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生成基于三维胶原的水凝胶以分析神经系统发育过程中的轴突生长与行为

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DOI：

10.3791/59481

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2019年6月25日

 , 
1Molecular and Cellular Neurobiotechnology, Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), Parc Científic de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Physiology, and Immunology, Universitat de Barcelona, 3Center for Networked Biomedical Research on Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 4Institute of Neuroscience, University of Barcelona

本文内容

摘要

本文提供了一种在三维基质中分析生长轴突行为的方法，以模拟其自然发育过程。

摘要

本方案利用天然I型胶原蛋白制备三维（3-D）水凝胶，用于监测和分析轴突生长。该方案的核心是将胚胎期或出生后早期啮齿类动物脑组织的小片段培养在由大鼠尾腱来源的I型胶原蛋白形成的三维水凝胶中，该水凝胶具有特定的孔隙率。将组织片段培养于水凝胶内，并与特定的脑组织片段或经基因修饰的细胞聚集体相对置，使其产生并分泌可在多孔基质中形成浓度梯度的分子。本方案步骤简单且可重复，但在实施过程中需谨慎考虑若干关键步骤。此外，在通过免疫细胞化学方法固定后，可直接利用相差显微镜或单光子/多光子荧光显微镜对生长中轴突的行为进行实时监测与分析。

引言

神经元的轴突以轴突生长锥为末端，通过胚胎的细胞外基质（ECM）沿特定路径长距离迁移，以到达其正确的靶点。生长锥位于轴突的远端，具有感知细胞所处物理和分子环境的特化功能1,2。从分子角度来看，生长锥的导向至少依赖于四种不同的分子机制：由不同轴突导向信号分子触发的接触性吸引、化学吸引、接触性排斥和化学排斥3,4,5,6。接触介导的过程可在二维（2D）微图案化基底（例如含有分子的条带7,8或斑点9）的培养体系中部分观察到。然而，轴突还可通过感知环境中引导细胞释放的多种吸引性和排斥性分子，以非扩散方式导航至其靶点4,5,10。本文中，我们介绍一种简便的三维（3D）培养方法，用于检测某种分泌型分子是否对发育中的轴突产生化学排斥或化学吸引效应。

最早的研究所采用的轴突导向线索旨在利用三维（3-D）基质中的组织块培养来生成模拟体内条件的浓度梯度11,12。该方法结合体内实验，使得研究人员得以鉴定出四类主要的导向分子家族：Netrin、Slit、Semaphorin 和 Ephrin4,5,6。生长中的轴突整合这些分子信号及其他因素13，从而触发黏附复合物的动态变化，并通过细胞骨架转导机械力14,15,16。为了在三维培养体系中建立用于轴突导航的分子浓度梯度，早期研究者使用了血浆凝块基质17，该方法也曾用于器官型脑片制备18。然而，1958年，有研究报道了一种新的制备三维胶原蛋白水凝胶的方案，可用于Maximow装置19——一种适用于多种显微观察研究的培养平台20。另一项先驱性研究则报道了使用胶原凝胶包埋人成纤维细胞，以研究在伤口愈合过程中成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化21。与此同时，Lumsden和Davies应用牛皮来源的胶原蛋白分析神经生长因子（NGF）对感觉神经纤维导向的潜在作用22。随着不同公司和实验室开发出新的培养平台（例如多孔板），胶原蛋白培养体系也被适配于这些新型设备6,23,24,25,26。与此同时，源自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞系的细胞外基质（ECM）提取物也被商业化提供，以进一步拓展此类研究27。

近年来，已开发出多种利用三维水凝胶（如胶原蛋白、纤维蛋白等）生成具有轴突导向潜在作用的分子梯度的技术方案28。另一种方法是将候选分子以不同浓度固定在多孔基质中（例如NGF29），或通过在三维水凝胶的局部区域培养分泌该分子的细胞聚集体，从而形成径向梯度4,23,24,25,26。本实验方案将详细阐述最后一种方法。

