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方法文章

结合非还原性SDS-PAGE分析与化学交联技术检测培养哺乳动物细胞中由二硫键稳定的多聚复合物

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DOI：

10.3791/59483

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2019年5月2日

 , 
1Department of Molecular Biology, Rowan University, School of Osteopathic Medicine and Graduate School of Biomedical Sciences

本文内容

摘要

二硫键长期以来已知可稳定许多蛋白质的结构。分析由这些二硫键稳定的多聚体复合物的一种简单方法是通过非还原性SDS-PAGE分析。本文以人骨成骨肉瘤细胞系U-2 OS中dUTP酶的核异构体为例，说明了该方法的应用。

摘要

许多蛋白质的结构通过共价二硫键得以稳定。在近期的研究中，这种化学键也被归类为一种翻译后修饰。因此，能够在活细胞中研究这种修饰显得尤为重要。分析这些由半胱氨酸稳定形成的多聚复合物的一种简单方法是采用非还原性SDS-PAGE分析与甲醛交联相结合的两步法。该两步法因其技术操作简便且运行成本低廉，作为揭示由二硫键稳定的多聚复合物的第一步，具有显著优势。本文以人骨成骨肉瘤细胞系U-2 OS为例，通过特异性分析dUTPase的核异构体来演示该方法的应用。

引言

二硫键长期以来被认为可稳定许多蛋白质的结构。近期研究进一步将这种化学键归类为一种可逆的翻译后修饰，作为一种基于半胱氨酸的"氧化还原开关"，能够调节蛋白质的功能、定位和相互作用1,2,3,4。因此，能够研究这种修饰具有重要意义。分析这类由半胱氨酸稳定形成的多聚体复合物的一种简便方法是采用非还原性SDS-PAGE分析5。SDS-PAGE分析是许多实验室常用的技术，其结果可快速、简便且低成本地获得并解读，相较于质谱6,7和圆二色光谱8等用于鉴定二硫键的其他技术具有优势。

确定该方法是否适用于研究的重要步骤之一，是彻底分析目标蛋白的一级序列，以确保其中含有半胱氨酸残基。另一个有益的步骤是查阅已发表的任何相关晶体结构，或使用生物信息学工具分析目标蛋白的三维结构，以可视化半胱氨酸残基可能所处的位置。如果残基位于蛋白的外表面，则相较于埋藏在结构内部的半胱氨酸残基，更有可能成为形成二硫键的合适位点。然而需要注意的是，蛋白质在与底物相互作用或发生蛋白-蛋白相互作用时，可能发生构象变化，从而使原本埋藏的残基暴露于环境中。

鉴定出的多聚复合物可通过甲醛化学交联进行验证。甲醛是一种理想的交联剂，具有细胞通透性高和交联距离短（约2-3 Å）的特点，可确保特异性蛋白质-蛋白质相互作用的检测9,10。本文以人骨成骨肉瘤细胞系U-2 OS中的核同工型dUTPase为例，说明该方法的应用11。然而，本实验方案可适用于其他细胞系、组织和生物体。

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方案

1. 使用碘乙酰胺阻断游离半胱氨酸残基

  1. 在37 °C、5% CO2条件下，使用含10%胎牛血清和1%丙酮酸钠的高糖最低必需培养基，将U-2 OS细胞培养至6 cm2培养皿中细胞融合度达到50%–60%。
  2. 使用前新鲜配制10 mM碘乙酰胺储备液，剩余试剂使用后立即弃去。
  3. 将碘乙酰胺直接加入细胞培养基中，使其终浓度为0.1 mM，在室温下轻轻摇动培养皿2分钟。

2. 收集细胞

  1. 吸弃细胞培养液。
  2. 用 5 mL 冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次。吸弃最后一次 PBS 洗涤液，然后加入 1 mL 冷的 PBS。
  3. 使用细胞刮将细胞从培养皿底部刮下。用 1 mL 移液器吸取 PBS 和细胞悬液，并将全部液体转移至 1.5 mL 微量离心管中。
  4. 在 4 °C 条件下，以 7,500 × g 离心 3 分钟。吸弃 PBS，保留细胞沉淀。细胞沉淀可在 -80 °C 保存至后续处理。

