本文介绍一种适用于胎儿期和新生儿期小鼠长骨的离体培养方法，可在模拟体内过程的受控条件下，用于分析骨骼和软骨的发育及稳态。
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本文内容
摘要
摘要
长骨是复杂且动态的结构，通过软骨内成骨经由软骨中间阶段发育而来。由于难以获取健康的人类骨骼，使用哺乳动物模型（如小鼠和大鼠）来研究骨骼生长和稳态的各个方面显得尤为重要。此外，小鼠中日益成熟的遗传工具的发展使得对长骨生长进行更复杂的研究成为可能，同时也要求扩展用于研究骨骼生长的技术手段。本文介绍了一种详细的离体小鼠骨骼培养方案，可在严格控制的条件下研究骨和软骨，同时重现体内过程的大部分特征。该方法适用于多种骨骼的培养，包括胫骨、股骨和跖骨，但本文主要聚焦于胫骨的培养。此外，该方法还可与其他技术联合使用，例如延时活体成像或药物处理。
引言
器官的生长必须受到严密调控，以防止生长紊乱的发生，这一过程涉及多种细胞类型、分子通路以及身体不同部位之间的相互作用。成像技术对于研究胚胎在正常条件下以及系统受到干扰后随时间发生的动态变化至关重要。具有宫内发育特征的胚胎（例如广泛使用的啮齿类动物模型）为活体成像和药物处理带来了额外挑战，而离体培养技术可在一定程度上克服这些困难。为了成功重现体内过程并获得有意义的结果，为每种器官或组织找到合适的培养条件变得尤为关键。
哺乳动物骨骼的大多数骨骼通过软骨内成骨过程生长，其中胚胎期的软骨（由称为软骨细胞的细胞构成）驱动纵向生长，并逐渐被骨组织取代。这一过程发生在长骨末端的生长板处，生长板可分为三个区域：静止区、增殖区和肥大区1,2。首先，静止区中圆形的前体软骨细胞转变为增殖区中呈柱状排列并持续分裂的软骨细胞。在接下来的分化阶段，这些软骨细胞体积增大成为肥大软骨细胞，并开始分泌X型胶原蛋白。肥大软骨细胞协调后续的成骨过程：它们分泌关键的信号分子，如结缔组织生长因子、骨形态发生蛋白和印度刺猬因子，引导基质矿化，招募血管进入骨的中央区域，并在发生凋亡后，允许成骨细胞（成骨细胞）侵入基质，形成初级骨化中心3,4。矿化的基质有助于血管的穿透，成骨细胞借此迁移进入并....
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方案
所有实验均应遵循当地政府和机构关于实验动物伦理管理的指导原则进行。
1. 骨培养实验前的准备工作
- 设置定时交配的小鼠以获取胚胎第14.5天（E14.5）及之后的胎鼠和仔鼠。
注意：长骨培养可成功应用于不同小鼠品系；本方案中使用远交型Swiss Webster野生型小鼠。 - 准备解剖培养基（改编自Houston等15）：将α-最低必需培养基（α-MEM）或杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）用磷酸盐缓冲液（PBS）按1/13稀释，并加入2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA），通过0.22 µm、33 mm直径的注射器滤器过滤除菌。分装后于-20 °C保存。
- 在提取胎鼠的前一天，准备无血清骨培养基，其成分为含0.2% BSA、0.5 mM L-谷氨酰胺、40 U/mL青霉素/链霉素、0.05 mg/mL抗坏血酸和1 mM β-甘油磷酸钠的DMEM。通过0.22 µm、33 mm直径的注射器滤器过滤除菌，4 °C保存，可使用长达1个月。
- 在培养当天，于处死小鼠前，用解剖培养基准备24孔板和60 mm培养皿，并保持其冰上低温。将骨培养基在37 °C水浴中预热。用80%（v/v）乙醇喷洒将用于处理胎鼠的工具（镊子和小剪刀）。将双目解剖显微镜转移至II级生物安全柜内。
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结果
骨培养可从不同发育阶段开始。在图1A-D中，展示了相同发育阶段下培养后的胫骨与新鲜提取胫骨的比较。首先观察到的是，在培养不超过两天的情况下，无论软骨还是矿化骨，其生长尺寸均与体内骨生长相当（图1A、B、D）。随着培养时间延长，培养骨与新鲜提取骨之间的差异逐渐增大（图1C）。此外，如实验方案中所述，彻底清除连接骨两端的软组织至关重要，否则骨骼会发生弯曲。图1E展示了一例因软组织未完全清除而导致生长异常的胫骨，与另一例完全去除软组织的胫骨的对比情况。
接下来，将胫骨培养2天并测量其长度。如图2A.......
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讨论
体外骨培养方法已被用于评估骨生长生物学特性一段时间28，但较少应用于小鼠长骨。随着成像技术的发展，体外骨培养提供了一种有吸引力的方法，可在接近体内环境的条件下实时研究骨生长。在此情况下，明确长骨生长与体内生长具有可比性的条件显得尤为重要。
在本研究中，我们介绍了一种简单且经济的长骨培养方案，并探讨了其局限性及可能的应用。该方法最关键的步骤是骨骼的分离，必须保持骨骼完整，并尽可能减少骨两端之间的软组织。若在骨两端之间残留软组织，将阻碍骨骼的正常生长并导致弯曲，如图1E所示。骨骼末端的软组织可以保留，因其最终会自然消失。另一个需要格外小心的步骤是将骨骼转移至培养板，因为骨骼容易粘附在塑料移液管上。一种可行的解决方法是用含有血液和组织碎片的解剖液反复吹打，形成一层包被，有助于防止骨骼粘附在移液管上。
提取后，骨骼在培养长达48小时的条件下可达到与相应体内发育阶段相当的大小。除了测量骨骼长度外，在这些条件下还可方便地估算生长速率.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Alexandra Joyner 在本方案建立过程中提供的支持，感谢 Edwina McGlinn 和 Yi-cheng Chang 分享视黄酸。澳大利亚再生医学研究所获得了维多利亚州政府和澳大利亚政府资助项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-溴-2′-脱氧尿苷 | Sigma | B5002 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Falcon | 352070 | |
| 60 mm 组织培养处理中心井培养皿，20 个/包，500 个/箱，无菌 | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A92902 | |
| 显微镜主机单元 | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| β-甘油磷酸钠 | Sigma | G9422 | |
| 双目显微镜 | Zeiss | STEMI-2000 | |
| 牛血清白蛋白（BSA）第五组分 | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 相机 | Aunet | ||
| 解剖工具包 | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL 离心管 | Eppendorf | 0030120094 | |
| 96% 乙醇 | Merk | 159010 | |
| 杜蒙特 #5 镊子 Inox08 | 精细科学工具 | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 培养箱 | Thermo Fisher | 51026282 | |
| 伊格尔最低必需培养基 | Sigma | M2279 | |
| 24 孔多孔板 | Falcon | 353047 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140-122 | |
| 塑料移液器，1 mL，无菌，单独包装 | Thermo | 273 | |
| 0.2 µm 注射器滤器 | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo 20 mL 注射器 | Terumo | DVR-5174 | |
| 维甲酸（全反式维甲酸） | Sigma | PHR1187-3X | |
| 三目显微镜 | Aunet | AZS400T |
参考文献
- Long, F., Ornitz, D. M. Development of the endochondral skeleton. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334(2013).
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochon....
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重印与许可
