我们描述了一种详细的实验方案，用于评估氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）的毒理学特征，特别是其对人MRC5肺成纤维细胞死亡类型的影响以及在果蝇Drosophila中活性氧（ROS）的形成情况。
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摘要
摘要
氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）具有广泛的应用，但近年来关于ZnO NPs相关毒性的报道数量迅速增加。然而，阐明ZnO NPs诱导毒性的潜在机制的研究仍十分有限。我们利用体外和体内实验模型确定了ZnO NPs的毒性特征。在暴露于ZnO NPs的人胚肺成纤维细胞MRC5中观察到细胞活力显著下降，表明ZnO NPs具有细胞毒性作用。同样，有趣的是，在果蝇Drosophila中，肠道暴露于ZnO NPs后活性氧（ROS）水平显著升高。针对消费者日益增加的ZnO NPs使用情况，尚需更深入的研究以建立相应的风险评估体系。
引言
纳米技术是指将纳米级材料应用于所有科学领域，包括医学、材料科学和生物化学。例如，氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）因其具有紫外线散射、化学传感和抗菌特性以及高电导率，被广泛用于多种消费品的生产，如食品包装、化妆品、纺织品、橡胶、电池、汽车尾气处理催化剂以及与生物医学相关的应用1,2,3。
然而，基于氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）的产品应用日益广泛，导致人类接触ZnO NPs的程度增加，这引发了对其可能对人类健康产生不良影响的担忧。大量体外细胞研究表明，ZnO NPs可诱导氧化应激、自噬相关细胞毒性、炎症反应以及基因毒性4,5,6,7,8。值得注意的是，ZnO NPs的毒性被认为主要源于Zn溶解为游离的Zn2+离子，以及ZnO表面的反应活性，从而导致细胞内离子和代谢失衡，进而引发离子稳态受损和离子转运受抑制4,7,9,10。重要的是，研究显示活性氧（ROS）的生成是ZnO NPs相关毒性的主要机制之一。ROS攻击后抗氧化活性不足已被证实可引发细胞毒性和DNA损伤9。ZnO NPs的毒性效应也在动物模型中被报道，包括啮齿类动物1、斑马鱼11,12，以及无脊椎动物Drosophila13。
Drosophila 是一种成熟的替代性动物模型，可用于化学物质和纳米材料（NMs）的毒性筛选14,15。重要的是，人类与Drosophila之间存在高度的遗传和生理相似性，这为将Drosophila用作评估环境污染物（如纳米材料）生物学反应的体内模型提供了依据16。此外，Drosophila具有个体小、生命周期短、遗传操作便利以及易于且低成本维护等诸多优势。自2000年Drosophila全基因组测序完成以来，它已被广泛应用于遗传学、分子生物学和发育生物学的研究，因此适用于多种高通量筛选以及解决尚未明确的生物学问题17,18,19,20,21。近年来，已有大量关于利用不同类型纳米颗粒（NPs）在Drosophila中开展免疫毒性研究的报道15,22,23,24。这些基于Drosophila模型获得的基础性新知识，有助于加深我们对纳米毒理学的理解。
活性氧（ROS）是纳米颗粒（NPs）引起细胞毒性和基因毒性的已知主要原因，尤其是金属基纳米颗粒25。ROS 是指含氧且比分子氧更具反应活性的化学物质。自由基如超氧阴离子自由基（O2-）以及非自由基分子如过氧化氢（H2O2）均可作为 ROS 发挥作用。在正常生理条件下，ROS 对维持细胞稳态是必需的26；然而，当 ROS 因过度生成或抗氧化防御系统失调而过量积累时，可引发氧化应激，导致蛋白质、脂质和脱氧核糖核酸（DNA）受损27。例如，随着 ROS 水平升高，谷胱甘肽（GSH）水平同时下降，三磷酸腺苷（ATP）合成受阻，培养基中乳酸脱氢酶（LDH）水平上升，最终导致细胞死亡27。
本文提供了利用培养的哺乳动物细胞和果蝇（Drosophila）进行细胞和遗传学分析的实验方案，以评估氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）可能产生的不良效应。氧化锌纳米颗粒毒性研究方法的总体流程如图1所示。
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方案
1. 活细胞/固定细胞的荧光激活细胞分选（FACS）分析
- 将悬浮液中的氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）超声处理15分钟。
- 使用1 mg/mL的氧化锌纳米颗粒（ZnO NP）储备液，配制不同浓度的氧化锌纳米颗粒溶液（例如，0、10、25、50、100和200 µg/mL），用于处理培养的细胞。
- 提前一天将MRC5人肺成纤维细胞（1 × 105 个细胞/孔）接种于6孔培养板中，随后分别用2 mL氧化锌纳米颗粒溶液（设三个重复）处理细胞，处理时间分别为8 h、16 h和24 h。
- 在每个时间点，以300 × g 离心5分钟收集细胞。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞沉淀洗涤两次。
- 用1×结合缓冲液重悬细胞，该缓冲液包含0.1 M HEPES/氢氧化钠（NaOH）、1.4 M氯化钠（NaCl）和25 mM氯化钙（CaCl2），细胞浓度为每100 µL含1 × 105 个细胞。
- 加入5 µL异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Annexin V染料和5 µL碘化丙啶（PI）DNA染料，在室温（RT；25 °C）避光孵育15分钟。
- 在进行流式细胞术分选前，向样品中额外加入400 µL的1×结合缓冲液。每个样品至少分析10,000个细胞。
- 根据获得的中位荧光强度绘制柱状图。
2. ZnO 纳米颗粒对Drosophila的暴露处理
- 将不同浓度的纳米颗粒各1 mL加入小瓶中，随后加入9 mL果蝇食物，配制成终浓度为0.1 mg/mL、0.25 mg/mL或0.5 mg/mL的ZnO NPs果蝇食物。
- 使用移液器在小瓶中将纳米颗粒与食物充分混匀。
- 让含有ZnO NPs的果蝇食物冷却至少2–3小时后再使用。
