利用成像质谱技术捕捉组织与细胞间的小分子通讯

摘要

开发了一种新的样品制备方法，用于实现细胞与组织的共培养，以通过成像质谱技术检测小分子交换。

摘要

成像质谱技术（IMS）通常应用于三类样品：组织切片、球状体和微生物菌落。这些样品类型已使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行分析，以可视化蛋白质、脂质和代谢物在目标生物样品中的分布情况。我们开发了一种新型样品制备方法，结合了上述三种应用的优势，旨在探索一种尚未充分研究的癌症化学通讯识别策略：将哺乳动物细胞培养物接种于琼脂糖中，并与健康组织共培养，随后对样品进行干燥处理。该方法使哺乳动物组织与细胞在近距离内共培养，从而通过扩散实现组织与细胞间的化学通讯。在特定时间点，将基于琼脂糖的样品以与制备用于IMS分析的微生物菌落相同的方式干燥。本方法旨在模拟高级别浆液性卵巢癌（起源于输卵管）在转移过程中与卵巢相互作用时的通讯过程。通过优化样品制备条件，鉴定出去甲肾上腺素是卵巢微环境中的一种关键化学组分。这种新开发的方法可应用于其他需要理解相邻细胞或组织之间化学通讯的生物系统。

引言

成像质谱（IMS）已得到优化，可用于表征三种广泛应用中分子特征的空间分布：组织切片、类球体以及微生物菌落^1,2,3。组织切片可用于评估代谢物在宿主特定生物学背景下的定位情况，可针对特定质荷比范围进行靶向或非靶向分析。然而，当将健康组织与疾病状态（例如肿瘤）进行比较时，分子特征之间的差异最为显著且明显。这种IMS方法特别适用于疾病生物标志物的检测；然而，由于疾病进展过程中（如肿瘤分级）的组织样本通常仅在离散阶段获取，因而难以识别可能在疾病起始阶段起重要作用的信号。信息通过空间传递是许多生物系统的普遍特征，而组织切片无法捕捉这种动态的化学信号传递过程。一种能够可视化化学交换与扩散的技术是琼脂平板上培养的微生物菌落的IMS；小分子可在琼脂中扩散并穿过琼脂，进而通过基质辅助激光解吸/电离（MALDI-TOF）质谱进行检测⁴。该培养体系可用于鉴定不同独立生物实体（菌落）之间交换的分子，并可确定代谢物生成的方向性。最初为微生物菌落生长设计的实验平台已被改造用于研究哺乳动物细胞共培养的组织外植体的初级代谢，同时利用IMS评估体外哺乳动物系统中的动态化学交换过程。

近年来，研究逐渐明确，高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）通常起源于输卵管上皮（FTE），并在疾病早....

方案

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的规定，并经伊利诺伊大学芝加哥分校机构动物使用与护理委员会（IACUC）批准。

1. 试剂的准备

1. 在加湿培养箱中，将小鼠输卵管上皮细胞（MOE）维持于 37°C、5% CO₂ 条件下，培养基为添加了 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、10 mg/mL 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、1.8 ng/mL 表皮生长因子（EGF）、100 U/mL 青霉素-链霉素、1 mg/mL 庆大霉素和 18.2 ng/mL 雌二醇-17β 的 α 最低必需培养基（αMEM）。每 3–4 天传代一次细胞，并确保在小鼠安乐死当天有足够的细胞可用。
2. 通过将 1 g 低熔点琼脂糖与 50 mL 蒸馏水混合制备 2% 琼脂糖溶液。高压灭菌琼脂糖，冷却后在琼脂糖凝固前分装至 2 mL 离心管（见材料表）中，每管 1 mL。琼脂糖可无限期保存于 -20 °C。
3. 准备至少 2 mL 的 1× 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
4. 为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）制备基质，将 5 mg/mL 的 α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）与二羟基苯甲酸（DHB）按 1:1 比例溶于 90:10 乙腈:水（ACN:H₂O）并含 0.1% 三氟乙酸....

