Method Article

利用成像质谱技术捕获组织与细胞之间的小分子通信

DOI:

10.3791/59490

⸱

April 3rd, 2019

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1Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Animal Science, University of Illinois at Urbana-Champaign

In This Article

Summary

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提出了一种新的样品制备方法, 以适应细胞和组织共培养, 以检测小分子交换使用成像质谱。

Abstract

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成像质谱 (IMS) 通常应用于三种类型的样品: 组织切片、球体和微生物菌落。使用矩阵辅助激光分离/飞行时质谱 (ALDI-TOF MS) 对这些样本类型进行了分析, 以可视化蛋白质、脂质和代谢物在感兴趣的生物样品中的分布。我们开发了一种新的样品制备方法, 该方法结合了前三个应用的优势, 通过将哺乳动物细胞培养播种成琼脂糖, 解决了一种未被充分探索的方法, 用于识别癌症中的化学通信。与健康组织一起共培养, 然后对样品进行干燥处理。哺乳动物组织和细胞在近距离被培养, 允许通过组织和细胞之间的扩散进行化学交流。在特定的时间点, 琼脂样品的干燥方式与为 IMS 分析准备的微生物菌落相同。我们的方法是建立模型的沟通之间的高水平浆液卵巢癌从输卵管, 因为它与卵巢在转移过程中的相互作用。样品制备的优化导致去甲肾上腺素作为卵巢微环境中的关键化学成分的鉴定。这种新开发的方法可以应用于其他生物系统, 这些系统需要了解相邻细胞或组织之间的化学通信。

Introduction

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成像质谱 (ims) 经过优化, 可在组织切片、球体和微生物菌落 1、2、3三中表征分子特征的空间分布。组织切片可用于评估代谢物在宿主生物条件下的定位, 无论是有针对性的还是在特定的质量范围内的非目标。然而, 当一个健康的组织与疾病, 例如肿瘤相比时, 分子特征之间的差异是最显著和最明显的。这种 IMS 方法特别适用于检测疾病生物标志物, 然而, 在疾病进展的离散阶段 (如肿瘤等级) 获取组织样本, 排除了对启动疾病的重要性信号的识别。疾病。通过空间交换信息是许多生物系统普遍存在的特征, 组织切片无法捕获这种动态化学继电器。一种能够可视化化学交换和扩散的技术是在琼脂板上生长的微生物菌落的 IMS;小分子能够通过琼脂扩散, 并可通过矩阵辅助激光去光电离 (MALDI-TOF) 质谱4捕获。这种生长装置可用于识别离散生物实体 (菌落) 之间交换的分子, 也可以确定代谢物生产的方向性。最初为微生物菌落生长设计的平台被用来探索哺乳动物细胞生长的组织外植体的初级代谢, 并利用 IMS 对体外哺乳动物系统中的动态化学交换进行了评价。

在过去的几年里, 很明显, 高级浆液性卵巢癌 (hgsoc) 通常起源于输卵管上皮 (fte), 然后在疾病早期发展

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Protocol

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所有动物程序都符合国家卫生研究院《实验室动物护理和使用准则》, 并得到芝加哥伊利诺伊大学机构动物使用和护理委员会的批准。

1. 试剂的制备

  1. 在α最小基本培养基 (αMEM) 培养基的加湿孵化器中保持小鼠输卵管上皮细胞 (moe) 37°C, 并辅以10% 的胎牛血清 (fbs)、2mm l-谷氨酰胺、10mgml 胰岛素、转铁蛋白、硒 (its), 1.8 ngml 表皮生长因子 (EGF)、100 U/peniclin 链霉素、1 Mg/l 庆大霉素和 18.2 ngml estradol-17β。每3-4天通过一次细胞, 确保在牺牲老鼠的同一天有足够的细胞。
  2. 将1克低熔融琼脂糖与50毫升的蒸馏水混合, 制备2% 琼脂糖。高压灭菌器琼脂糖, 允许冷却, 然后在琼脂糖凝固之前, 在2毫升管中使用 aliquot (1 mL ) (见材料表)。琼脂糖可以无限期地储存在-20°c。
  3. 准备至少2毫升的1x 杜尔贝科的修改鹰的媒体 (DMEM) 介质。
  4. 对于 MALDI-TOF MS 的矩阵, 在 90:acn:h 2 o + 0.1% 三氟乙酸 (TFA) 中制备 10 mgml 为1Α-氰基-4-透明肉桂酸 (chca):d 羟基苯甲酸 (DHB) (见材料表).松解, 直到矩阵溶解。

