具有不同的特异性张力模式。例如，非运动性细胞NIH-3T3所形成的整合素张力模式（图3B）与快速迁移的角质细胞显著不同。
通过免疫染色，对鱼类角质细胞的黏着斑及整合素张力进行了共聚焦成像（图4A）。Wang 等人对角质细胞中整合素张力与细胞结构之间的关系进行了详细研究25。在 .......
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讨论
ITS 是一种在合成与应用两方面均具有高度可及性且功能强大的细胞力学作图技术。在所有材料齐备的情况下，ITS 可在 1 天内完成合成。实验过程中，在细胞接种前仅需进行三步表面包被操作。近期，我们进一步将包被步骤简化为一步，即通过将 ITS 直接连接至牛血清白蛋白，从而实现 ITS 在玻璃或聚苯乙烯表面的直接物理吸附33。ITS 可将细胞力学信号的荧光强度提升至与细胞结构成像相当的水平。其便捷的合成与样品制备流程、对显微镜设备要求适中，以及对细胞力学信号的高度灵敏性，使 ITS 成为研究细胞力学的一种稳健且可靠的技术。本文中，我们提供了一套完整的 ITS 合成与应用方案。
将 RGD 配体与 ssDNA 偶联是 ITS 合成中最关键的步骤。如实验方案部分所述，磺基-SMCC 上的 NHS 酯在水中不稳定。磺基-SMCC 在水中溶解所需时间越长，越多的磺基-SMCC 会因水解而失去 NHS 酯，变成“失活”分子，这类分子可通过马来酰亚胺-巯基反应与 DNA 偶联，但无法与 RGD-NH2 发生偶联。因此，大量 DNA.......
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披露
作者无任何披露信息。
致谢
本工作由艾奥瓦州立大学提供的启动资金以及美国国家普通医学科学研究所（R35GM128747）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BSA-生物素 | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| 中性亲和素（Neutravidin） | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| 链霉亲和素（Streptavidin） | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| 上链DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | 客户设计。DNA序列见“实验方案”部分 |
| 下链DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | 客户设计。DNA序列见“实验方案”部分。 |
| 磺基-SMCC（sulfo-SMCC） | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| 含氨基的环状肽RGD | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM培养基 | ATCC | 62996227 | |
| 胎牛血清（FBS） | ATCC | 302020 | |
| 青霉素（Penicillin） | gibco | 15140122 | |
| 三(2-羧乙基)膦（TCEP） | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 μL 培养皿 | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | 分光光度计 |
| SE410 高型风冷垂直蛋白电泳仪 | Hoefer | SE410-15-1.5 | 用于电泳的设备 |
| CHO-K1细胞系 | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3细胞系 | ATCC | CRL-1658 | |
| 抗Vinculin抗体 | EMD Millipore | 90227 | 用于Vinculin免疫染色的一抗 |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）超纯二抗，Alexa Fluor 488标记 | Invitrogen | A28175 | 用于Vinculin免疫染色的二抗 |
| Alexa Fluor 647标记的鬼笔环肽（Phalloidin） | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | 显微镜 |
参考文献
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal ....
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重印与许可
