结合非还原性SDS-PAGE分析与化学交联技术检测培养哺乳动物细胞中由二硫键稳定的多聚复合物

摘要

二硫键长期以来已知可稳定许多蛋白质的结构。分析由这些二硫键稳定的多聚体复合物的一种简单方法是通过非还原性SDS-PAGE分析。本文以人骨成骨肉瘤细胞系U-2 OS中dUTP酶的核异构体为例，说明了该方法的应用。

摘要

许多蛋白质的结构通过共价二硫键得以稳定。在近期的研究中，这种化学键也被归类为一种翻译后修饰。因此，能够在活细胞中研究这种修饰显得尤为重要。分析这些由半胱氨酸稳定形成的多聚复合物的一种简单方法是采用非还原性SDS-PAGE分析与甲醛交联相结合的两步法。该两步法因其技术操作简便且运行成本低廉，作为揭示由二硫键稳定的多聚复合物的第一步，具有显著优势。本文以人骨成骨肉瘤细胞系U-2 OS为例，通过特异性分析dUTPase的核异构体来演示该方法的应用。

引言

二硫键长期以来被认为可稳定许多蛋白质的结构。近期研究进一步将这种化学键归类为一种可逆的翻译后修饰，作为一种基于半胱氨酸的"氧化还原开关"，能够调节蛋白质的功能、定位和相互作用^1,2,3,4。因此，能够研究这种修饰具有重要意义。分析这类由半胱氨酸稳定形成的多聚体复合物的一种简便方法是采用非还原性SDS-PAGE分析⁵。SDS-PAGE分析是许多实验室常用的技术，其结果可快速、简便且低成本地获得并解读，相较于质谱^6,7和圆二色光谱⁸等用于鉴定二硫键的其他技术具有优势。

确定该方法是否适用于研究的重要步骤之一，是彻底分析目标蛋白的一级序列，以确保其中含有半胱氨酸残基。另一个有益的步骤是查阅已发表的任何相关晶体结构，或使用生物信息学工具分析目标蛋白的三维结构，以可视化半胱氨酸残基可能所处的位置。如果残基位于蛋白的外表面，则相较于埋藏在结构内部的半胱氨酸残基，更有可能成为形成二硫键的合适位点。然而需要注意的....

方案

1. 使用碘乙酰胺阻断游离半胱氨酸残基

1. 在37 °C、5% CO₂条件下，使用含10%胎牛血清和1%丙酮酸钠的高糖最低必需培养基，将U-2 OS细胞培养至6 cm²培养皿中细胞融合度达到50%–60%。
2. 使用前新鲜配制10 mM碘乙酰胺储备液，剩余试剂使用后立即弃去。
3. 将碘乙酰胺直接加入细胞培养基中，使其终浓度为0.1 mM，在室温下轻轻摇动培养皿2分钟。

2. 收集细胞

1. 吸弃细胞培养液。
2. 用 5 mL 冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次。吸弃最后一次 PBS 洗涤液，然后加入 1 mL 冷的 PBS。
3. 使用细胞刮将细胞从培养皿底部刮下。用 1 mL 移液器吸取 PBS 和细胞悬液，并将全部液体转移至 1.5 mL 微量离心管中。
4. 在 4 °C 条件下，以 7,500 × g 离心 3 分钟。吸弃 PBS，保留细胞沉淀。细胞沉淀可在 -80 °C 保存至后续处理。

3. 蛋白质提取

1. 用ddH₂O配制100 µL的1x裂解缓冲液（参见材料表）。使用前立即加入苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度为1 mM。<....

结果

核dUTPase通过两个单体蛋白各自第三个氨基酸位置上的两个半胱氨酸残基相互作用，形成分子间二硫键，从而构成稳定的二聚体构型¹¹。这一点在图1A、B中得到展示。为确保该二硫键并非由于在非还原环境下迁移异常所导致的非特异性相互作用，设置适当的对照至关重要。值得注意的是，核dUTPase是人类体内存在的四种同工型之一。这四种同工型中有三种具有独特的氨基端结构域，同时共享一个相同的催化核心^11,12。如Western印迹所示，在收获人细胞时，dUTPase以单体形式存在的状态至少包含三种同工型的组合（线粒体同工型、核同工型以及在M24处标注的截短版本），这些同工型均可被我们的多克隆抗体识别。其中，只有核同工型在其独特的氨基端结构域中含有半胱氨酸残基。由于核同工型仅占Western印迹中所见单体状态蛋白的一小部分，因此延长曝.......

讨论

本文所述方法提供了一种通过二硫键稳定的多聚体复合物的直接分析方案。该方案可轻松适用于其他细胞系、组织和生物体，具有广泛的应用范围。

该实验步骤中的一个重要环节是确保二硫键的存在并非提取过程所导致。可使用碘乙酰胺¹³来封闭任何游离的半胱氨酸残基。这种烷基化试剂会通过半胱氨酸的巯基与其共价结合，从而阻止新的二硫键形成。然而，如果二硫键在试剂处理前已经存在，则该试剂不会破坏已形成的二硫键。碘乙酰胺的使用条件可通过调整浓度和作用时间进行优化。但过度暴露于该试剂将导致细胞死亡。

本方案中一个可能有帮助的附加步骤是优化甲醛交联条件。可以调整甲醛的浓度以及交联时间^9,14。需要注意的是，随着甲醛浓度和交联时间的增加，形成非特异性相互作用的可能性也会增加。此外，还需对下游的多聚体复合物进行验证。若要确定复合物的分子量及其身份，特别是当复合物为异源多聚体时，质谱分析是一种有效的技术.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 预制 TGX 凝胶	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 培养瓶	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 培养皿	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL 检测试剂盒	GE	16817200
转膜装置	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford 蛋白检测试剂	Biorad	5000006
溴酚蓝
BSA	Cell signaling	99985
细胞裂解缓冲液	Cell signaling	9803
离心机	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
钻孔器
EDTA	Sigma Aldrich	M101
电泳装置	Invitrogen	A25977
超厚 Western 印迹纸	ThermoFisher	88610
胎牛血清	Gibco	1932693
甲醛	ThermoFisher	28908
玻璃-聚四氟乙烯匀浆器
甘油	Sigma Aldrich	65516
甘氨酸	RPI	636050
加热块	Denville	10285-D
HEPES	Sigma Aldrich	H0527
盐酸	VWR	2018010431
碘乙酰胺	ThermoFisher	90034
Kimwipe 擦镜纸	Kimtech	34155
甲醇	Pharmco	339000000
脱脂奶粉	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click 管	Denville	C2170
电源	Biorad	200120
预染蛋白 Marker	ThermoFisher	26619
PVDF 膜	Biorad	162-0177
摇床	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
二抗	Cell signaling	70748
小型细胞刮刀	Tygon	S-50HL class VI
氯化钠	RPI	S23020
丙酮酸钠	Gibco
超声破碎仪	Branson	450
印迹用海绵垫	Invitrogen	E19051
磁力搅拌器	Corning	PC353
蔗糖	Sigma Aldrich	S-1888
Tris 碱	RPI	T60040
含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水，pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-甘氨酸电泳缓冲液	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X 射线胶片	ThermoFisher	34090