3. 蛋白质提取

  1. 用ddH2O配制100 µL的1x裂解缓冲液（参见材料表）。使用前立即加入苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度为1 mM。
  2. 将50 µL的1x裂解缓冲液直接加入细胞沉淀中并悬浮。冰上孵育5分钟。
  3. 使用超声破碎仪以40%的恒定脉冲模式超声处理8秒（超声仪型号参见材料表；不同超声仪可根据需要进行调整），期间保持提取物处于冰上。
  4. 在4 °C、16,000 x g条件下离心提取物5分钟。上清液即为可溶性蛋白组分。如需，可进行Bradford分析以测定蛋白浓度。

4. 样品制备

  1. 取10 µL可溶性蛋白提取物，加入10 µL 1x Laemmli SDS上样缓冲液（含4% SDS、20%甘油、0.004%溴酚蓝和0.125 M Tris-HCl，pH 6.8）。不要添加任何还原试剂。
  2. 若当天进行SDS-PAGE分析，样品应置于冰上保存；如需长期储存，可于-20 °C保存。上样前，将样品在85 °C加热5分钟。

5. U-2 OS 细胞中内源性蛋白质的体内甲醛交联

  1. 将U-2 OS细胞在175 cm2培养瓶中培养至70%–80%汇合度（见第1节）。
  2. 进行甲醛交联反应
    1. 在通风橱中，取自商业来源购买的37%甲醛溶液，直接加入培养基中，使终浓度为1%，室温下轻柔振荡孵育15分钟。
    2. 加入1.25 M甘氨酸至终浓度0.125 M以终止反应，室温下在摇床上轻柔振荡孵育5分钟。
  3. 用5 mL预冷的PBS洗涤细胞三次。吸除最后一次PBS洗涤液后，加入10 mL PBS，用细胞刮棒将细胞从培养瓶底部刮下。
  4. 用10 mL移液管吸取PBS和细胞悬液，将全部液体转移至15 mL锥形离心管中，在4 °C下以500 x g离心2分钟。吸除PBS，保留细胞沉淀。

6. 细胞核的分级分离

  1. 配制10 mL匀浆缓冲液：0.25 M蔗糖、1 mM EDTA、10 mM HEPES和0.5% BSA，pH 7.4。使用前立即加入PMSF至终浓度为1 mM，并加入3 mL核悬浮缓冲液（含0.1% Triton X-100的PBS）。
  2. 将5 mL匀浆缓冲液直接加入细胞沉淀中，充分悬浮。在4 °C下以500 × g离心2分钟，弃去上清液。
  3. 用5 mL匀浆缓冲液重悬沉淀。使用紧密配合的玻璃-聚四氟乙烯匀浆器，以10次/500 rpm的速度进行Dounce匀浆。
  4. 在4 °C下以1,500 × g离心10分钟，弃去上清液。
    注意：可将上清液在10,000 × g下离心10分钟以分离线粒体。
  5. 用1 mL核悬浮缓冲液重悬沉淀，冰上孵育10分钟。
  6. 在600 × g下离心10分钟，弃去上清液。
  7. 用1 mL核悬浮缓冲液再次重悬沉淀，再次离心，弃去上清液。最终得到的沉淀即为分离的细胞核。

7. 蛋白质提取

  1. 重复第4节操作，但将25 µL的1x裂解缓冲液直接加入细胞沉淀中，然后重悬。

8. 样品制备

  1. 取10 µL可溶性蛋白提取物，制备两份样品用于SDS-PAGE，每份加入10 µL 2x Laemmli SDS上样缓冲液和1 µL 2-巯基乙醇（BME）。
  2. 将一份样品在37 °C加热5分钟，另一份样品在98 °C加热15分钟，以逆转甲醛交联。

9. SDS-PAGE 分析

  1. 配制 1 L 的 1× Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% (w/v) SDS）。
  2. 安装 SDS-PAGE 电泳装置。
    注意：    本方案使用 16% 预制 TGX SDS-Page 凝胶。值得注意的是，可使用任意浓度的凝胶。
    1. 根据制造商说明书，打开凝胶储存包装并取出凝胶盒。
    2. 移除填充加样孔的梳子以及凝胶盒底部的封条。
    3. 将凝胶放入电泳装置中。
    4. 向内槽加入 1× 电泳缓冲液，直至加样孔完全浸没于液体中。使用塑料移液器用运行缓冲液冲洗加样孔。
  3. 在凝胶上加样，并同时加入 10 µL 预染标准蛋白 Marker。
  4. 以 200 V 电压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部约 1 cm 处。