本文介绍的方法是一种基于小鼠胚胎脑组织三维水凝胶培养中轴突生长分析的简便、快速且高度可重复的技术。与其他方法相比，该方案特别适合未经专门训练的研究人员，经过短期培训（1-2周）即可完全掌握。在本方案中，我们首先从成年大鼠尾部提取胶原蛋白，用于制备三维基质，随后将基因修饰的细胞聚集体与胚胎神经组织相对放置并进行共培养。这些细胞聚集体可形成候选分子的径向化学浓度梯度，从而诱导生长中轴突产生响应。最后，可通过相差显微镜直接观察，或 alternatively 采用免疫细胞化学方法，便捷地评估该分子对生长轴突的影响。

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方案

所有动物实验均在巴塞罗那大学动物实验伦理委员会（CEEA）的指南和规程下进行，本研究中啮齿类动物使用的方案已通过巴塞罗那大学动物实验伦理委员会（CEEA）的审查和批准（CEEA批准编号 #276/16 和 141/15）。 

1. 大鼠尾部胶原蛋白的纯化

  1. 在遵循伦理准则处死动物后，收集成年 Sprague-Dawley 大鼠尾部（8–9 周龄），用 95% 乙醇冲洗。将 2–4 条尾部置于冰上（4 °C） °C）并在操作过程中保持冰上覆盖。  
  2. 为获取尾腱，使用止血钳夹住尾部最尾端的尾椎骨，并用第二把止血钳夹住距离第一把约5–7 mm处的尾部并施加压力。通过同时扭转两把止血钳使尾部断裂。操作时可反复折叠/展开尾椎骨数次，直至其断裂。
  3. 用止血钳缓慢拉出椎骨，使肌腱随其鞘膜一并脱离。此时，用小剪刀剪断肌腱。将这些肌腱片段置于冰上预冷的无菌100 mm培养皿中保存。
  4. 重复对尾部其余部分进行夹紧和滑动操作 直到肌腱完全提取为止。
  5. 对所有获得的尾部重复执行步骤 1.2–1.4。
  6. 在显微镜下观察肌腱，使用小型剪刀剪除血管，并用直头精细镊子夹持以提高肌腱纯度，随后用超纯水冲洗肌腱3次。
  7. 收集3-4 g湿肌腱。将肌腱溶于150 mL的3%冰醋酸中，4 ℃下搅拌过夜。 °在200-250 mL玻璃锥形瓶中，于温和搅拌条件下孵育24-36 h。
  8. 20,000 离心 x g 孵育1小时。同时，取一段长约10–15 cm的透析袋膜，将其置于含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的超纯水中煮沸15分钟，以进行预处理。随后，用超纯水彻底轻柔冲洗透析膜。
  9. 离心后，通过倾注将上清液收集至透析袋膜中。沉淀物含有酸性不溶性物质（非胶原蛋白），上清液含有可溶性胶原蛋白。
  10. 将上清液在2-5 L玻璃烧杯中用2 L无菌0.1×最低必需培养基伊格尔（MEM），pH 4.0进行透析，透析持续3天。每天至少更换0.1×MEM溶液两次，每次更换前需检测pH值。若pH变为碱性，加入数滴0.1 M乙酸调节至pH 4.0。
  11. 透析后，向透析过的胶原溶液中加入抗生素（1.5 mL 青霉素/链霉素溶液，Pen-Strep）。将胶原原液分装为每份 5 mL，于 4 ℃ 保存。 °C.
    注意： 从此时起，所有操作步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行。
  12. 按照以下步骤对制备的胶原蛋白储备液进行凝胶化测试。
    1. 由于储存用胶原蛋白通常浓度过高，需用0.1x MEM（pH 4.0）将其稀释，配制三种工作浓度的稀释液（75%、50%和25%胶原蛋白溶液）。每种工作浓度溶液建议最终体积为5 mL。在每种条件下，使用蛋白质比色测定法检测蛋白质浓度。
    2. 将若干个空的1.5 mL锥形离心管（每个工作稀释度对应一支）、10x MEM溶液管、7.5%碳酸氢钠溶液以及不同工作浓度的胶原蛋白置于冰上。等待上述试剂冷却。
    3. 加入40-50 µL 的 10 倍浓缩 MEM 加入冷（4 ℃）的 °C）离心管。接着，轻轻混入 7-8 μL 碳酸氢钠溶液
    4. 加入 310–330 μL 的不同胶原稀释液加入该离心管中，用移液器轻轻混匀，避免产生气泡。将胶原-MEM-碳酸氢钠混合液置于冰上（4℃）保存。 °C）至少 5 分钟。
    5. 移液10-25 μ将混合物的 L 加入 35 mm 培养皿中。
    6. 将培养皿放入 CO2 37℃培养箱 °C，直至羟凝胶凝胶化（± 15-20 分钟）内观察到。
    7. 在不同的培养皿中，对剩余的胶原蛋白稀释液重复步骤 1.12.3–1.12.6。
    8. 选择能够获得最佳结果的胶原工作稀释度。
      注意： 最佳凝胶状态的水凝胶应具有均匀的半透明质地、灰色外观，且不应出现结块或纤维状结构。根据我们的经验，胶原蛋白与0.1×MEM以3:1的比例稀释可获得最佳实验结果。

