使用新型锥形海绵尖电极记录幼年斑马鱼的视网膜电图

摘要

本文介绍了一种简化幼年斑马鱼光诱发视网膜电图（ERG）反应测量的实验方案。一种新型的圆锥形海绵尖电极有助于更简便地开展幼年斑马鱼视觉发育的视网膜电图研究，获得可靠的结果，同时降低实验成本。

摘要

斑马鱼（Danio rerio）在发育研究中常被用作脊椎动物模型，尤其适用于视觉神经科学。对于视觉功能的检测，视网膜电图（ERG）是一种理想的非侵入性方法，该方法在高等脊椎动物中已有成熟应用。近年来，该技术也越来越多地用于检测斑马鱼的视觉功能，包括其早期发育的幼体阶段。然而，目前用于幼体斑马鱼ERG记录最常用的电极是玻璃微吸管电极，其制备需要专门设备，这对资源有限的实验室构成了挑战。本文介绍一种使用锥形海绵头电极的幼体斑马鱼ERG实验方案。这种新型电极更易于制备和操作，成本更低，且对幼体眼睛的损伤风险小于玻璃微吸管电极。与已发表的ERG方法类似，本方案可通过感光细胞和双极细胞的反应（即a波和b波）评估视网膜外层功能。该方案能够清晰展示斑马鱼幼体早期发育过程中视觉功能的逐步完善，验证了新型电极的实用性、灵敏性和可靠性。这种简化的电极在建立新的ERG系统或将现有的小型动物ERG装置改造用于斑马鱼检测时尤为有用，有助于视觉神经科学领域的研究人员更好地利用斑马鱼这一模式生物。

引言

斑马鱼（Danio rerio）已成为广泛使用的脊椎动物遗传学模型，被应用于视觉神经科学的研究。该物种日益受到青睐的原因在于其具有多种优势，包括易于进行遗传操作、视觉系统在脊椎动物中高度保守（神经元类型、解剖形态与结构组织以及基础遗传机制）、繁殖力高，且饲养成本较哺乳动物模型更低¹。无创性视网膜电图（ERG）长期以来在临床上用于评估人类视觉功能，在实验室环境中则用于量化多种大小物种的视觉功能，包括啮齿类动物和斑马鱼幼体^2,3,4,5。最常分析的ERG成分是a波和b波，分别起源于感光光感受器细胞和双极中间神经元。在斑马鱼幼体中，视网膜的分层结构在受精后3天（dpf）即已形成，光感受器视锥细胞终末突触的形态在4 dpf前已发育成熟^6,7。因此，斑马鱼幼体的外层视网膜功能在4 dpf前即已建立，意味着从这一早期阶段起即可记录到ERG信号。由于实验周期短且模型具有高通量特性，ERG已被应用于斑马鱼幼体，用于疾病模型的功能评估、色觉与视网膜发育分析、视觉昼夜节律研究以及药物测试^8,9,10,11,12。

然而，目前斑马鱼幼鱼ERG的研究方法存在一些复杂性，可能使其难以推广应用。已发表的斑马鱼幼鱼ERG实验方案通常使用充满导电液体的玻璃微电极作为记录电极^3,4,5,13，这要求微电极尖端具有很高的质量³。其制备需要专用设备，例如微电极拉制仪，某些情况下还需使用微电极抛光仪。这对于资源有限的实验室而言可能构成挑战，即使是在改造现有的小型动物ERG系统以用于斑马鱼幼鱼视觉功能检测时，也会带来额外成本。即使经过打磨处理，微电极尖端仍可能损伤幼鱼眼球表面。此外，商用的电生理微电极夹持器通常内置固定的银丝，这些银丝在反复使用后容易发生钝化，导致必须购买新的夹持器，从而增加维护成本。

