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方法文章

培养与测量胎鼠及新生小鼠长骨

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DOI：

10.3791/59509

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2019年4月26日

 , 
1Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

本文内容

摘要

本文介绍一种适用于胎儿期和新生儿期小鼠长骨的离体培养方法，可在模拟体内过程的受控条件下，用于分析骨骼和软骨的发育及稳态。

摘要

长骨是复杂且动态的结构，通过软骨内成骨经由软骨中间阶段发育而来。由于难以获取健康的人类骨骼，使用哺乳动物模型（如小鼠和大鼠）来研究骨骼生长和稳态的各个方面显得尤为重要。此外，小鼠中日益成熟的遗传工具的发展使得对长骨生长进行更复杂的研究成为可能，同时也要求扩展用于研究骨骼生长的技术手段。本文介绍了一种详细的离体小鼠骨骼培养方案，可在严格控制的条件下研究骨和软骨，同时重现体内过程的大部分特征。该方法适用于多种骨骼的培养，包括胫骨、股骨和跖骨，但本文主要聚焦于胫骨的培养。此外，该方法还可与其他技术联合使用，例如延时活体成像或药物处理。

引言

器官的生长必须受到严密调控，以防止生长紊乱的发生，这一过程涉及多种细胞类型、分子通路以及身体不同部位之间的相互作用。成像技术对于研究胚胎在正常条件下以及系统受到干扰后随时间发生的动态变化至关重要。具有宫内发育特征的胚胎（例如广泛使用的啮齿类动物模型）为活体成像和药物处理带来了额外挑战，而离体培养技术可在一定程度上克服这些困难。为了成功重现体内过程并获得有意义的结果，为每种器官或组织找到合适的培养条件变得尤为关键。

哺乳动物骨骼的大多数骨骼通过软骨内成骨过程生长，其中胚胎期的软骨（由称为软骨细胞的细胞构成）驱动纵向生长，并逐渐被骨组织取代。这一过程发生在长骨末端的生长板处，生长板可分为三个区域：静止区、增殖区和肥大区1,2。首先，静止区中圆形的前体软骨细胞转变为增殖区中呈柱状排列并持续分裂的软骨细胞。在接下来的分化阶段，这些软骨细胞体积增大成为肥大软骨细胞，并开始分泌X型胶原蛋白。肥大软骨细胞协调后续的成骨过程：它们分泌关键的信号分子，如结缔组织生长因子、骨形态发生蛋白和印度刺猬因子，引导基质矿化，招募血管进入骨的中央区域，并在发生凋亡后，允许成骨细胞（成骨细胞）侵入基质，形成初级骨化中心3,4。矿化的基质有助于血管的穿透，成骨细胞借此迁移进入并以骨基质替代降解的软骨5。大多数成骨细胞从软骨周围包裹软骨的纤维层——软骨膜侵入软骨基质6。此外，一部分肥大软骨细胞能够存活并转分化为成骨细胞7,8,9。骨的最终长度取决于短暂存在的软骨所累积的生长量，而其生长速率又取决于肥大软骨细胞的数量、大小及其基质合成能力10。此外，最近研究表明，最后一个肥大阶段的持续时间与骨的最终长度相关11。因此，必须对这些细胞的增殖和分化进行严密调控，以确保骨骼大小正常。

尽管多年来在生长板的结构与发育方面已获得大量知识，但这些结论大多基于对固定组织切片的观察。组织切片能为此过程提供有价值的信息，但可能伴随技术性假象，因此并不总能可靠地用于评估不同阶段之间的形态或大小变化。此外，由于骨生长是一个动态过程，静态的二维（2D）图像对生长板中细胞运动的揭示有限，而对活体组织进行延时成像则可为软骨细胞在生长板中的行为提供重要信息。

