本文描述了仅需短合成DNA和RNA寡核苷酸以及纯化的RNA聚合酶II（Pol II）即可组装Pol II延伸复合物的方法。这些复合物可用于研究与Pol II延伸复合物相关的转录过程中RNA加工机制。
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本文内容
摘要
摘要
真核生物mRNA的合成是一个复杂的生化过程，需要由多亚基酶RNA聚合酶II将DNA模板转录为前体RNA，并通过共转录的加帽和剪接过程将前体RNA加工为成熟的mRNA。在mRNA合成过程中，RNA聚合酶II延伸复合物会受到大量转录因子的调控，这些因子不仅调控其催化活性，还调控参与mRNA成熟过程的加帽、剪接以及3'端加工酶的活性。由于mRNA合成本身具有内在复杂性，因此建立能够分离并研究其各个共转录阶段的简化实验体系具有重要意义。
本文介绍了一种适用于研究共转录RNA加帽的简单实验系统。该系统依赖于由纯化的RNA聚合酶II和人工转录泡组装而成的定义明确的RNA聚合酶II延伸复合物。当通过生物素标记的DNA固定后，这些RNA聚合酶II延伸复合物可作为一种易于操作的工具，用于解析共转录RNA加帽过程，以及延伸复合物在共转录RNA加帽过程中招募和调控加帽酶的机制。我们预计，该系统还可被改造用于研究其他mRNA成熟阶段中与RNA聚合酶II延伸复合物偶联的蛋白质或蛋白质复合物的招募和/或组装过程。
引言
真核生物信使RNA（mRNA）的合成是一个复杂的生化过程，包括由RNA聚合酶II合成未加工的前体RNA，以及对该前体RNA进行加工以产生成熟的mRNA。加帽、剪接和多聚腺苷酸化等RNA加工步骤主要在转录过程中协同完成。RNA聚合酶II延伸复合物作为支架，招募并协调多种RNA加工酶的活性。因此，要深入理解成熟真核mRNA的生成机制，关键在于建立实验体系，以解析RNA加工酶被招募至延伸复合物以及这些酶在共转录加帽、剪接和多聚腺苷酸化过程中受调控的生化机制。
毫不奇怪，此类实验系统的建立一直十分困难。主要障碍在于Pol II转录过程本身具有显著的复杂性，仅在体外重建Pol II的基础转录，就至少需要五种通用转录起始因子：TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH1。此外，在体外重建任何一种受调控的Pol II转录过程，则需要更多种类的转录因子和共调节因子。因此，一个重要的目标一直是开发更简单的实验系统，以重建适用于研究Pol II转录与RNA加工功能偶联的活性Pol II延伸复合物。
一种用于重建具有活性的Pol II延伸复合物的较简单方法，已被证明对研究延伸状态下的Pol II的结构与生物化学特性具有重要价值，最近还被用于研究共转录RNA加工过程2,3
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方案
1. 人工延伸复合物的组装与Pol II行进
- 将含有3’生物素分子的1 nmol非模板DNA寡核苷酸固定在磁珠上。
注意： 以下步骤可预先完成，以备后续实验使用。本方案中使用的所有寡核苷酸序列均列于 表1RNA 寡核苷酸经 5’-三磷酸化修饰合成。- 向一个低蛋白结合力的1.5 mL离心管中加入200 µL磁珠（10 mg/mL），然后置于磁力架上静置2 min。
- 当离心管置于磁力架上时，小心移除管内液体，避免扰动磁珠。为洗涤磁珠，先将离心管从磁力架上取下，加入1 mL的5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl，将离心管放回架上，2分钟后移除洗涤液。
- 用相同的缓冲液再重复洗涤2次，每次200 µL。
- 将磁珠重悬于 400 µL 的 10 毫摩尔 Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA，2 M NaCl，缓冲液。然后与380 µL H2O 和 20 µL 的 10 µM 无模板生物素化 DNA 寡核苷酸。将试管置于旋转混合仪上，室温孵育 30 分钟。
- 用 200 µL 的 5 洗涤固定化的非模板 DNA 寡核苷酸 3 次 mM Tris-HCl pH 7.5,....