结果

经过最佳干燥处理的 ITO 载玻片将得到一个平整且完全脱水的样品，琼脂糖表面及其各部分之间应保持空间分离，表面无明显褶皱或仅有极轻微褶皱（图3）。图3A 显示了理想的干燥效果，而 图3B 显示了应避免出现的褶皱情况。该优化过程需在烘箱中对载玻片进行仔细监控，因为具体干燥时间会因相对湿度的不同而有所变化。虽然褶皱可能轻微影响样品高度，从而对成像质谱（IMS）信号的质量准确性产生一定影响，但轻微的褶皱不会影响数据的整体质量。因此，即使琼脂糖样品存在轻微褶皱，仍可使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行分析。载玻片必须完全干燥，否则在 MALDI-TOF 质谱仪的高真空环境中可能导致样品爆炸。

除琼脂糖外，其他基底材料也可能适用，但通常在干燥或移除小室后.......

讨论

越来越多的证据表明去甲肾上腺素在高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）中发挥作用^12,17,18，而该技术为此提供了更深入的机制性信息。由于同一张切片上可同时存在至少八种生物学条件，该方法可在一次成像质谱（IMS）运行中纳入生物学对照，例如基因和细胞特异性对照以及培养基对照。尽管该方法经过优化用于评估HGSOC原发性转移模型中交换的小分子，但任何可包埋于琼脂糖中的细胞或组织类型均可替代使用，从而可用于分析多种多样的生物学问题和疾病状态。

该实验方案中最重要的步骤之一是确保组织或细胞类型彼此紧密相邻，并位于琼脂糖凝胶块的中心。另一个重要考虑因素是整张载玻片干燥时间的优化。本方法使用卵巢组织进行优化，该组织易于干燥，且因其体积较小，干燥过程中几乎不会出现问题。然而，其他成分不同的组织（如脂肪组织）具有截然不同的干燥特性，因此需要更深入的干燥条件优化。在针对特定生物样本完成干燥条件优化后，后续实验流程仅需进行.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL Falcon 离心管	Denville	C1017-O	用于收集细胞
8孔腔室（Millipore EZ-slide 腔室）	Millipore	PEZGS0816	由 Millipore Millicell EZ-slide 腔室载玻片改装而来
乙腈	Sigma-Aldrich	34998-4L	喷雾基质的溶剂
α-最低必需培养基（αMEM）	Fisher	10-022-CV	细胞培养基
Autoflex speed MALDI-TOF LRF	Bruker		用于成像质谱（IMS）数据分析
离心机	Eppendorf	5810 R	用于收集细胞并去除上清液
CHCA 基质	Bruker Daltonic	8201344	喷洒于干燥载玻片上的基质
DHB 基质	Bruker Daltonic	8201346	喷洒于干燥载玻片上的基质
一次性手术刀	Fisher	22-079-707	用于摘除卵巢
解剖剪刀	Fisher	13-804-6	用于摘除卵巢
DMEM 培养基	Gibco	11995-065	与琼脂糖混合的培养基
表皮生长因子	Peprotech Inc.	100-15	细胞培养基添加剂
Eppendorf 管	Genesee Scientific	22-282	用于分装琼脂糖
雌二醇-17β	Sigma-Aldrich	E2758	细胞培养基添加剂
胎牛血清	Denville	fb5001	细胞培养基添加剂
FlexControl 3.4	Bruker Daltonic		IMS 数据采集软件
FlexImaging 4.1	Bruker Daltonic		IMS 数据分析软件
镊子（精细）	Fisher	22-327379	用于摘除卵巢
庆大霉素	Cellgro	30-005-CR	细胞培养基添加剂
胰岛素、转铁蛋白、硒（ITS）	Sigma-Aldrich	11074547001	细胞培养基添加剂
ITO 涂层载玻片	Bruker	8237001	共培养孵育平台
Leibovitz L-15 培养基	Gibco	11415064	组织解剖过程中使用的培养基
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081	细胞培养基添加剂
低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9414-10G	与培养基混合用于铺板
培养基容器	Corning	4870	用于切割塑料隔板以制备分隔腔室
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	细胞培养基添加剂
多肽校准标准品	Bruker Daltonic	8206195	中等质量范围校准物
磷红	Sigma-Aldrich	343-242-5G	低质量范围校准物
SCiLS Lab 2015	Bruker Daltonic		IMS 数据统计分析软件
外科镊子（钝头）	Fisher	08-875-8B	用于摘除卵巢
TFA	Fisher Technologies	A116-50	添加至基质溶液中
TM 喷雾仪	HTX Technologies		用于施加基质