使用离体骨培养技术有望解决上述所有局限性。尽管骨培养方案已发展了一段时间，但其应用主要局限于小鼠的长骨。大多数研究采用鸡胚骨骼，因为鸡模型在技术上具有优势12,13。已有研究将器官型培养（气液界面法）应用于鸡胚股骨，并在体外维持培养达10天14。小鼠模型拥有先进的遗传操作工具，使其在离体骨培养中极具吸引力。使用小鼠研究骨生长的相关工作大多集中于跖骨15，可能因其体积小且每枚胚胎可获取的数量较多16。然而，尽管跖骨传统上被视为长骨，但在体内其较其他长骨更早进入衰老状态（特征为细胞增殖减少及生长板退化17），因此其在离体条件下的持续生长并不能真实再现体内的自然过程。在本文中，我们将“长骨”定义为来自肢体近端和中段区域的骨骼。此前多项研究曾使用小鼠长骨（如胫骨）进行离体培养，观察到软骨显著生长，但骨化程度较低18。我们近期也主要利用胫骨培养来研究软骨细胞动态19。另有研究采用幼鼠的股骨头20，或仅取股骨远端部分进行培养21。一些较新的研究成功将完整骨骼的离体培养与延时成像技术结合，获得了活体小鼠组织中软骨细胞的三维（3D）动态影像22,23。研究人员得以观察到此前未被发现的软骨细胞向增殖区重排的过程23，充分展示了离体骨培养的潜在应用价值。相比之下，分析静态图像的方法则需依赖间接且复杂的技术。最近一项研究即为此例证，该研究评估了横向排列克隆在软骨生长中的作用，采用了多色报告基因小鼠品系进行遗传谱系追踪，并结合数学建模分析24。因此，离体骨培养可能为研究动态生物学过程提供更快速、更直接的途径。

本文介绍了一种小鼠长骨培养的方法，该方法可与不同的分子处理和/或活细胞延时成像技术相结合。本方案借鉴了以往研究报告中使用的方法15,18,25，但解决了一些额外的技术问题，并专注于胫骨等长骨，而非跖骨。最后，本方法探讨了通过将左侧和右侧长骨分别在不同物质存在下进行培养，从而实现具有较强统计效力的配对比较的可能性。

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方案

所有实验均应遵循当地政府和机构关于实验动物伦理管理的指导原则进行。

1. 骨培养实验前的准备工作

  1. 设置定时交配的小鼠以获取胚胎第14.5天（E14.5）及之后的胎鼠和仔鼠。
    注意：长骨培养可成功应用于不同小鼠品系；本方案中使用远交型Swiss Webster野生型小鼠。
  2. 准备解剖培养基（改编自Houston等15）：将α-最低必需培养基（α-MEM）或杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）用磷酸盐缓冲液（PBS）按1/13稀释，并加入2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA），通过0.22 µm、33 mm直径的注射器滤器过滤除菌。分装后于-20 °C保存。
  3. 在提取胎鼠的前一天，准备无血清骨培养基，其成分为含0.2% BSA、0.5 mM L-谷氨酰胺、40 U/mL青霉素/链霉素、0.05 mg/mL抗坏血酸和1 mM β-甘油磷酸钠的DMEM。通过0.22 µm、33 mm直径的注射器滤器过滤除菌，4 °C保存，可使用长达1个月。
  4. 在培养当天，于处死小鼠前，用解剖培养基准备24孔板和60 mm培养皿，并保持其冰上低温。将骨培养基在37 °C水浴中预热。用80%（v/v）乙醇喷洒将用于处理胎鼠的工具（镊子和小剪刀）。将双目解剖显微镜转移至II级生物安全柜内。