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结果
图2 和 3 展示了用于生成含不同长度转录本的人工延伸复合物的代表性反应结果，该复合物由不同来源的Pol II延伸形成。图4 描述了如何利用这些延伸复合物检测共转录的CTD磷酸化依赖性RNA加帽反应。
图2A 是人工延伸复合物中DNA和RNA分子的示意图。图2B 显示了按照方案1中所述条件完全相同的反应所生成的不同长度的转录产物，其中起始的人工延伸复合物是使用20个核苷酸（nt）的合成RNA寡核苷酸（图2A 中深蓝色部分；RNA_20mer，表1）制备的。由于已知起始RNA的长度和DNA模板序列，因此可以确定将Pol.......
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讨论
研究旨在解析与RNA聚合酶II延伸复合物相关事件（如RNA加工及转录延伸本身的调控）时，使用高度纯化的酶系统可极大促进此类研究。然而，建立此类酶系统具有挑战性。RNA聚合酶II依赖启动子的转录至少需要五种通用转录因子。制备并储备这些因子可能耗时数月；因此，该过程中的限速步骤通常是制备在体外重建基础转录所必需的一系列转录因子。
本文介绍了一种对先前已建立的方法进行改进的方案，该方法仅使用纯化的Pol II以及合成的DNA和RNA寡核苷酸来构建人工转录延伸复合物2,3。所获得的延伸复合物具有转录活性，适用于研究Pol II转录与RNA加帽之间的偶联过程5。需要强调的是，转录和RNA加帽在体内是在染色质环境及多种其他蛋白质共同参与下进行的，而本体系中并未包含这些成分；因此，该体系可重现体内反应的许多特征，但并非全部。本文所述方案在先前方法的基础上，通过将生物素标记的DNA与磁珠结合，实现对人工延伸复合物的固定化，从而使研究人.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 S. Shuman 提供哺乳动物加帽酶 cDNA。本工作部分由堪萨斯城大社区基金会的海伦·尼尔森医学研究基金向斯托尔斯医学研究所提供的资助支持。本论文的原始数据可从斯托尔斯原始数据存储库获取，网址为 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | 用于RNA放射性标记 |
| 2x RNA上样缓冲液 | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | B0363S | 强烈推荐。用于RNA上样前的样品制备 |
| 40% 丙烯酰胺:Bis溶液 | Bio-Rad | 1610144 | |
| 牛血清白蛋白（20 mg/mL） | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1（CAK复合物）蛋白，具有活性，10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | 用于磷酸化Pol II CTD |
| DNA寡核苷酸 | IDT | 纯度要求详见表8 | |
| Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1磁珠 | 赛默飞世尔科技（Life Technologies Invitrogen） | 65001 | 我们也曾使用Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠且无问题，但更倾向于使用MyOne链霉亲和素磁珠，因其沉降速度更慢 |
| GlycoBlue共沉淀剂（15 mg/mL） | 赛默飞世尔科技（Life Technologies Invitrogen） | AM9516 | 强烈推荐。可使核酸沉淀呈现蓝色，显著提高反应操作的便利性 |
| Hoefer SE600标准双冷却垂直电泳系统，配备1 mm间隔垫片和15孔梳子 | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract高密度管（1.5 mL） | Qiagen | 129046 | 强烈推荐。含有高密度凝胶，可在水相与有机相之间形成稳定屏障，提高RNA提取得率 |
| 蛋白酶K溶液（20 mg/mL） | 赛默飞世尔科技（Life Technologies Invitrogen） | 25530049 | |
| RNA寡核苷酸 | Trilink | 更多细节详见表8 | |
| 酵母无机焦磷酸酶（100单位/mL） | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | NEBM2403S | 仅在加帽反应期间需要 |
参考文献
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble du....
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重印与许可