本文介绍了一种使用锥形海绵尖记录电极的视网膜电图（ERG）方法，该方法特别适用于将已建立的小动物ERG装置改造用于幼年斑马鱼的ERG测量。该电极可利用常见的聚醋酸乙烯（PVA）海绵和细银丝轻松制作，无需其他专用设备。我们的数据显示，这种新型电极具有足够的灵敏度和可靠性，能够展示幼年斑马鱼在受精后4至7天（dpf）期间视网膜神经回路的功能发育。这种经济且实用的海绵尖电极可能对建立新的ERG系统或改造现有小动物系统的斑马鱼研究者具有帮助。

方案

所有视网膜电图（ERG）操作均按照澳大利亚国家卫生与医学研究委员会关于动物护理与使用的实践准则进行，并已获得墨尔本大学机构动物伦理委员会的批准。

1. 缓冲液的配制

1. 使用反渗透（RO）水配制10倍浓度的金鱼林格氏液（1.25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mM CaCl₂, 10 mM MgCl₂, 100 mM 葡萄糖, 100 mM HEPES）。将缓冲液pH值调节至7.8，并使用0.22 μm滤膜过滤除菌。将10倍浓度的缓冲液作为储备液于4 °C保存³。
   注意：10倍浓度林格氏液应在3个月内使用完毕。
2. 实验当天，使用反渗透水将10倍浓度金鱼林格氏液稀释为1倍浓度。
   注意：1倍浓度金鱼林格氏液用于浸润PVA海绵，包括用于放置斑马鱼幼体的海绵以及记录电极尖端上的海绵。

2. 电极制备

1. 准备锥形海绵记录电极。
   1. 使用手术刀片从铂电极引线延长线的雄性端切下，并小心去除末端10 mm的外层聚四氟乙烯绝缘涂层，注意不要损坏电极引线的内部金属丝。
   2. 剪取一段40 mm长的银丝（直径0.3 mm），将其与暴露的内部金属丝紧密缠绕连接，并用绝缘胶带包裹连接处，使约15 mm长度的银丝保持暴露（图1A）。
   3. 使用9 V直流电源对暴露的银丝进行60秒的氯化电镀，以改善信号传导性能。将暴露的银丝尖端浸入生理盐水中，并将引线另一端连接至电池正极；另取一根导线连接电池负极，并将该导线的另一端浸入盐水中²。
      注意：也可将银丝在漂白剂溶液（有效成分为42 g/L次氯酸钠）中浸泡1小时进行氯化处理。
   4. 使用剪刀裁剪一块约20 mm × 20 mm的PVA海绵，制成锥形（图1A）。用1×Ringer缓冲液充分浸润海绵。在带有目镜标尺的显微镜下，使用手术刀片将锥体尖端修整至直径约40 µm。将锥形海绵置于吸水纸巾上自然风干，直至变硬定型。
      注意：PVA海绵在浸润后会显著膨胀，因此必须先用生理盐水充分饱和后再修整锥体尖端。
   5. 完成氯化处理后，将银丝在吸水纸巾上空气干燥5分钟。将银丝从锥体底部插入已干燥、坚硬的锥形PVA海绵中。使用遮蔽胶带包裹任何额外暴露的金属部分，以减少光伏伪影（图1B-C）。
      注意：每次实验结束后，应将海绵从银丝上取下，用反渗透水清洗并风干后可重复使用。为确保最佳信号采集效果，建议银丝一次性使用。PVA海绵重复使用不应超过5次。
   6. 实验当天，将记录电极的海绵尖端浸入1×Ringer缓冲液中至少15分钟，以确保海绵完全饱和。
2. 参考电极的制备方法同上，但不连接海绵尖端。
3. 购买商用接地电极。

3. 斑马鱼制备

1. 将斑马鱼幼鱼在黑暗中适应过夜（>8 小时）前，将斑马鱼放入 15 mL 离心管中，以进行记录<每管20只幼虫，用铝箔纸包裹后置于暗培养箱中。打开管盖以确保充足的氧气供应。
2. 记录当天，将装有幼虫的、用铝箔包裹的锥形管盖紧管盖，确保管子避光。将幼虫运送至ERG实验室。
3. 在黑暗环境中，借助发光二极管（LED；17.4 cd·m⁻²）提供的微弱红光照明，将鱼倒入培养皿中。^-2，λ_最大值 600 nm）。使用避光毛巾覆盖培养皿，以尽量减少光照暴露。