2. 胎儿和新生小鼠胫骨和股骨的培养

  1. 在所需妊娠阶段（E14.5 至 E18.5）通过颈椎脱位处死怀孕小鼠。若使用新生幼鼠，则逐个从母鼠身上取出，并通过断头法处死。
  2. 将小鼠仰卧放置，并用 80%（v/v）乙醇喷洒腹部区域进行消毒。
  3. 使用小剪刀剪开皮肤和腹肌，以暴露子宫角。
  4. 借助镊子和小剪刀将子宫从腹腔中取出，去除子宫系膜并剪除子宫角基部。将子宫放入盛有冰上预冷的解剖液的 60 mm 培养皿中，并在整个操作过程中将培养皿保持在冰上。
  5. 将含有子宫的培养皿转移至生物安全柜中，并自此在其中进行后续操作。
  6. 用剪刀在胎膜之间剪开，分离各个胎儿。
  7. 将单个胎膜转移至含有解剖液的洁净 60 mm 培养皿中，在解剖体视显微镜下用镊子打开胎膜，分离胎儿与胎盘，并清除膜组织。
    注意：每次仅操作一个胚胎，其余胚胎保持在冰上。
  8. 将胎儿断头，用 1 mL 剪口无菌塑料移液管将躯体转移至新的洁净 60 mm 培养皿中。
  9. 用镊子从背部开始剥离胎儿或幼鼠的皮肤，一直剥至脚趾。
  10. 用镊子在靠近脊柱处剪断，分离后肢，并将其转移至盛有冰上预冷解剖液的洁净培养皿中。
  11. 用镊子小心插入股骨远端与胫骨近端的软骨表面之间，分离胫骨与股骨。
  12. 从股骨近端去除髋骨，从胫骨去除跟骨和腓骨。
  13. 通过夹取并拉除的方式，用镊子小心去除股骨和胫骨上的软组织。
    注意：应尽可能彻底去除软组织，特别注意清除连接两个软骨极的组织，但避免损伤软骨、软骨膜和骨骼。
  14. 用塑料 1 mL 无菌移液管将四根骨骼（左右胫骨和股骨）放入 24 孔板的第一个孔中。或者，若需比较不同处理对左右肢体的影响，可将对侧肢体分别放入不同孔中。
    注意：将骨骼转移至孔板时需格外小心，因其易粘附于移液管上。
  15. 根据需要，以相同方法处理尽可能多的胎儿。
    注意：一旦解剖液变得过于浑浊，应立即更换培养皿中的解剖液，因清晰观察解剖后的骨骼至关重要。
  16. 当所有目标骨骼均已转移至孔板后，用塑料 1 mL 无菌移液管吸除解剖液，并特别注意避免吸走骨骼。
    1. 根据实验目的，可在去除解剖液前拍摄骨骼图像，作为实验的零时间点。使用连接数字相机的显微镜拍摄图像，并标注曝光参数和比例尺。为确保测量简便可靠，应拍摄对比度良好的图像以区分矿化部分。
  17. 向每孔加入 1 mL 培养基。若需对骨骼进行处理（如多西环素、他莫昔芬、生长因子等），应在此时加入。
  18. 为观察培养条件下生长抑制效应，用视黄酸（RA，500 nM）处理左侧胫骨，同时用等体积溶剂（二甲基亚砜 [DMSO]，终浓度 0.1%）孵育右侧胫骨作为对照。
  19. 将骨骼置于细胞培养箱中，在标准细胞培养条件下（37 °C，5% CO2）培养两天或更长时间。
  20. 为评估细胞增殖，在固定前 1–2 小时向培养基中加入 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）或 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU），终浓度为 10 µM。
    注意：EdU 储存液浓度为 20 mM。
    警告：EdU 和 BrdU 为胸苷类似物，具有毒性及致突变性。
  21. 解冻 4% 多聚甲醛（PFA），并将骨骼分别浸入 2 mL 管中的 PFA 进行固定。
    警告：PFA 具有毒性，被列为可能的人类致癌物。避免吸入多聚甲醛粉末及蒸气。EdU 和 BrdU 为胸苷类似物，具有毒性及致突变性。
  22. 在室温下短暂固定 10 分钟后，将骨骼转移至 PBS 中用于最终时间点的图像采集，随后将骨骼重新放回 PFA 中，在 4 °C 下过夜固定。
  23. 固定完成后，可对骨骼进行后续所需的实验处理。

