利用成像质谱技术捕获组织与细胞之间的小分子通信

摘要

提出了一种新的样品制备方法, 以适应细胞和组织共培养, 以检测小分子交换使用成像质谱。

摘要

成像质谱 (IMS) 通常应用于三种类型的样品: 组织切片、球体和微生物菌落。使用矩阵辅助激光分离/飞行时质谱 (ALDI-TOF MS) 对这些样本类型进行了分析, 以可视化蛋白质、脂质和代谢物在感兴趣的生物样品中的分布。我们开发了一种新的样品制备方法, 该方法结合了前三个应用的优势, 通过将哺乳动物细胞培养播种成琼脂糖, 解决了一种未被充分探索的方法, 用于识别癌症中的化学通信。与健康组织一起共培养, 然后对样品进行干燥处理。哺乳动物组织和细胞在近距离被培养, 允许通过组织和细胞之间的扩散进行化学交流。在特定的时间点, 琼脂样品的干燥方式与为 IMS 分析准备的微生物菌落相同。我们的方法是建立模型的沟通之间的高水平浆液卵巢癌从输卵管, 因为它与卵巢在转移过程中的相互作用。样品制备的优化导致去甲肾上腺素作为卵巢微环境中的关键化学成分的鉴定。这种新开发的方法可以应用于其他生物系统, 这些系统需要了解相邻细胞或组织之间的化学通信。

引言

成像质谱 (ims) 经过优化, 可在组织切片、球体和微生物菌落 1^{、2、3三中}表征分子特征的空间分布。组织切片可用于评估代谢物在宿主生物条件下的定位, 无论是有针对性的还是在特定的质量范围内的非目标。然而, 当一个健康的组织与疾病, 例如肿瘤相比时, 分子特征之间的差异是最显著和最明显的。这种 IMS 方法特别适用于检测疾病生物标志物, 然而, 在疾病进展的离散阶段 (如肿瘤等级) 获取组织样本, 排除了对启动疾病的重要性信号的识别。疾病。通过空间交换信息是许多生物系统普遍存在的特征, 组织切片无法捕获这种动态化学继电器。一种能够可视化化学交换和扩散的技术是在琼脂板上生长的微生物菌落的 IMS;小分子能够通过琼脂扩散, 并可通过矩阵辅助激光去光电离 (MALDI-TOF) 质谱⁴捕获。这种生长装置可用于识别离散生物实体 (菌落) 之间交换的分子, 也可以确定代谢物生产的方向性。最初为微生物菌落生长设计的平台被用来探索哺乳动物细胞生长的组织外植体的初级代谢, 并利用 IMS 对体外哺乳动物系统中的动态化学交换进行了评价。

在过去的几年里, 很明显, 高级浆液性卵巢癌 (hgsoc) 通常起源于输卵管上皮 (fte), 然后在疾病早期发展^5,6,7.,8. 肿瘤性 fte 细胞扩散到卵巢的原因目前尚不清楚, 卵巢最终形成并进一步转移了大肿瘤。此前的研究主要集中在卵巢蛋白在卵巢原发转移中的作用;然而, 最近已经证明, 从健康组织到致瘤组织的转变会导致细胞代谢的大规模破坏, 并改变小分子^9,10,11的产生。因此, 我们假设 FTE 和卵巢之间交换的小分子可能是 HGSOC 原发转移的部分原因。

利用我们新开发的 IMS 程序, 我们已经确定, 肿瘤致动 FTE 和健康卵巢组织的共培养诱导从卵巢产生去甲肾上腺素。然而, 其他细胞类型或正常的 FTE 细胞并没有引起这种效果。这种方法的一个非凡的好处是, 代表真实分子的分子产生和信号交换可以可视化, 因此即使在共业中, 也可以确定信号的来源。与对所有空间信息都丢失的同质化样品进行分析相比, 这是一个优势。在我们的模型系统中, 我们能够清楚地将去甲肾上腺素的产生分配给卵巢。去甲肾上腺素与卵巢癌的转移和化学耐药有关, 我们对这种分子的检测已经证实, 新的 ims 方法可以发现生物相关分子^{12,13 ,14}. 这一验证使我们能够提出, IMS 的这一新应用对试图识别共培养环境中的小分子和了解影响细胞转化的早期事件的研究小组特别有帮助和转移。该方法的总体目标是阐明小分子在组织和器官间交换过程中的身份和空间分布, 这些组织和器官以体外三维细胞培养或体外组织为代表。

