使用直线加速器进行体外放射生物学实验

摘要

临床直线加速器可用于确定多种剂量率对癌细胞产生的生物学效应。我们将讨论如何设置直线加速器，以开展基于细胞的实验，包括悬浮培养的肿瘤球形式生长的癌干细胞样细胞实验，以及贴壁培养的细胞系实验。

摘要

放射治疗仍然是癌症治疗的主要手段之一。对于大多数癌症而言，它是减小肿瘤体积最有效的非手术疗法。本文介绍了一种使用直线加速器对癌细胞进行照射的方法。直线加速器技术的进步显著提高了放射治疗的精确性和效率。不同辐射剂量和剂量率所产生的生物学效应，仍是当前研究的热点领域。利用直线加速器可实现临床相关剂量和剂量率下的实验研究，从而推动该领域的深入探索。

引言

放射治疗是多种癌症的有效治疗方法^1,2,3,4。超高剂量率照射在放射治疗中相对较新，得益于直线加速器技术的最新进展才得以实现⁵。与标准剂量率照射相比，超高剂量率照射的临床优势包括缩短治疗时间并改善患者的治疗体验。直线加速器还为基于细胞培养的辐射生物学研究提供了临床环境。辐射剂量和剂量率的生物学及治疗学意义数十年来一直是放射肿瘤学家和生物学家关注的重点^6,7,8。然而，超高剂量率照射以及闪射照射——一种极高剂量率的辐射形式——的放射生物学特性仍有待深入研究。

伽马射线辐照广泛应用于基于细胞培养的辐射生物学研究^9,10,11。辐射通过放射性同位素衰变源（通常为铯-137）释放的伽马射线实现。放射源的使用受到严格监管，且常受限制。基于放射源的辐照难以测试大范围的剂量率，从而限制了其在分析临床可实现剂量率的生物学效应方面的应用¹²。

已有若干研究阐明了辐射剂量和剂量率的效应^{12,13,14,15,16,17}。在这些研究中，采用了放射性同位素产生的γ射线或直线加速器产生的X射线。使用的细胞系包括代表肺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤的多种细胞系。通过检测细胞存活率、细胞周期阻滞、细胞凋亡和DNA损伤等指标评估辐射效应^{12,13,14,15,16,17}。本文描述了一种利用直线加速器产生X射线辐射，以确定临床相关剂量和剂量率生物学效应的方法。此类研究应由生物学家、放射肿瘤学家和医学物理师密切合作完成。

方案

1. 悬浮细胞培养的细胞准备

1. 在细胞培养箱中，使用干细胞培养基，在5% CO₂、95%相对湿度、37 °C条件下，将胶质瘤干细胞样细胞以约5 × 10⁶ 个细胞/10 cm培养皿的密度进行培养。
   注意：所有操作步骤中细胞培养条件保持一致。本实验方案中所用培养基均为完全培养基。
2. 在预定照射前两天，于生物安全柜中用无菌5 mL移液管将胶质瘤干细胞样细胞从培养皿中收集至15 mL离心管中。
3. 将收集的细胞在台式离心机中以200 × g 离心3分钟。
4. 弃去上清液，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在室温下消化细胞沉淀（约1 × 10⁷ 个细胞）5分钟，以获得含有胰蛋白酶-EDTA的单细胞悬液。消化过程中每2分钟轻轻摇动离心管底部，确保细胞充分消化。
5. 加入3 mL干细胞培养基（见材料表）以终止胰蛋白酶消化反应。将细胞在台式离心机中以200 × g 离心3分钟。弃去上清液，保留细胞沉淀。
6. 用5 mL细胞培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
7. 将5 × 10⁶ 个细胞接种至两个含有10 mL细胞培养基的10 cm培养皿中。
8. 在预定照射前立即按照步骤1.3所述方法收集细胞，离心后弃去上清液。用5 mL细胞培养基重悬细胞沉淀，取1 mL细胞悬液转移至含有2 mL细胞培养基的35 mm培养皿中。
   注意：35 mm培养皿中培养基总体积为3 mL，以确保液体高度为1 cm。
9. 将接种好的细胞放入次级容器（如塑料盒或泡沫箱）中，以降低污染风险，并将装有细胞的容器置于运输车上送至辐照设施。
10. 按照步骤4所述条件对细胞进行辐照。