10. 蛋白质印迹

  1. 配制 1 L 的 1× 转膜缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，20% 甲醇），使用前于 4 °C 保存。
  2. 小心取出凝胶并打开夹具。用刀片小心切除并丢弃浓缩胶。从一角拿起凝胶，将其放入盛有转膜缓冲液的托盘中，轻轻摇晃 5 分钟。
  3. 在凝胶摇晃的同时，将一块冰（储存在 -20 °C）放入转膜槽中，并加入转膜缓冲液至槽体 ¾ 满。
  4. 将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜在 100% 甲醇中浸泡 30 秒以润湿。
  5. 5 分钟后，在盛有转膜缓冲液的托盘中准备进行转膜。转膜缓冲液应足以完全浸没印迹装置。按以下顺序组装转膜装置：底部为夹具底板（黑色）；然后依次为厚海绵、超厚滤纸、聚丙烯酰胺凝胶、PVDF 膜、超厚滤纸和厚海绵；最上方为夹具顶板（白色）。
  6. 锁紧夹具，将装置放入转膜槽中，确保 PVDF 膜朝向正极，凝胶朝向负极。继续加入转膜缓冲液，直至整个装置完全浸没。
  7. 将装置置于磁力搅拌器上。向装置中加入一个搅拌子，并以 125 rpm 的速度开始搅拌。
  8. 以 100 V 电压运行 60 分钟。
  9. 在转膜进行的同时，配制含 5% 脱脂奶粉的 Tris 缓冲盐水（含 Tween-20，pH 7.5，简称 TBST）溶液。
  10. 拆卸装置并取出膜，注意记录与凝胶接触的一面；确保在后续步骤中该面朝上放置于托盘中。
  11. 将膜在 Tris 缓冲盐水（TBS）中浸泡 2 分钟，随后在 5 mL 的 5% 脱脂奶粉-TBST 溶液中室温孵育 30 分钟以封闭非特异性结合位点。
  12. 弃去脱脂奶粉溶液，更换为新鲜的 4 mL 5% 脱脂奶粉-TBST 溶液，按适当稀释比例加入一抗（本实验中，dUTPase 抗体的稀释比例为 1:2,000），4 °C 轻柔摇晃孵育过夜。
  13. 次日，将印迹装置从 4 °C 摇床转移至室温摇床，弃去一抗溶液。
  14. 用 TBST 快速洗涤 3 次，每次使用足量液体完全浸没膜，随后进行 3 次缓慢摇晃洗涤，每次 5 分钟，然后弃去洗涤液。
  15. 最后一次洗涤后，加入 5 mL 的 5% 脱脂奶粉-TBST 溶液，摇晃 15 分钟后弃去。
  16. 按所需浓度将二抗稀释于 5% 脱脂奶粉-TBST 溶液中加入（本实验中，使用 1:5,000 稀释的 goat anti-rabbit 抗体，溶于 5 mL 的 5% 脱脂奶粉-TBST 溶液）。
  17. 室温孵育 1 小时，期间轻柔摇晃，然后弃去溶液。
  18. 用 TBST 快速洗涤 3 次，随后进行 3 次缓慢摇晃洗涤，每次 5 分钟，弃去最后一次洗涤液后加入 5 mL TBS。
  19. 配制 ECL 化学发光检测试剂的 1:1 混合液（每种试剂各取 1 mL，终体积为 2 mL），直接加入印迹膜中，孵育 1 分钟。
  20. 用镊子取出膜，用实验室擦拭纸轻蘸一角，去除多余溶液。将膜放入保鲜膜中，蛋白面朝上置于 X 光片夹中。
  21. 将膜与 X 光胶片接触曝光。曝光时间根据信号强度而定。