- 将成年雄性和雌性果蝇放入小瓶中培养5天，使其交配并在食物表面产卵（卵表现为白色斑点）。
- 移除亲代果蝇，使卵继续发育，发育过程包括4个不同的发育阶段（胚胎期、幼虫期、蛹期和成虫期）。
3. 果蝇解剖
- 收集晚期 3rd 从瓶壁上取下龄期幼虫用于分析。新产的卵通常会发育至3龄晚期rd 室温下72-120小时后的龄期幼虫。
- 清洗解剖皿，并向其中加入解剖液/PBS。
- 解剖幼虫（晚期3rd 使用镊子在体视显微镜下进行龄期鉴定。
- 用镊子尖端刺破幼虫的角质层，形成微小孔洞并将其打开。小心取出肠道，放入含有 Schneider 培养基的 1.5 mL 微量离心管中 果蝇 4%多聚甲醛（PF）固定步骤之前，使用1 mL培养基。
- 3.5 在室温下用PF固定肠道10分钟，用于后续实验（如免疫染色）。
4. 使用二氢乙啶（DHE）染色法检测活性氧
- 按照步骤2.1所述，用不同浓度的ZnO NPs处理幼虫。
- 按照第3节所述方法解剖3rd龄幼虫的肠道，将肠道置于Schneider's Drosophila培养基中，在室温下孵育，再进行组织染色。将1 µL DHE染料（来自30 mM储备液）溶解于1 mL Schneider's培养基中，配制成终浓度为10–30 µM的DHE工作液。
- 在室温避光条件下孵育肠道5分钟，然后用Schneider's培养基洗涤三次，每次5分钟。
- 用4%多聚甲醛（PF）固定肠道（可选步骤），并将肠道置于载玻片上，使用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂封片。在共聚焦显微镜下采集图像。
5. 使用 ImageJ 软件测量荧光
- 将使用荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜获取的荧光图像导入 ImageJ 软件中。
- 点击 分析 菜单，然后选择 设置测量。
- 选择输出测量参数，如面积积分光密度和平均灰度值。
- 点击 测量。
- 选择无荧光区域以设定背景。
- 将数据导出至 Excel 电子表格，并根据以下计算公式确定校正后的细胞总荧光强度（CTCF）：
CTCF = 积分密度 - （所选细胞面积 × 背景荧光读数的平均值） - 绘制柱状图并进行统计分析。
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结果
经纳米颗粒暴露的细胞使用细胞染色试剂盒进行处理，随后通过流式细胞术进行细胞分选。ZnO 纳米颗粒处理的细胞（下方右图）中早期（R3）和晚期凋亡细胞（R6）的比例高于对照细胞（R5，下方左图）。坏死性细胞死亡由 R4 区域表示（上方右图）（图 2）。ZnO 纳米颗粒处理的 MRC-5 成纤维细胞的 FITC/Annexin V 检测结果如 图 2 所示。
在 Drosophila 实验中，将经超声处理的不同浓度的ZnO纳米颗粒加入10 mL试管的果蝇食物中，并使用移液器控制器充分混匀（图3）。从培养瓶中收集晚期三龄幼虫，在体视显微镜下进行解剖。首先将幼虫清洗以去除残留的食物（图4）。撕开外层角质层以暴...
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讨论
为了评估氧化锌纳米颗粒（ZnO NP）是否可诱导MRC5成纤维细胞发生凋亡，我们采用流式细胞术来区分细胞的坏死性死亡与凋亡性死亡。在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）定位于细胞膜内侧。当细胞发生凋亡时，PS会转位至质膜的胞外小叶，从而允许与荧光素标记的Annexin V（FITC Annexin V）29结合。另一方面，红色荧光的碘化丙啶（PI）是一种核酸结合染料，不能穿透活细胞和凋亡细胞，但可对死亡细胞进行染色30。因此，我们可利用流式细胞仪，通过氩离子激光的488 nm谱线激发，识别出死亡细胞（红色和绿色荧光）、凋亡细胞（绿色荧光）以及活细胞（无或仅有微弱荧光）。
对于黑腹果蝇（Drosophila）肠道的DHE染色，建议在实验开始前用DMSO重新配制染料，因为长期储存可能导致染料发生自氧化，使其颜色变为深色或紫红色31,32。此外，配制好的染料储备...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由资助号 R706-000-043-490 支持。本研究不代表资助方的观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15% 对羟基苯甲酸甲酯 | Sigma Aldrich | ||
| 4% 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto 琼脂 | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | 由 Dr. Kerppola T 惠赠 | ||
| 玉米粉、葡萄糖、酿酒酵母 | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP 流式细胞仪（配备 Summit 软件） | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| 二氢乙啶（氢化乙啶） | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒 I | BD biosciences | 556547 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | ||
| Glucolin | 超市 | ||
| ImageJ 软件 | NIH | ||
| MRC5 人肺成纤维细胞 | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| 含 DAPI 的 Vectashield 抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 野生型 Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| 氧化锌纳米颗粒 | Sigma Aldrich | 721077 | 参见表 2 |
参考文献
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