3. 骨全长及矿化区域的测量与分析

  1. 使用图像编辑软件测量骨骼长度，需考虑图像的比例尺。测量骨骼的总长度以及矿化区域的长度。测量时从一端第一个深色细胞开始，到另一端最后一个深色细胞结束。
    注意：矿化区域呈现较深颜色，可轻易与软骨组织区分。
  2. 为计算生长速率（定义为每天平均增加的长度），将骨骼在培养结束时的长度与初始长度之差除以培养天数即可。

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结果

骨培养可从不同发育阶段开始。在图1A-D中，展示了相同发育阶段下培养后的胫骨与新鲜提取胫骨的比较。首先观察到的是，在培养不超过两天的情况下，无论软骨还是矿化骨，其生长尺寸均与体内骨生长相当（图1A、B、D）。随着培养时间延长，培养骨与新鲜提取骨之间的差异逐渐增大（图1C）。此外，如实验方案中所述，彻底清除连接骨两端的软组织至关重要，否则骨骼会发生弯曲。图1E展示了一例因软组织未完全清除而导致生长异常的胫骨，与另一例完全去除软组织的胫骨的对比情况。

接下来，将胫骨培养2天并测量其长度。如图2A...

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讨论

体外骨培养方法已被用于评估骨生长生物学特性一段时间28，但较少应用于小鼠长骨。随着成像技术的发展，体外骨培养提供了一种有吸引力的方法，可在接近体内环境的条件下实时研究骨生长。在此情况下，明确长骨生长与体内生长具有可比性的条件显得尤为重要。

在本研究中，我们介绍了一种简单且经济的长骨培养方案，并探讨了其局限性及可能的应用。该方法最关键的步骤是骨骼的分离，必须保持骨骼完整，并尽可能减少骨两端之间的软组织。若在骨两端之间残留软组织，将阻碍骨骼的正常生长并导致弯曲，如图1E所示。骨骼末端的软组织可以保留，因其最终会自然消失。另一个需要格外小心的步骤是将骨骼转移至培养板，因为骨骼容易粘附在塑料移液管上。一种可行的解决方法是用含有血液和组织碎片的解剖液反复吹打，形成一层包被，有助于防止骨骼粘附在移液管上。

提取后，骨骼在培养长达48小时的条件下可达到与相应体内发育阶段相当的大小。除了测量骨骼长度外，在这些条件下还可方便地估算生长速率...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Alexandra Joyner 在本方案建立过程中提供的支持，感谢 Edwina McGlinn 和 Yi-cheng Chang 分享视黄酸。澳大利亚再生医学研究所获得了维多利亚州政府和澳大利亚政府资助项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-乙炔基-2'-脱氧尿苷Santa CruzCAS 61135-33-9
5-溴-2′-脱氧尿苷SigmaB5002
50 mL 圆锥形离心管Falcon352070
60 mm 组织培养处理中心井培养皿，20 个/包，500 个/箱，无菌Falcon353037
Adobe PhotoshopAdobeCS4
抗坏血酸SigmaA92902
显微镜主机单元Zeiss435425-9100-000
β-甘油磷酸钠SigmaG9422
双目显微镜ZeissSTEMI-2000
牛血清白蛋白（BSA）第五组分Roche/Sigma10735086001
DigiRetina 500 相机Aunet
解剖工具包Cumper RobbinsPFS00034
DMEMGibco11960044
DMSOSigmaD8418
Eppendorf 2 mL 离心管Eppendorf0030120094
96% 乙醇Merk159010
杜蒙特 #5 镊子 Inox08精细科学工具T05811
Heracell 150 CO2 培养箱Thermo Fisher51026282
伊格尔最低必需培养基SigmaM2279
24 孔多孔板Falcon353047
多聚甲醛Sigma158127
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140-122
塑料移液器，1 mL，无菌，单独包装Thermo273
0.2 µm 注射器滤器Life SciencesPN4612
Terumo 20 mL 注射器TerumoDVR-5174
维甲酸（全反式维甲酸）SigmaPHR1187-3X
三目显微镜AunetAZS400T

参考文献

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