使用直线加速器进行体外放射生物学实验

摘要

临床直线加速器可用于确定多种剂量率对癌细胞产生的生物学效应。我们将讨论如何设置直线加速器，以开展基于细胞的实验，包括悬浮培养的肿瘤球形式生长的癌干细胞样细胞实验，以及贴壁培养的细胞系实验。

摘要

放射治疗仍然是癌症治疗的主要手段之一。对于大多数癌症而言，它是减小肿瘤体积最有效的非手术疗法。本文介绍了一种使用直线加速器对癌细胞进行照射的方法。直线加速器技术的进步显著提高了放射治疗的精确性和效率。不同辐射剂量和剂量率所产生的生物学效应，仍是当前研究的热点领域。利用直线加速器可实现临床相关剂量和剂量率下的实验研究，从而推动该领域的深入探索。

引言

放射治疗是多种癌症的有效治疗方法^1,2,3,4。超高剂量率照射在放射治疗中相对较新，得益于直线加速器技术的最新进展才得以实现⁵。与标准剂量率照射相比，超高剂量率照射的临床优势包括缩短治疗时间并改善患者的治疗体验。直线加速器还为基于细胞培养的辐射生物学研究提供了临床环境。辐射剂量和剂量率的生物学及治疗学意义数十年来一直是放射肿瘤学家和生物学家关注的重点^6,7,8。然而，超高剂量率照射以及闪射照射——一种极高剂量率的辐射形式——的放射生物学特性仍有待深入研究。

伽马射线辐照广泛应用于基于细胞培养的辐射生物学研究^9,10,11。辐射通过放射性同位素衰变源（通常为铯-137）释放的伽马射线实现。放射源的使用受到严格....

方案

1. 悬浮细胞培养的细胞准备

1. 在细胞培养箱中，于含5% CO₂、95%相对湿度、37 °C条件下，将胶质瘤干细胞样细胞以约5 × 10⁶ 个细胞/10 cm培养皿接种于干细胞培养基中进行培养。
   注：所有实验步骤中细胞培养条件保持一致。本方案所用培养基均为完全培养基。
2. 在预定照射前两天，于生物安全柜中使用无菌5 mL移液管将胶质瘤干细胞样细胞从培养皿中收集至15 mL离心管中。
3. 将收集的细胞在台式离心机中以200 × g 离心3分钟。
4. 弃去上清液，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在室温下消化细胞沉淀（约1 × 10⁷ 个细胞）5分钟，以获得单细胞悬液。消化过程中每2分钟轻轻摇动离心管底部一次，确保细胞充分消化。
5. 加入3 mL干细胞培养基（见材料表）以终止胰蛋白酶消化反应。将细胞在台式离心机中以200 × g 离心3分钟。弃去上清液，保留细胞沉淀。
6. 用5 mL细胞培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
7. 将5 × 10⁶ 个细胞接种至两个含有10 mL细胞培养基的10 cm培养皿中。
8. 在预定照射前立即按照步骤1.3所述方法收集细胞，离心后弃去上清液，用5 mL细胞培养基重悬细胞沉淀。取1 mL细胞....

结果

为研究直线加速器产生的标准剂量率与超高剂量率照射对细胞周期的影响，采用本方案制备三份胶质瘤干细胞样细胞样本，并在照射后24小时收集细胞¹⁷：一个未受辐照的对照样本（图2A），一个样本以400 MU/min（监测单位，4.2 Gy/min标准剂量率）照射， 图2B）至4 Gy，另一份样品以2100 MU/min（21.2 Gy/min超高剂量率， 图2C) 至 4 Gy。细胞周期分布图显示了处于细胞周期不同阶段的细胞百分比。

讨论

放射治疗是癌症管理的重要组成部分。目前的研究工作致力于提高放射治疗的效果和效率。直线加速器技术的进步使得能够以空前的精确性和安全性对患者进行治疗。由于大多数患者接受的是来自直线加速器的高能X射线治疗，因此在直线加速器上开展的、针对广泛剂量率范围内生物学效应的研究结果可直接应用于临床患者。已有若干研究报告将直线加速器应用于辐射生物学研究，但结果尚不一致，仍需进一步研究^{13,14,15,16,19}。

直线加速器在一定程度上是安全的，因为当完成规定剂量的照射后，将不再产生X射线。这与放射性同位素持续释放辐射的情况不同。此外，使用直线加速器进行放射治疗可采用复杂的射线束布置方式，从而精确控制靶区形状，并实现广泛可调的剂量和剂量率。该方法的缺点是，由于患者治疗的占用，直.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
胶质瘤干细胞样细胞 387			由 Jeremy Rich 博士惠赠
293 细胞	ATCC	CRL-1573
神经干细胞培养基	赛默飞世尔科技	21103049	NeurobasalTM 培养基
DMEM	赛默飞世尔科技	10569044
胎牛血清	赛默飞世尔科技	16000044
青霉素/链霉素	赛默飞世尔科技	15140-122
重组人 EGF 蛋白	R&D Systems	236-EG-01M
重组人碱性 FGF	R&D Systems	4114-TC-01M
B-27™ 添加剂	赛默飞世尔科技	17504044
丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	11360070
L-谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	25030164
胰蛋白酶-EDTA	赛默飞世尔	25200056
细胞外蛋白基质	Corning	354277	MatrigelTM
乙醇	Fisher Chemical	A4094
仪器
10 cm 细胞培养皿	Denville	T1110
3.5 cm 细胞培养皿	USA Scientific Inc.	CC7682-3340
22×22 mm 玻璃盖玻片	电子显微镜科学公司	72210-10
15 ml 离心管	Thomas Scientific	1159M36
50 ml 离心管	Thomas Scientific	1158R10
5 ml 移液管	Fisher Scientific	14-955-233
移液器辅助器	Fisher Scientific	13-681-06
涡旋混合器	Fisher Scientific	02-215-414
离心机	Eppendorf	5810R
直线加速器	Varian	n/a
水等效材料	Sun Nuclear Corporation	557	Solid WaterTM
试剂配制
DMEM 培养基	在 500 ml DMEM 培养基中加入 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素 G、100 µg/mL 链霉素
干细胞培养基	在 500 ml Neurobasal 培养基中加入 10 ml B27 添加剂、20 µg hFGF、20 µg hEGF、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素 G、100 µg/mL 链霉素