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Results

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最佳干燥的 ITO 滑块将产生一个扁平干燥的样品, 在琼脂糖和琼脂糖件的表面上有最小到没有皱纹, 从而保持滑块上的空间分离 (图 3)。图 3 a显示了最佳干燥, 而图 3 b显示了应避免的皱纹。这种优化需要仔细监测烤箱中的滑梯, 因为确切的时间可能会根据相对湿度而变化。虽然皱纹会对高度产生轻微影响, 因此 IMS 信号的质量精度也会下降, 但轻微的皱纹不会影响数据的质量。因此, 任何最终有轻微皱纹的琼脂糖仍然可以通过 ALDI-TOF MS 进行分析。幻灯片必须完全干燥, 否则这可能导致样品在 MALDI-TOF 质谱仪的高真空环境中爆炸。

除琼脂糖之外的其他基材可能有效, 但在井室干燥或拆除时, 有时不会保持其结构完整性, 从而导致在 ITO 滑块中蔓延, 空间信息丢失。.......

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Discussion

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越来越多的证据表明, 去甲肾上腺素在 hgsoc12、17、18 中的作用, 这种技术提供了更多的机械信息。由于同一幻灯片上至少有8个生物条件, 该方法可以解释基因和细胞特异性等生物控制, 以及单一 IMS 运行中的媒体控制。虽然该方法经过优化, 以评估在 HGSOC 原发转移模型中交换的小分子, 任何细胞或组织类型, 可以放置在琼脂糖, 以分析各种生物问题和疾病状态。

该协议中最重要的步骤之一是确保组织或细胞类型彼此接近, 并存在于琼脂糖插头的中心。另一个重要的考虑因素是优化整个滑梯的干燥时间。该方法采用卵巢组织进行优化, 卵巢组织易于干燥, 体积小, 导致干燥并发症少。然而, 其他组织, 具有不同的成分, 如脂肪, 有非常不同的干燥配置文件, 因此需要更广泛的干燥优化。在对生物样品进行干燥优化后, 剩余的工作流程只需进行最小的更改。

在质.......

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Disclosures

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作者们没有什么可以透露的

Acknowledgements

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芝加哥生物医学联合会在芝加哥社区信托基金 (c-076) (l. m. s.) 的支持下提供了资金;伊利诺伊大学芝加哥创业基金分校 (l. m. s.);卵巢癌研究基金联盟提供543296赠款 (医学博士);和 U3 ES029073 (j. e. b.) 和国家卫生研究所国家促进转化科学中心, 通过 UL1TR002003 (JEB & LMS) 赠款。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Falcon 管DenvilleC1017-O收集细胞
8 孔室（Millipore EZ 滑动室）MilliporePEZGS0816从 Millipore Millicell EZ 滑动室滑动物
乙腈Sigma-Aldrich34998-4L喷雾基质溶剂
α 最低必需培养基 （αMEM）Fisher10-022-CV细胞培养基
Autoflex speed MALDI-TOF LRF布鲁克用于 IMS 数据分析
离心机Eppendorf5810 R收集细胞并去除上清液
CHCA 基质Bruker Daltonic8201344基质喷涂到干燥的载玻片上
DHB 基质Bruker Daltonic8201346基质喷涂到干燥的玻片上
一次性手术刀Fisher22-079-707用于去除卵巢
解剖剪刀Fisher13-804-6用于去除卵巢
DMEM MediaGibco11995-065与琼脂糖
表皮生长因子混合的Peprotech Inc.100-15细胞培养基补充剂
Eppendorf 管Genesee Scientific22-282用于琼脂糖等分试样
雌二醇-17&β;Simga-AldrichE2758细胞培养基补充剂
胎牛血清Denvillefb5001细胞培养基补充剂
FlexControl 3.4布鲁克 DaltonicIMS 数据采集软件
FlexImaging 4.1布鲁克 DaltonicIMS 数据分析软件
镊子（精细）Fsiher22-327379用于去除卵巢
庆大霉素Cellgro30-005-CR细胞培养基补充剂
胰岛素、转铁蛋白、硒 （ITS）Sigma-Aldrich11074547001细胞培养基补充剂
ITO 包被玻片 Bruker8237001共培养培养平台
Leibovitz's L-15 培养基Gibco11415064组织中使用的培养基解剖
L-谷氨酰胺Gibco25030-081细胞培养基补充剂
低熔点琼脂糖Sigma-AldrichA9414-10G与电镀培养基
混合 培养基盆Corning4870用于切割分流室的塑料隔板
青霉素-链霉素Gibco15140-122细胞培养基补充剂
肽校准标准Bruker Daltonic8206195中等质量范围校准品
Phophorus redSigma-Aldrich343-242-5G低质量范围校准剂
SCiLS Lab 2015Bruker DaltonicIMS 数据统计分析
手术钳（钝器）Fisher08-875-8B用于切除卵巢
TFAFisher技术A116-50添加到基质溶液
TM 喷雾器HTX 技术用于涂抹基质
培养基 中

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).
  2. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C.

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