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结果

核dUTPase通过两个单体蛋白各自第三个氨基酸位置上的两个半胱氨酸残基相互作用，形成分子间二硫键，从而构成稳定的二聚体构型11。这一点在图1A、B中得到展示。为确保该二硫键并非由于在非还原环境下迁移异常所导致的非特异性相互作用，设置适当的对照至关重要。值得注意的是，核dUTPase是人类体内存在的四种同工型之一。这四种同工型中有三种具有独特的氨基端结构域，同时共享一个相同的催化核心11,12。如Western印迹所示，在收获人细胞时，dUTPase以单体形式存在的状态至少包含三种同工型的组合（线粒体同工型、核同工型以及在M24处标注的截短版本），这些同工型均可被我们的多克隆抗体识别。其中，只有核同工型在其独特的氨基端结构域中含有半胱氨酸残基。由于核同工型仅占Western印迹中所见单体状态蛋白的一小部分，因此延长曝...

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讨论

本文所述方法提供了一种通过二硫键稳定的多聚体复合物的直接分析方案。该方案可轻松适用于其他细胞系、组织和生物体，具有广泛的应用范围。

该实验步骤中的一个重要环节是确保二硫键的存在并非提取过程所导致。可使用碘乙酰胺13来封闭任何游离的半胱氨酸残基。这种烷基化试剂会通过半胱氨酸的巯基与其共价结合，从而阻止新的二硫键形成。然而，如果二硫键在试剂处理前已经存在，则该试剂不会破坏已形成的二硫键。碘乙酰胺的使用条件可通过调整浓度和作用时间进行优化。但过度暴露于该试剂将导致细胞死亡。

本方案中一个可能有帮助的附加步骤是优化甲醛交联条件。可以调整甲醛的浓度以及交联时间9,14。需要注意的是，随着甲醛浓度和交联时间的增加，形成非特异性相互作用的可能性也会增加。此外，还需对下游的多聚体复合物进行验证。若要确定复合物的分子量及其身份，特别是当复合物为异源多聚体时，质谱分析是一种有效的技术...

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披露

作者声明，他们对本文稿内容不存在利益冲突。

致谢

我们衷心感谢 Jennifer Fischer 博士在 dUTPase 多克隆抗体纯化工作中付出的努力，以及 Kerri Ciccaglione 在协助编辑本稿件过程中所做出的诸多贡献。本研究部分得到了新泽西健康基金会资助项目（资助号：PC 11-18）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 预制 TGX 凝胶ThermoFisherXp00160
175 cm2 培养瓶Cell star658175
18COATCCCRL-1459
6 cm2 培养皿VWR10861-588
A549ATCCCCL-185
Amersham ECL 检测试剂盒GE16817200
转膜装置Biorad153BR76789
BMESigma AldrichM3148
Bradford 蛋白检测试剂Biorad5000006
溴酚蓝
BSACell signaling99985
细胞裂解缓冲液Cell signaling9803
离心机Eppendor5415D
DMEMGibco11330-032
钻孔器
EDTASigma AldrichM101
电泳装置InvitrogenA25977
超厚 Western 印迹纸ThermoFisher88610
胎牛血清Gibco1932693
甲醛ThermoFisher28908
玻璃-聚四氟乙烯匀浆器
甘油Sigma Aldrich65516
甘氨酸RPI636050
加热块Denville10285-D
HEPESSigma AldrichH0527
盐酸VWR2018010431
碘乙酰胺ThermoFisher90034
Kimwipe 擦镜纸Kimtech34155
甲醇Pharmco339000000
脱脂奶粉Cell signaling99995
PBSSigma AldrichP3813
PMSFSigma Aldrich329-98-6
Posi-click 管DenvilleC2170
电源Biorad200120
预染蛋白 MarkerThermoFisher26619
PVDF 膜Biorad162-0177
摇床Reliable Scientific55
Saos2ATCCHTB-85
SDSBiorad161-0302
二抗Cell signaling70748
小型细胞刮刀TygonS-50HL class VI
氯化钠RPIS23020
丙酮酸钠Gibco
超声破碎仪Branson450
印迹用海绵垫InvitrogenE19051
磁力搅拌器CorningPC353
蔗糖Sigma AldrichS-1888
Tris 碱RPIT60040
含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水，pH 7.5Sigma AldrichSRE0031
Tris-甘氨酸电泳缓冲液VWRJ61006
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Tween 20Sigma AldrichP9416
U-2 OSATCCHTB-96
X 射线胶片ThermoFisher34090

参考文献

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