方案

所有动物程序都符合国家卫生研究院《实验室动物护理和使用准则》, 并得到芝加哥伊利诺伊大学机构动物使用和护理委员会的批准。

1. 试剂的制备

1. 在α最小基本培养基 (αMEM) 培养基的加湿孵化器中保持小鼠输卵管上皮细胞 (moe) 37°C, 并辅以10% 的胎牛血清 (fbs)、2mm l-谷氨酰胺、10mgml 胰岛素、转铁蛋白、硒 (its), 1.8 ngml 表皮生长因子 (EGF)、100 U/peniclin 链霉素、1 Mg/l 庆大霉素和 18.2 ngml estradol-17β。每3-4天通过一次细胞, 确保在牺牲老鼠的同一天有足够的细胞。
2. 将1克低熔融琼脂糖与50毫升的蒸馏水混合, 制备2% 琼脂糖。高压灭菌器琼脂糖, 允许冷却, 然后在琼脂糖凝固之前, 在2毫升管中使用 aliquot (1 mL ) (见材料表)。琼脂糖可以无限期地储存在-20°c。
3. 准备至少2毫升的1x 杜尔贝科的修改鹰的媒体 (DMEM) 介质。
4. 对于 MALDI-TOF MS 的矩阵, 在 90:acn:h 2 o + 0.1% 三氟乙酸 (TFA) 中制备 10 mgml 为1Α-氰基-4-透明肉桂酸 (chca):d 羟基苯甲酸 (DHB) (见材料表).松解, 直到矩阵溶解。

2. 老鼠殖民地和子房去除

1. 使用标准住房程序维持 cd-1小鼠的繁殖对。在分娩当天附近, 每天检查老鼠, 这样幼崽的年龄就知道了。
2. 根据国家卫生研究院的指导原则, 在16-18岁时通过吸入二氧化碳对幼崽进行安乐死。交付 CO₂ (100%)以每分钟 10%-20% 的室体积, 并在呼吸停止后继续两分钟。通过宫颈脱位确认安乐死。
3. 用70% 乙醇淹没所有手术设备进行消毒。温暖莱博维茨的 L-15 培养基与1x 青霉素链霉素到37°c。
4. 用70% 的乙醇弄湿腹部表面, 对该区域进行消毒, 并最大限度地减少头发污染。用钝器抓住覆盖腹壁的皮肤, 用手术剪刀将皮肤和腹壁切开一个大 v 形, 露出内脏。
5. 用钳子将内脏移动到一侧。用精细的钳子单独抓住每个子宫角, 轻轻抬起。
6. 找到卵巢, 它将在子宫角的末端, 紧接肾脏的下方。使用手术剪刀解剖卵巢没有结缔组织。然后, 把卵巢角切成两半。
7. 将卵巢、输卵管和大约一半的子宫角转移到预热的莱博维茨的 L-15 培养基上。
8. 在解剖显微镜下小心地将每个卵巢从周围的囊中移开, 使其从输卵管、囊和任何脂肪组织中解脱出来。将每个卵巢移动到莱博维茨 l-15 媒体的新菜。
9. 将每个子房切成半轴向。将卵巢碎片 (现在称为外植体) 保持在 37°c, 直到琼脂糖电镀。