2. 在三维胶原蛋白水凝胶中制备可分泌候选分子的基因修饰细胞（COS1）聚集体

  1. 接种 2 × 106 将 COS1 细胞接种至 35 mm 培养皿中，并加入完全培养基（含 10% (vol/vol) 热灭活胎牛血清、0.5% (wt/vol) 谷氨酰胺和 1% (wt/vol) 青霉素-链霉素的 100 mL D-MEM）进行培养 孵育箱，以在过夜时间内达到70-80%的融合度。每个转染步骤准备一个培养皿。
  2. 次日，使用基于脂质体的转染方法，按照制造商说明书将编码候选分子（Netrin-1 或 Sema3E）的 DNA 转染至 COS1 细胞中。
    1. 为此，混合 250 µ无血清培养基 L 和 DNA（1-2 μ每种条件取 g，加入 1.5 mL 离心管（DNA 管）中并混匀。室温（RT）孵育 5 分钟。另取一管（脂质体管），加入 240 µ无血清培养基的 L 和 10 µL 脂质体转染试剂，室温孵育 5 分钟。
    2. 孵育后，将DNA管中的内容物加入脂质体管中，轻轻混匀。室温下孵育15分钟。将培养细胞中的培养基更换为1.5 mL无血清培养基，并将DNA-脂质体混合物缓慢逐滴加入培养皿中。在CO₂2 细胞培养箱
  3. 转染孵育3小时后，将培养基更换为完全培养基，并在培养箱中孵育过夜。
  4. 次日，用 0.1 M Dulbecco 磷酸盐缓冲液（D-PBS）冲洗细胞，以胰蛋白酶-EDTA（800 µ每皿 L，于 CO 中孵育 5–15 分钟2 孵育箱）并用15 mL完全培养基收集悬浮细胞。
  5. 在 4 ℃ 条件下离心细胞 °C 在 130 x g 离心5分钟。离心后弃去上清液，将含有COS1细胞的沉淀置于冰上保存。
  6. 重复步骤 1.12.3–1.12.6 以制备胶原工作混合液。
  7. 加入100–150 μ将 1 毫升胶原混合物加入转染细胞沉淀中，轻轻吹打混匀，然后铺加 45–50 µ将该混合物的 L 加入培养皿（直径 35 mm）中，形成长度约为 1–1.5 cm 的均匀胶原-细胞条带。将培养皿置于 37 ℃ 培养箱中 °C（5% CO₂）2）直至凝胶化（± 15-20 分钟）内观察到。
  8. 在第二个培养皿中准备一条含有对照细胞（空载转染）的条带，并将其放入培养箱中培养（± 15-20 分钟），待凝胶化完成后加入 3-4 mL 预热（37 °C）向每皿含有凝胶化胶原-细胞条的培养物中加入COS1完全培养基，并置于CO₂培养箱中培养2 细胞培养箱。随后，将胶原-细胞条切割成小的方形片段（400 至 500） µ使用精细的手术刀或组织切片机切割成约 m 长的片段。
  9. 将相同转染条件下的所有切片转移至含有 3–3.5 mL 神经元培养基（NCM）的培养皿中，并在解剖显微镜下检查切片质量。再次将其置于 CO2 细胞培养箱
    注意： 神经元培养基由含1-5%（体积比）热灭活马血清、2 mM谷氨酰胺、0.5%（重量/体积）葡萄糖、1%（重量/体积）青霉素-链霉素溶液和0.044%（重量/体积）NaHCO₃的Neurobasal培养基组成。3确保 pH 值在 7.2–7.3 之间。

