我们描述了一种详细的实验方案，用于评估氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）的毒理学特征，特别是其对人MRC5肺成纤维细胞死亡类型的影响以及在果蝇Drosophila中活性氧（ROS）的形成情况。
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摘要
摘要
氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）具有广泛的应用，但近年来关于ZnO NPs相关毒性的报道数量迅速增加。然而，阐明ZnO NPs诱导毒性的潜在机制的研究仍十分有限。我们利用体外和体内实验模型确定了ZnO NPs的毒性特征。在暴露于ZnO NPs的人胚肺成纤维细胞MRC5中观察到细胞活力显著下降，表明ZnO NPs具有细胞毒性作用。同样，有趣的是，在果蝇Drosophila中，肠道暴露于ZnO NPs后活性氧（ROS）水平显著升高。针对消费者日益增加的ZnO NPs使用情况，尚需更深入的研究以建立相应的风险评估体系。
引言
纳米技术是指将纳米级材料应用于所有科学领域，包括医学、材料科学和生物化学。例如，氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）因其具有紫外线散射、化学传感和抗菌特性以及高电导率，被广泛用于多种消费品的生产，如食品包装、化妆品、纺织品、橡胶、电池、汽车尾气处理催化剂以及与生物医学相关的应用1,2,3。
然而，基于氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）的产品应用日益广泛，导致人类接触ZnO NPs的程度增加，这引发了对其可能对人类健康产生不良影响的担忧。大量体外细胞研究表明，ZnO NPs可诱导氧化应激、自噬相关细胞毒性、炎症反应以及基因毒性4,5,6,7,8。值得注意的是，ZnO NPs的毒性被认为主要源于Zn溶解为游离的Zn2+离子，以及ZnO表面的反应活性，从而导致细胞内离子和代谢失衡，进而引发离子稳态受损和离子转运受抑制4
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方案
1. 活细胞/固定细胞的荧光激活细胞分选（FACS）分析
- 将悬浮液中的氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）超声处理15分钟。
- 使用1 mg/mL的氧化锌纳米颗粒（ZnO NP）储备液，配制不同浓度的氧化锌纳米颗粒溶液（例如，0、10、25、50、100和200 µg/mL），用于处理培养的细胞。
- 提前一天将MRC5人肺成纤维细胞（1 × 105 个细胞/孔）接种于6孔培养板中，随后分别用2 mL氧化锌纳米颗粒溶液（设三个重复）处理细胞，处理时间分别为8 h、16 h和24 h。
- 在每个时间点，以300 × g 离心5分钟收集细胞。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞沉淀洗涤两次。
- 用1×结合缓冲液重悬细胞，该缓冲液包含0.1 M HEPES/氢氧化钠（NaOH）、1.4 M氯化钠（NaCl）和25 mM氯化钙（CaCl2），细胞浓度为每100 µL含1 × 105 个细胞。
- 加入5 µL异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Annexin V染料和5 µL碘化丙啶（PI）DNA染料，在室温（RT；25 °C）避光孵育15分钟。
- 在进行流式细胞术分选前，向样品中额外加入400 µL的1×结合缓冲液。每个样品至少分析10,000个细胞。
- 根据获得的中位荧光强度绘制柱状图。 <....
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结果
经纳米颗粒暴露的细胞使用细胞染色试剂盒进行处理，随后通过流式细胞术进行细胞分选。ZnO 纳米颗粒处理的细胞（下方右图）中早期（R3）和晚期凋亡细胞（R6）的比例高于对照细胞（R5，下方左图）。坏死性细胞死亡由 R4 区域表示（上方右图）（图 2）。ZnO 纳米颗粒处理的 MRC-5 成纤维细胞的 FITC/Annexin V 检测结果如 图 2 所示。
在 Drosophila 实验中，将经超声处理的不同浓度的ZnO纳米颗粒加入10 mL试管的果蝇食物中，并使用移液器控制器充分混匀（图3）。从培养瓶中收集晚期三龄幼虫，在体视显微镜下进行解剖。首先将幼虫清洗以去除残留的食物（图4）。撕开外层角质层以暴.......
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讨论
为了评估氧化锌纳米颗粒（ZnO NP）是否可诱导MRC5成纤维细胞发生凋亡，我们采用流式细胞术来区分细胞的坏死性死亡与凋亡性死亡。在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）定位于细胞膜内侧。当细胞发生凋亡时，PS会转位至质膜的胞外小叶，从而允许与荧光素标记的Annexin V（FITC Annexin V）29结合。另一方面，红色荧光的碘化丙啶（PI）是一种核酸结合染料，不能穿透活细胞和凋亡细胞，但可对死亡细胞进行染色30。因此，我们可利用流式细胞仪，通过氩离子激光的488 nm谱线激发，识别出死亡细胞（红色和绿色荧光）、凋亡细胞（绿色荧光）以及活细胞（无或仅有微弱荧光）。
对于黑腹果蝇（Drosophila）肠道的DHE染色，建议在实验开始前用DMSO重新配制染料，因为长期储存可能导致染料发生自氧化，使其颜色变为深色或紫红色31,32。此外，配制好的染料储备.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由资助号 R706-000-043-490 支持。本研究不代表资助方的观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15% 对羟基苯甲酸甲酯 | Sigma Aldrich | ||
| 4% 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto 琼脂 | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | 由 Dr. Kerppola T 惠赠 | ||
| 玉米粉、葡萄糖、酿酒酵母 | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP 流式细胞仪（配备 Summit 软件） | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| 二氢乙啶（氢化乙啶） | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒 I | BD biosciences | 556547 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | ||
| Glucolin | 超市 | ||
| ImageJ 软件 | NIH | ||
| MRC5 人肺成纤维细胞 | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| 含 DAPI 的 Vectashield 抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 野生型 Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| 氧化锌纳米颗粒 | Sigma Aldrich | 721077 | 参见表 2 |
参考文献
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X.
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