3. 设置和孵化经 ito 处理的滑块

1. 未分割的共用
   1. 将琼脂糖在70°c 时液化在热板上。
   2. 将8井分隔线放在经过过的一氧化二氮 (ITO) 处理的幻灯片上 (图 1a)。分压机上的橡胶底部有助于粘附在滑块上, 但在琼脂糖电镀过程中一定要施加连续的温和向下压力, 以确保井间不会漏水或混合。
   3. 在15毫升锥形管中收集细胞, 离心机 (800 转/分 5分钟), 并在 1x DMEM 介质中重新悬浮到每 150μl 50Μl 的50k 细胞。如果不同的细胞密度是最佳的, 请确保在此步骤中, 细胞悬浮液是所需最终密度的 2倍 (例如, 对于300Μl 中 50, 000个细胞的最终浓度, 此步骤中的细胞密度为150μl 中的 50, 000个细胞)。
   4. 在电镀细胞培养之前, 在井心加入卵巢外植体 (图 1b)。
   5. 在电镀前, 在单个2毫升管中的每个细胞培养中加入琼脂糖。对于每口井, 将200Μl 的细胞悬浮液和200μl 的液化琼脂糖结合在一个2毫升的管中。例如, 对于四口井, 将800Μl 的细胞悬浮液和800μl 的2% 琼脂糖结合起来。一些混合物将被留下, 但使稍微超过必要的避免气泡在移液过程中。
      1. 在电镀该细胞培养之前, 立即在单个细胞培养中添加琼脂糖。琼脂糖将在不到一分钟的时间内冷却, 所以要准备好迅速板块。
   6. 立即将细胞琼脂糖混合物的300μl 添加到每口井中 (图 1C)。图 1c显示了三个单元条件和一个介质条件, 每个都有一个卵巢和没有卵巢。
   7. 在37°c 和 5% co 2 下加湿孵化器中孵育滑块。
2. 分裂的组织。
   1. 从薄薄的光滑塑料中切割分隔线 (图 2 a)。
      注: 本实验使用无菌一次性媒体盆的两侧, 因为它们是平薄的。将它们切割得足够宽, 以紧贴井的斜边 (~ 13 毫米)。
   2. 将琼脂糖在70°c 时液化在热板上。
   3. 将8井分隔线放在 ito 处理的幻灯片顶部 (图 2b)。分压机上的橡胶底部有助于粘附在滑块上, 但在琼脂糖电镀过程中一定要施加连续的温和向下压力, 以确保井间不会漏水或混合。
   4. 在15毫升锥形管中收集细胞, 离心机 (800 转/分 5分钟), 并在 1x DMEM 介质中重新悬浮到每 150μl 50Μl 的50k 细胞。如果不同的细胞密度是最佳的, 请确保在此步骤中, 细胞悬浮液是所需最终密度的 2倍 (例如, 对于300Μl 中 50, 000个细胞的最终浓度, 此步骤中的细胞密度为150μl 中的 50, 000个细胞)。
   5. 将塑料分隔线对角插入井中 (图 2c)。
   6. 在电镀前的每个细胞悬浮液中一次添加琼脂糖。对于每口井, 将100μl 的细胞悬浮液和100μl 的液化琼脂糖结合在一个2毫升的管中。例如, 对于四口井, 将400μl 的细胞培养和400μl 的2% 琼脂糖结合起来。一些细胞糖混合物将被留下, 但使稍微超过必要的避免气泡在移液过程中。
      1. 在电镀该细胞培养之前, 立即在单个细胞培养中添加琼脂糖。琼脂糖将在不到一分钟的时间内冷却, 所以要准备好迅速板块。
   7. 在分隔线的一侧, 板150Μl 的细胞琼脂糖混合物。允许琼脂糖冷却和凝固 (大约 1分钟), 然后取出分隔线 (图 2d)。
   8. 将卵巢外植体放在井的空一半的中心。将 150μl-媒体-琼脂糖混合物放置在卵巢顶部, 并且仅放置在井的正确一侧 (图 2e)。
   9. 在37°c 和 5% co 2 下加湿孵化器中孵育滑块。

4. 干燥幻灯片和准备 MALDI-TOF MS

1. 四天后 (或任何首选时间点) 后, 从琼脂糖插头和滑块上取下室分频器 (图 1d)。用扁平的铲子轻轻地将琼脂从室内分离出琼脂的两侧, 轻轻地将室内向上拉, 注意不要移动任何琼脂糖插头。如果它们确实移动, 轻轻重新定位它们, 这样它们就不会互相接触。
2. 将滑块放在37°c 的烤箱中大约 4小时, 每小时旋转90°。
   请注意:滑块的旋转对于确保整个样品的均匀热量分布非常重要。
3. 干燥后, 将幻灯片从烤箱中取出 (图 1e)。
4. 使用喷雾器应用矩阵溶液 (图 1F), 具有以下参数: 温度 = 30°c, 流速 = 0.2 mL/min, 刀路数 = 8, 方向 = cc, 喷嘴距离 = 40 mm。
   注: 艺术喷枪可以用来应用液体矩阵, 而不是矩阵喷雾器。相同的矩阵溶液可用于喷涂, 但所需溶液的数量大约是原来的两倍。在将滑块夹紧使其垂直悬挂时, 从大约1英尺远的地方 (从 Hoffmann¹⁵改编) 的90°角度喷射滑块, 直到可以看到矩阵层。
5. 加入1Μl 的校准剂 (磷红的目标和 lt;500 的, 一种肽混合物 (见材料表) 的目标和 lt;5,000 da), 以清除幻灯片上的斑点。磷红不需要与基质混合, 但肽混合物需要1:1 与基质的混合物, 以帮助电离。等待校准干燥。
6. 在幻灯片的每个角落使用永久标记绘制 X, 并使用相机或扫描仪拍摄 1, 200 dpi 的光学图像。

5. 成像质谱数据采集

1. 在 IMS 数据分析软件上打开一个新序列 (请参见材料表)。将栅格宽度设置为所需的空间分辨率, 至少为50μm。
2. 将幻灯片的光学图像上载到分析软件, 并使用每个角中 x 的交叉点设置三个教学点。
3. 在采集软件中指定感兴趣的成像区域, 并相应地对其进行命名。
4. 使用数据采集软件 (见材料表) 在 5 ppm 误差范围内校准仪器。
5. 保存优化后的方法并开始运行。本实验优化了以下参数: 极性 = 正, 检测器 = 反射管, 激光尺寸 = 2, 激光功率 = 50%, 反射器模式检测器增益 = 3倍。