4. 海绵平台的制备

1. 将一块干燥的PVA海绵切割成矩形，使其能紧密贴合于35 mm的培养皿中。确保海绵的厚度大致等于培养皿的深度。
2. 在海绵一端沿垂直方向切出一个小切口，以容纳参比电极的银丝。
3. 将PVA海绵浸入1×金鱼林格氏缓冲液中，直至完全饱和。然后将海绵放入洁净的35 mm培养皿中。用纸巾吸去多余液体，直至轻轻按压海绵时无液体渗出。

5. 动物与电极定位

1. 使用用1x金鱼林格缓冲液稀释的0.02%三卡因麻醉幼鱼。
2. 用3 mL巴斯德吸管将一条麻醉后的幼鱼转移至一块纸巾上（约3 cm²）。
3. 用镊子将带有幼鱼的纸巾放置在湿润的海绵平台上。使用浸有林格缓冲液的细刷调整幼鱼的位置，确保其一只眼睛朝上，并与幼鱼下方纸巾上的任何液体隔离。
4. 用保湿眼用凝胶涂抹幼鱼身体（头部除外），以在整个ERG记录过程中保持幼鱼湿润。
5. 将带有海绵平台的培养皿置于法拉第笼内全视野碗状光源前方的小型水浴加热平台上（图1D）。
   注意：维持海绵和幼鱼身体的温度可确保稳定的ERG信号。
6. 将参考电极插入海绵平台上的切口中（图1D）。
7. 将商用接地电极连接至法拉第笼。
8. 将记录电极固定在电极夹持器上，并将夹持器固定在显微操作仪的立体定位臂上（图1D）。使用3 mL巴斯德吸管滴加一滴1x林格溶液至电极的海绵尖端，以重新饱和。
9. 在法拉第笼内将显微镜置于ERG平台上方，以便放置电极。
   注意：应使用微弱的红色LED光源（17.4 cd·m^-2，λ_max 600 nm）提供照明，以便观察幼鱼并放置活性电极，同时维持暗适应状态。
10. 调整海绵平台的位置，以便在显微镜下观察幼鱼。然后使用吸水纸巾去除电极海绵尖端的多余液体。
11. 调整活性电极位置，使其轻轻接触幼年斑马鱼眼睛的中央角膜表面（图1E）。
12. 移动全视野碗使其靠近海绵平台，并确保幼鱼被完全覆盖。
13. 关闭法拉第笼以减少外界电磁噪声。

6. 视网膜电图记录

1. 使用特定ERG系统配套的计算机软件（详见材料表）触发刺激，并根据下述推荐设置采集数据²。
   1. 在采集软件中将系统的采样率设置为4 KHz，记录时间窗为650 ms（共2,560个数据点）。
   2. 将系统的增益设置为1,000×。
   3. 将系统的带通滤波设置为1–300 Hz。
   4. 使用陷波滤波器以降低60 Hz（或根据当地电网频率为50 Hz）的噪声。
      注意：理想的噪声水平应不超过±10 µV。
2. 按照以下步骤开始数据采集。
   1. 使用单次测试闪光（0.06 log cd·s/m²）记录眼的测试反应，以评估电极的位置。
      注意：该强度的测试闪光在4天龄幼鱼中应产生大于25 µV的b波振幅。若无法记录到明显反应，则需重新调整电极位置，并再次进行测试闪光，以确认电极已正确放置。
   2. 测试闪光后，让动物在完全黑暗中暗适应3分钟，再开始记录。
   3. 按从弱到强的顺序呈现闪光刺激。
   4. 根据信噪比对重复信号进行平均。
      注意：通常在较弱光强下需平均更多信号（不少于3次重复），在较强光强下可减少平均次数（通常为1次）。从最弱到最强光强，逐渐延长刺激间间隔，从10秒增至60秒。示例实验方案见表1。
   5. 记录完成后，使用0.1%三卡因人道处死幼鱼。