3. 胚胎外植体的制备与培养

  1. 按照常规灭菌指南，通过高压灭菌法对手术器械（剪刀、手术刀片刀柄、直头和弯头镊子）进行灭菌。同时准备 500 mL 的 Hank’s 平衡盐溶液-葡萄糖缓冲液（HBSS-G），以及 4–5 个直径为 100 mm 的培养皿，每个培养皿中加入 10 mL HBSS-G。将这些培养皿置于冰上（4 °C）。
  2. 在无菌区域外，按照批准的伦理操作程序处死妊娠雌性大鼠（胚胎第 16.5 天）。用剪刀从腹腔中取出胚胎子宫角，并将其放入盛有冷 HBSS-G 的大培养皿中。
  3. 将培养皿放入超净工作台中，用直头镊子取出胚胎，并转移至另一个盛有冷 HBSS-G 的新培养皿中。接着，使用小镊子去除胚胎的皮肤，并用弯头和直头镊子小心分离脑组织，然后将其放入盛有冷 HBSS-G 的培养皿中。
  4. 在解剖显微镜下，使用手术刀或精细剪刀沿中线将脑组织切成两半，以分离两侧半球，并用精细镊子去除脑组织块中的间脑、脑膜和血管。
  5. 对剩余的胚胎重复步骤 3.3–3.4 。为保持组织质量，解剖过程不应超过 2 小时。
  6. 用 100% 乙醇彻底清洁组织切片机的所有部件（特别是聚四氟乙烯（PTFE）切割板和剃刀刀片）。将组织切片机置于超净工作台内，在紫外灯下照射 15 分钟。
  7. 将每一块组织（例如皮层连同海马）转移至组织切片机的切割板上。对于海马组织，应将其垂直于剃刀刀片放置，并切出厚度为 450–500 µm 的组织切片。
  8. 准备多个直径为 35 mm 的培养皿，每皿加入 3–4 mL 完全神经元培养基（NCM），并将组织切片机切割板上的组织块转移至培养皿中。由于需分离多个感兴趣区域，可能需要使用多个培养皿。
  9. 在完全 NCM 培养基中使用精细钨针完成组织的进一步解剖。在解剖显微镜下检查所获得切片的质量，确保在暗场光学条件下各层结构清晰可辨 ，并使用钨针分离出感兴趣区域（例如海马的 CA 区域）。弃去受损的切片。将海马外植体保留在完全 NCM 培养基中，并置于 CO2 培养箱内。