6. 处理 IMS 数据

1. 将. mis 文件导入统计软件 (见材料表), 以分析意义。

结果

最佳干燥的 ITO 滑块将产生一个扁平干燥的样品, 在琼脂糖和琼脂糖件的表面上有最小到没有皱纹, 从而保持滑块上的空间分离 (图 3)。图 3 a显示了最佳干燥, 而图 3 b显示了应避免的皱纹。这种优化需要仔细监测烤箱中的滑梯, 因为确切的时间可能会根据相对湿度而变化。虽然皱纹会对高度产生轻微影响, 因此 IMS 信号的质量精度也会下降, 但轻微的皱纹不会影响数据的质量。因此, 任何最终有轻微皱纹的琼脂糖仍然可以通过 ALDI-TOF MS 进行分析。幻灯片必须完全干燥, 否则这可能导致样品在 MALDI-TOF 质谱仪的高真空环境中爆炸。

除琼脂糖之外的其他基材可能有效, 但在井室干燥或拆除时, 有时不会保持其结构完整性, 从而导致在 ITO 滑块中蔓延, 空间信息丢失。...

讨论

越来越多的证据表明, 去甲肾上腺素在 hgsoc^{12、17、18 中}的作用, 这种技术提供了更多的机械信息。由于同一幻灯片上至少有8个生物条件, 该方法可以解释基因和细胞特异性等生物控制, 以及单一 IMS 运行中的媒体控制。虽然该方法经过优化, 以评估在 HGSOC 原发转移模型中交换的小分子, 任何细胞或组织类型, 可以放置在琼脂糖, 以分析各种生物问题和疾病状态。

该协议中最重要的步骤之一是确保组织或细胞类型彼此接近, 并存在于琼脂糖插头的中心。另一个重要的考虑因素是优化整个滑梯的干燥时间。该方法采用卵巢组织进行优化, 卵巢组织易于干燥, 体积小, 导致干燥并发症少。然而, 其他组织, 具有不同的成分, 如脂肪, 有非常不同的干燥配置文件, 因此需要更广泛的干燥优化。在对生物样品进行干燥优化后, 剩余的工作流程只需进行最小的更改。

在质...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL Falcon 管	Denville	C1017-O	收集细胞
8 孔室（Millipore EZ 滑动室）	Millipore	PEZGS0816	从 Millipore Millicell EZ 滑动室滑动物
乙腈	Sigma-Aldrich	34998-4L	喷雾基质溶剂
α 最低必需培养基 （αMEM）	Fisher	10-022-CV	细胞培养基
Autoflex speed MALDI-TOF LRF	布鲁克		用于 IMS 数据分析
离心机	Eppendorf	5810 R	收集细胞并去除上清液
CHCA 基质	Bruker Daltonic	8201344	基质喷涂到干燥的载玻片上
DHB 基质	Bruker Daltonic	8201346	基质喷涂到干燥的玻片上
一次性手术刀	Fisher	22-079-707	用于去除卵巢
解剖剪刀	Fisher	13-804-6	用于去除卵巢
DMEM Media	Gibco	11995-065	与琼脂糖
表皮生长因子混合的	Peprotech Inc.	100-15	细胞培养基补充剂
Eppendorf 管	Genesee Scientific	22-282	用于琼脂糖等分试样
雌二醇-17&β;	Simga-Aldrich	E2758	细胞培养基补充剂
胎牛血清	Denville	fb5001	细胞培养基补充剂
FlexControl 3.4	布鲁克 Daltonic		IMS 数据采集软件
FlexImaging 4.1	布鲁克 Daltonic		IMS 数据分析软件
镊子（精细）	Fsiher	22-327379	用于去除卵巢
庆大霉素	Cellgro	30-005-CR	细胞培养基补充剂
胰岛素、转铁蛋白、硒 （ITS）	Sigma-Aldrich	11074547001	细胞培养基补充剂
ITO 包被玻片 Bruker		8237001	共培养培养平台
Leibovitz's L-15 培养基	Gibco	11415064	组织中使用的培养基解剖
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081	细胞培养基补充剂
低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9414-10G	与电镀培养基
混合 培养基盆	Corning	4870	用于切割分流室的塑料隔板
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	细胞培养基补充剂
肽校准标准	Bruker Daltonic	8206195	中等质量范围校准品
Phophorus red	Sigma-Aldrich	343-242-5G	低质量范围校准剂
SCiLS Lab 2015	Bruker Daltonic		IMS 数据统计分析
手术钳（钝器）	Fisher	08-875-8B	用于切除卵巢
TFA	Fisher技术	A116-50	添加到基质溶液
TM 喷雾器	HTX 技术		用于涂抹基质