工程生物膜的三维造型

Summary

本文介绍了一种将低成本商用3D 打印机转换为细菌3D 打印机的方法, 该打印机可促进图案生物膜的打印。介绍了制备生物打印机和生物油墨的所有必要方面, 以及评估生物膜形成的验证方法。

Abstract

生物膜是细菌的集合体, 嵌入在自产生的空间模式的细胞外基质中。生物膜内的细菌会产生增强的抗生素耐药性, 这对健康构成潜在的危害, 但也可能有利于环境应用, 如饮用水的净化。抗菌疗法和生物膜启发应用的进一步发展将需要开发可重复的、可工程化的生物膜制造方法。近年来, 一种利用改进型三维 (3D) 打印机制备细菌油墨的生物膜的新方法。本文介绍了构建这种高效、低成本的3D 生物打印机所需的步骤, 它在细菌诱导材料加工中提供多种应用。该协议从一个经过调整的商用3D 打印机开始, 在这种打印机中, 挤出机已被连接到注射器泵系统的生物墨水分配器所取代, 从而实现了可控的、连续的生物墨水流动。为了开发一种适用于生物膜印刷的生物油墨, 工程中的大肠杆菌被悬浮在海藻酸盐溶液中, 使其与含钙表面发生凝固。在印刷基板中加入诱导剂化学品会推动生物膜蛋白在印刷生物油墨中的表达。该方法可对由印刷生物膜的离散层组成的各种空间图案进行3D 打印。这种空间控制的生物膜可以作为模型系统, 并可以在对社会产生广泛影响的多个领域找到应用, 包括抗生素耐药性预防或饮用水净化等。

Introduction

由于空间图案材料的市场不断增加, 目前越来越需要开发环保、可持续的空间图案^材料生产解决方案1。本文介绍了一种简单、经济的生产此类材料的方法, 因此提供了大量的未来应用。这里介绍的方法允许使用含有活细菌的生物油墨对空间图案结构进行三维 (3D) 打印。细菌在印刷结构中保持一周以上的活力, 使细菌能够进行自然或工程的代谢活动。因此, 印刷细菌可以在印刷结构中产生和沉积所需的成分, 例如创建一个功能交联生物膜²。

生产先进材料的传统方法涉及高能源支出 (如高温和高压), 并可能产生大量化学废物, 往往是需要成本广泛使用的有毒物质 3 ^,4。相比之下, 多种细菌物种能够生产出容易适用于各种行业的材料。这些材料包括聚合物, 如聚羟基烷酸盐 (pha)⁵或聚 (乙二醇-异丙基)⁽pgla) 6, 细菌纤维素⁷, 细菌混凝土材料⁸, 仿生复合材料⁹,淀粉基胶粘剂¹⁰台, 或生物基

Protocol

1. 将商用3D 打印机转换为3D 生物打印机

1. 从打印机机架上取下商用3d 打印机 (材料表) 的挤出机和加热器, 然后从主电路板上拔下控制这些元件的接线 (图 1 a)。由于控制打印机工作温度的传感器需要能够与打印机软件进行通信, 因此请从打印软件中删除延迟打印直到达到工作温度的算法。
2. 通过硅管 (内径为1毫米) 将移液器尖端 (200μl 尖端) 连接到装入注射器泵的5毫升注射器上。将移液器尖端安装到3D 打印机挤出机头上, 以替代原始挤出机 (图 1 b)。
3. 如果将使用多种类型的生物墨水, 请将额外的管道系统和移液器尖端安装到打印机上。

2. 3D 打印的基板准备

1. 将 5m Ccl 2 溶液的 4 ml 加入到溶于 Luria-Bertani 肉汤 (lb) 培养基中的 1% wv agar 的 400 ml 中, 辅以适当的抗生素和诱导剂 (这里为34μgml 氯霉素和0.5% 鼠李糖)。
2. 将 LB-agar 溶液的20毫升分配到每个150毫米 X15 毫米 Petri 培养皿中。在室温下干燥 30分钟, 盖子半开。
   注: 通过将这些打印基板存储在4°c 中最多几天, 可以在此处....

Results

成功的3D 生物膜打印的第一步是将商用3D 打印机转换为生物打印机。这种转换是通过拆卸打印机的挤出机和加热器 (设计用于使用聚合物油墨进行打印), 并将其替换为适合于印刷含有活菌的生物油墨的组件来实现的 (图 1 a)。挤出机被连接到注射器泵的管道系统上的移液器尖端 (或吸头, 如果在印刷过程中将使用多个生物油墨) 所取代 (图 1 b)。商业打印机成功转换为生物打印机的依据是能够将所需的生物油墨通过注射器系统从注射器泵和移液头转移到打印表面, 而不会泄漏或加热生物油墨。如果管材在印刷过程中由于生物油墨的流动而膨胀, 则可能会被壁厚的管材所取代。需要注意的是, 这种打印技术应该能够与任何类型的商业3D 打印机, 其管道可以连接到打印头。

三维生物打印机可以在各种二维 (2D) 和三维形状中创建细菌包封水凝胶 (

Discussion

这里介绍的工程生物膜3D 打印协议有两个关键步骤。首先是琼脂印刷表面的制备, 这是产生特定印刷分辨率的最关键因素。重要的是要确保打印表面是平的, 并且打印头上的移液器尖端位于表面的正确高度。如果表面不平整, 则在打印过程中工作距离会发生变化。如果工作距离小于 0.1 mm, Ccl₂溶液可能进入移液器尖端内, 导致水凝胶形成, 导致移液器尖端堵塞。如果工作距离超过 0.3 mm, 则无法连续打印凝胶。本研究的最佳工作距离为 0.2 mm, 制备扁角印刷表面的好方法是使用较大直径的 Petri 培养皿 (直径150毫米的 Petri 培养皿, 而不是直径90毫米的印版), 将印版放在平桌上, 倒琼脂解决方案, 速度快, 速度均匀, 避免在凝固过程中移动琼脂板。

第二个关键步骤是选择所需的打印参数, 包括泵送速度、所使用的生物油墨的粘度和打印头速度, 这些参数决定了所产生的打印分辨率。要有效地选择这些参数, 用户可以以恒定的挤压速率采样几个用于打印头速度的极值, 并注意打印的水凝胶在每一组条件下的宽度。然后, 用其他4个挤出速率重复本实验。接下来, 采用为应用产生.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D打印机	CoLiDo	3D-P套件
3D打印软件	CoLiDo	Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
脂	Sigma-Aldrich	05040
CaCl2< / sub>二水合	Sigma-Aldrich	C7902
机	Eppendorf	5810 R
霉素	Sigma-Aldrich	3886.1
LB 肉汤粉	Sigma-Aldrich	L3022
轨道摇床	VWR	89032-092	型号 3500
培养皿	VWR	25384-326	150 x 15 mm
鼠李糖	Sigma-Aldrich	83650
硅管	VWR	DENE 3100103/25
注射泵	ProSense B.V.	NE-300
海藻酸钠	Sigma-Aldrich	W201502
柠檬酸钠二氢	Sigma-Aldrich	71498
氢氧化钠	VWR	28244.295