4. 胶原蛋白水凝胶中三维共培养的制备

  1. 将多个无菌的4孔培养板放入超净工作台中，并按照之前步骤1.12.2-1.12.6所述配制胶原蛋白工作液。
  2. 放置15-20 μ将适量的水凝胶混合物加入孔底部，形成圆形胶原基质。对剩余各孔重复此步骤。每次制备不超过五块培养板，以避免水凝胶基质中的液体过度蒸发。
  3. 将培养皿置于培养箱中，直至完全凝胶化（± 观察到凝胶化完成（约15–20分钟）后，方可将培养板从培养箱中取出。检查凝胶化胶原的质量。
  4. 用移液管转移一小块 COS1 细胞聚集体，将其放置在水凝胶基质上，再用移液管将一块组织样本放置在相同基质上，紧邻细胞聚集体，间距约为一个外植块大小。
  5. 在冰上按照步骤 1.12.2–1.12.6 制备新的工作用胶原蛋白混合液。
  6. 轻轻吹打15-20次 μ将此新混合液的 L 加入并覆盖外植体和细胞团。此时可观察到类似三明治结构的水凝胶培养体系。随后，用细钨针重新调整外植体的方向（切勿触碰 COS1 细胞团！），使其朝向细胞团 ± 500-600 μm.
  7. 将培养板放回培养箱，直至观察到凝胶形成（± 10–15 分钟），加入 0.5 mL 添加 2% B27 补充剂的完全 NCM，将培养物置于培养箱中（37℃）培养 36 至 48 小时 °C，5% CO2).

5. 外植体-细胞团共培养物的固定及免疫细胞化学操作

  1. 孵育 36–48 小时后，移除培养基，并用 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.3 洗涤。随后在 4 °C 条件下，用含 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.3 的 4% 多聚甲醛固定培养物 1 小时。
  2. 移除固定液，并用 0.1 M PB（pH 7.3）轻轻冲洗培养物 3–4 次，每次 10–15 分钟。
  3. 用刮勺或镊子将水凝胶夹心结构从孔板底部剥离。使用细毛刷将胶原块转移至含有含 0.5% 非离子型去垢剂的 0.1 M PBS 的 6 孔培养板中。
  4. 将游离漂浮的水凝胶在封闭液（含 10% 血清、0.5% 非离子型表面活性剂和 0.2% 明胶的 0.1 M PBS）中于室温轻度振荡孵育 2–3 小时。
  5. 用含 0.5% 非离子型表面活性剂的 0.1 M PBS 洗涤 3 次，每次 10–15 分钟。
  6. 将一抗用含 5% 血清、0.5% 非离子型表面活性剂、0.2% 明胶和 0.02% 叠氮化钠的 PBS 稀释后进行孵育。在 4 °C 条件下于摇床上孵育一抗 36–48 小时。
    注意：通常使用针对 III 类 β-微管蛋白（α-TUJ-1）的抗体（稀释比 1:2,000）来标记 3-D 水凝胶培养中的轴突生长。
  7. 孵育结束后，参照步骤 5.5 进行洗涤。
  8. 将二抗用含 5% 血清、0.5% 非离子型表面活性剂和 0.2% 明胶的溶液稀释后，在摇床上于室温孵育 4 小时（或在 4 °C 孵育 6–7 小时）。本实验中使用马抗小鼠生物素化抗体（稀释比 1:200）。
  9. 参照步骤 5.5 的方法洗涤培养物。
  10. 在 4 °C 条件下，用含 5% 血清、0.5% 非离子型表面活性剂和 0.2% 明胶的 PBS 将亲和素-生物素复合物（ABC）溶液按 1:100 稀释后孵育培养物 2 天。或者，在相同缓冲液中使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（稀释比 1:300–400）。
  11. 参照步骤 5.5 所述方法洗涤培养物。
  12. 用 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.6）多次洗涤培养物，持续 1 小时。
  13. 在 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.6）中加入 0.03% 的 3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）溶液，孵育培养物。
  14. 加入 5–8 µL 的 1% H2O2，静置 10–15 分钟。在显微镜下使用 4–10 倍物镜监测 DAB 显色反应进程。
  15. 用 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.6）替换 DAB 溶液以终止反应。
  16. 用 PBS 洗涤培养物 30 分钟（期间多次更换溶液）。
  17. 使用水溶性封片剂将水凝胶封固于载玻片上。
  18. 使用 ImageJ 软件中的 Sholl 分析插件或 NeuriteJ 插件分析水凝胶内轴突的长度与分布30。