7. 分析

1. 从基线到负向a波波谷测量a波振幅，从负向a波波谷到正向b波波峰测量b波振幅。
2. 分别从刺激开始至a波波谷和b波波峰，测量a波和b波的潜伏期。

结果

本部分提供了从4至7天后受精（dpf）期间每日记录的视网膜电图（ERG）代表性结果。自4 dpf起，ERG反应显示出明显的a波和b波成分，分别来源于光感受器细胞和双极细胞。在每个检测日龄，b波的振幅均随光强度的增加而增大（图2；图3）。值得注意的是，幼年斑马鱼视网膜对较弱闪光的敏感性随日龄增长而提高。在4 dpf时，当刺激强度低于-1.61 log cd·s/m²时，a波和b波均无法识别；而在相同强度下，较年长的幼鱼则可检测到清晰的信号（图2）。b波反应在4至5 dpf之间显著增强（P < 0.0001；图2A-B；图3B）。尽管在较低强度下，5至7 dpf之间的b波变化较小，但在2.48 log cd·s/m^2<...

讨论

诸如视网膜电图（ERG）等功能性检测指标，在研究幼年斑马鱼的工具组合中正变得越来越重要^8,9,12,14。由于幼年斑马鱼眼睛体积较小，大多数已发表的实验方案均采用玻璃微电极作为记录电极^{3,4,5,8,9,12,13,14}。本文描述了一种使用更简单的锥形海绵...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 滤膜	Millex GP	SLGP033RS	用于过滤 10× 金鱼林格氏液，以实现灭菌
1 mL 注射器	Terumo	DVR-5175	配备 30G × ½" 针头，用于向电极海绵尖端滴加生理盐水，防止干燥及视网膜电图（ERG）信号噪声增加
30 G × ½" 针头	Terumo	NN*3013R	用于向海绵尖端电极添加生理盐水
生物放大器	ADInstruments	ML135	用于放大视网膜电图（ERG）信号
次氯酸钠漂白液	King White	9333441000973	用于银电极氯化的替代方法；活性成分为 42 g/L 次氯酸钠
循环水浴锅	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	用于制作水浴加热平台
电极导线	Grass Telefactor	F-E2-30	铂金电缆，用于连接银丝电极与放大器
法拉第笼	Photometric Solution International		用于维持暗适应状态，并包裹全视野刺激装置（Ganzfeld setup），以提高信噪比
全视野刺激碗（Ganzfeld Bowl）	Photometric Solution International		定制设计的光刺激器：直径 36 mm，孔径 13 cm
Luxeon 发光二极管（LED）	Phillips Light Co.		用于光刺激，包含二十个 5W 和一个 1W 的 LED
显微操作器	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	在实验过程中固定记录电极
Microsoft Office Excel	Microsoft	version 2010	用于数据分析的电子表格软件
保湿眼用凝胶	GenTeal Gel	9319099315560	用于在记录期间覆盖斑马鱼幼体，防止脱水；活性成分为 0.3% 羟丙基甲基纤维素和 0.22% 卡波姆 980
巴斯德移液管	Copan	200C	用于小心转移斑马鱼幼体
Powerlab 数据采集系统	ADInstruments	ML785	控制 LED 以产生刺激信号
聚乙烯醇（PVA）海绵	MeiCheLe	R-1675	用于放置斑马鱼幼体，并制作锥形电极尖端
生理盐水溶液	Aaxis Pacific	13317002	用于银丝电极的电镀
Scope 软件	ADInstruments	version 3.7.6	通过 Powerlab 系统同步触发刺激并采集数据
银丝（细圆线）	A&E metal	0.3 mm	用于制作记录电极和参考电极
体视显微镜	Leica	M80	用于塑形并测量锥形海绵尖端（目镜带标尺）；置于法拉第笼内，用于电极定位
三卡因（Tricaine）	Sigma-aldrich	E10521-50G	用于麻醉斑马鱼幼体
水浴加热平台	定制		用于在视网膜电图（ERG）记录期间维持海绵平台及幼体体温