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结果

本文介绍了一种易于推广的方法，用于研究小鼠胚胎神经系统在三维水凝胶胶原培养体系中的轴突生长。为此，我们从成年大鼠尾部提取胶原蛋白，构建三维胶原基质，并在其中共培养经基因修饰、表达Netrin-1或Sema3E的细胞聚集体与胚胎神经组织（例如海马CA区组织）。这些细胞聚集体可在胶原基质内形成候选分子的径向浓度梯度。最后，为评估神经元对不同分子的反应，我们采用免疫细胞化学方法（如α-TUJ-1染色）对培养样本进行标记，并结合一种简便易行的定量分析方法，获得了足够数据以确定候选分子对轴突行为的影响。

在我们的实验中，当海马体轴突遇到Netrin-1时，这些轴突优先朝向Netrin-1的来源生长，表明Netrin-1对该类轴突具有化学吸引作用（图1B）。相反，当海马体轴突遇到分泌Sema3E的细胞时，大多数轴突背向细胞团生长，表明Sema3E对这些轴突具有化学排斥作用（图1C）。在对照条件（空载体转染）下...

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讨论

发育中轴突的生长主要具有侵袭性，包括细胞外基质（ECM）的降解与重塑。通过本文所述方法，研究人员可以获得由天然I型胶原蛋白构成的均一三维基质，其中轴突（或细胞）能够对经基因修饰细胞分泌的化学梯度产生反应，如同在体内环境中的行为。可轻松比较轴突对吸引性或抑制性信号分子（蛋白质、脂类等）梯度的不同反应，并与特定对照（空载体转染细胞）进行比较。该方法的优势在于，肌腱易于分离，且通常可作为动物实验的残留组织而获得。此外，与其他组织（如皮肤或肺）相比，肌腱中I型胶原蛋白的浓度极高31。

尽管本文介绍的方法操作简单，但在实验过程中仍有一些步骤需要特别注意。在胶原蛋白提取过程中，必须彻底清除尾腱上的血管和皮肤碎片，以提高胶原蛋白的纯度和凝胶质量。此外，必须保持无菌条件，部分操作应在无菌超净工作台中进行，并在使用前对所有手术器械进行灭菌处理。同时，应严格控制溶液的pH值和温度条件。例如，若MEM 10x和碳酸氢盐溶液未达到最佳状态，胶原基质将无法均匀聚合，从而对轴突生长及实验结果产生不利影响。此外，若胶原原液浓度过高或过低，基质均不能正常凝胶化。根据...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Tom Yohannan 提供的编辑建议以及 M. Segura-Feliu 提供的技术支持。本工作由 CERCA 计划以及加泰罗尼亚自治区创新、大学与企业部的大学与科研委员会（SGR2017-648）资助。本工作还获得了西班牙科研、创新与大学部（MEICO）通过项目 BFU2015-67777-R 和 RTI2018-099773-B-100、西班牙朊病毒网络（Prionet Spain AGL2017-90665-REDT）以及卡洛斯三世研究所 CIBERNED（PRY-2018-2）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
3,3′-四盐酸二氨基联苯胺10 mg片剂（DAB）SigmaD5905
成年Sprague-Dawley大鼠（8至9周龄） Criffa-Credo，里昂，法国
亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）Vector LabsPK-4000
B27无血清添加剂50倍浓缩液 Invitrogen17504-044
双辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒Pierce23225
cDNA质粒载体
COS1细胞系ATTCCRL-1570
D-(+)-葡萄糖Sigma16325
用于完全Neurobasal培养基的D-(+)-葡萄糖（水中45%溶液）SigmaG8769
用于COS1培养基的D-MEM（Dulbecco改良Eagle培养基1倍）Invitrogen41966-029
用于细胞培养的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液10倍浓缩液（不含Ca2+和Mg2+）（D-PBS）Invitrogen14200
乙醇 Merck108543
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）SigmaE5134
荧光封片介质（例如Fluoromount-G或类似产品）Electron Microscopy Sciences (EMS)17984-25
明胶粉末 SigmaG1890
冰乙酸（Panreac，货号211008）Panreac211008
Hank’s平衡盐溶液 Invitrogen24020083
热灭活胎牛血清 Invitrogen10108-165
热灭活马血清 Invitrogen26050-088
过氧化氢（H2O2，水中32至33%）Sigma316989
用于完全Neurobasal和COS1培养基的L-谷氨酰胺200 mM溶液（100倍浓缩）Invitrogen25030-024
Lipofectamine 2000试剂Invitrogen11668-019
怀孕雌性小鼠（胚胎期12.5至16.5天；E12.5-16.5） Criffa-Credo，里昂，法国
改良Eagle最低必需培养基（MEM）Invitrogen11012-044
抗III类β-微管蛋白单克隆抗体（克隆TUJ-1）Biolegend801201
N-2添加剂100倍浓缩液 Invitrogen17502-048
Neurobasal培养基 Invitrogen21103049
多聚甲醛Merck1,040,051,000
青霉素/链霉素溶液100倍浓缩液 Invitrogen15140-22
用于免疫细胞化学的磷酸盐缓冲液10倍浓缩液（PBS）InvitrogenAM9624
二抗：生物素化马抗小鼠抗体 Vector LabsBA-2000
无血清培养基（Opti-MEM）Invitrogen11058-021
叠氮化钠 Panreac162712
7.5%碳酸氢钠溶液 Invitrogen25080-094
无菌培养级H2O SigmaW3500
TritonTM X-100 SigmaX100
Trizma碱 SigmaT1503
胰蛋白酶-EDTA（含EDTA（1倍）的0.05%（wt/vol）胰蛋白酶）Invitrogen25300-054
设备
1把大号和1把小号弯剪用于解剖 Fine Tools Instruments或类似产品
1.5 mL锥形离心管 Eppendorf或类似产品
15 mL锥形离心管 Corning或类似产品
2把止血钳  Fine Tools Instruments或类似产品
2把小号直头解剖剪Fine Tools Instruments或类似产品
用于离心的200 mL离心管Nalgene或类似产品
200 mL无菌玻璃锥形瓶
2 L玻璃烧杯
4孔和6孔培养板 Nunc176740 和 140675
自动移液泵及一次性含滤膜的10 mL和25 mL无菌塑料移液管Gilson、Brand、Eppendorf或类似产品 
自动移液器、无菌滤芯吸头和当前使用的无菌吸头 Gilson、Eppendorf或类似产品
带固定角转子的台式微量离心机 Eppendorf、Beckman Coulter或类似产品
带摆桶转子的台式制冷离心机（配有1.5、15和50 mL试管适配器）Eppendorf、Beckman Coulter或类似产品
37 °C、5% CO2和95%空气的细胞培养箱
透析管纤维素膜SigmaD9402
透析管封口夹 SigmaZ37101-7
一次性玻璃移液管
带暗场光学系统的解剖显微镜 Olympus SZ51或类似产品 
高速制冷Beckman Coulter离心机或类似设备，带固定角转子
层流罩
大号100 mm、60 mm和小号35 mm Ø细胞培养皿 Nunc 150679、150288 和 150318，分别对应
磁力搅拌器和磁力搅拌子IKA或类似产品
McIlwain组织切片机Mickle Laboratory Engineering
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两对精细刮勺，用于转移胶原蛋白和组织块Fine Tools Instruments或类似产品

参考文献

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