2. 贴壁细胞培养的细胞准备

1. 照射前一天，在细胞培养罩内，从贴壁细胞系（如 HEK-293 细胞）的细胞培养板中移除 DMEM 培养基。可使用连接真空泵的巴斯德移液管吸取培养基。
2. 向培养皿中加入 5 mL 无菌 PBS 洗涤细胞，以去除残留的培养基。
3. 用移液器向培养皿中加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，并轻轻倾斜培养板，确保整个皿底均被胰蛋白酶-EDTA 覆盖。
4. 室温下消化细胞 5 分钟，加入 3 mL DMEM 培养基终止胰蛋白酶-EDTA 反应，并在细胞培养罩内用 5 mL 移液器将细胞收集至 15 mL 离心管中。
5. 在台式离心机中以 200 × g 离心 3 分钟，弃去上清液，保留细胞沉淀。
6. 用 5 mL DMEM 培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。
7. 在 35 mm 培养皿中加入 3 mL 细胞培养基，接种 2 × 10⁵ 个细胞，使培养基高度达到 1 cm。
8. 将细胞在 37 °C 培养箱中培养 24 小时后，将培养皿转移至次级容器（例如隔热泡沫箱）中，通过运输车送至辐照设施。
9. 按照步骤 4 所述条件对细胞进行辐照。

3. 照射后免疫染色的细胞准备

1. 将市售的细胞外蛋白基质在冰上于 4 °C 过夜解冻。将 200 µL 吸头和 1.5 mL 离心管在 4 °C 预冷过夜。
2. 使用预冷的吸头和 1.5 mL 离心管，将细胞外蛋白基质以每管 200 µL 分装。
3. 将 200 µL 细胞外蛋白基质加入预冷的 20 mL 细胞培养基中，配制成含 1% 细胞外蛋白基质的培养基。
4. 将一块无菌盖玻片（22 mm × 22 mm）放入 35 mm 培养皿中，并在盖玻片上加入 400 µL 的 1% 细胞外蛋白基质培养基。
5. 将 35 mm 培养皿置于 37 °C 细胞培养箱中孵育 1 小时，使细胞外蛋白基质在盖玻片表面聚合。
6. 当使用悬浮细胞培养时，按照步骤 1.1 至 1.5 所述方法制备单细胞悬液。
7. 将 5 × 10⁴ 个细胞接种至置于 35 mm 培养皿中的细胞外蛋白基质包被的盖玻片上。将接种后的细胞放回细胞培养箱中过夜，以确保细胞被蛋白基质充分支撑。培养皿中培养基的总体积应为 3 mL，使培养基液面高度达到 1 cm。
8. 在明场显微镜下使用 10 倍物镜观察细胞。细胞应铺展在盖玻片上而非漂浮。将接种细胞的培养皿放入次级容器（如泡沫箱）中，通过手推车运送至辐照设施，并按照步骤 4 所述进行辐照。
9. 当使用贴壁细胞培养（例如 HEK-293 细胞）时，按照步骤 2.1 至 2.6 所述方法消化细胞。在辐照前一日，将 5 × 10⁴ 个细胞接种于 35 mm 培养皿中的无菌盖玻片上，确保细胞已完全贴壁，可通过显微镜观察确认（如步骤 3.9 所述）。加入 3 mL DMEM 培养基，使液体高度达到 1 cm。
10. 细胞在盖玻片上培养过夜或最长一天后，将接种细胞的培养皿置于次级容器中，运送至辐照设施。可使用手推车以降低洒漏风险。按照步骤 4 所述对细胞进行辐照。

4. 使用直线加速器（LINAC）进行照射

1. 使用直线加速器（LINAC）控制台软件，将加速器机架和准直器设置为 0°，将 X 和 Y 准直叶片打开至对称的 20 × 20 cm² 野大小，并在存在多叶准直器（MLC）时将其收回。
   注：直线加速器可能具有无展平滤过器（flattening filter free, FFF）模式，可实现非常高的剂量率。顾名思义，这种辐射在射野内并不均匀（平坦），高剂量率仅在射束中心区域实现。在此情况下，使用 7 × 7 cm² 的照射野。
2. 在治疗床上放置至少 5 cm 的水等效材料。将待照射的细胞培养皿置于水等效材料上，设定剂量率为 400 MU/min（标准剂量率），并使其对准直线加速器的十字交叉点。
3. 将待照射细胞置于 6 MV X 射线束的最大剂量深度处，约为 1.5 cm。在培养皿上方再添加 1 cm 的水等效材料。结合细胞悬浮其中的 1 cm 培养基，使细胞所处的平均深度为 1.5 cm。
4. 将前指针固定在直线加速器头部。延伸前指针直至其接触建成材料表面，并记录该距离。调节治疗床高度，使放射源到建成材料表面的距离为 100 cm。
   注：可通过光学距离指示器确认该距离。或者，也可直接使用光学距离指示器代替前指针，将源到建成材料表面的距离设为 100 cm。
5. 计算为细胞提供所需辐射剂量所需的适当监测单元（MU）数，并将加速器程序设定为以 400 MU/min 输出。
   注：对于源皮距（SSD）布型下、校准为在最大剂量深度处输出 1 cGy/MU 的直线加速器，所需监测单元数的计算公式为 MU = 剂量(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20×20)，其中 OF 表示输出因子。若使用其他校准设置的直线加速器，则需相应调整此计算方法。
6. 离开治疗室，并确认所有人员均已撤离。确认室内无其他细胞样本，否则它们将受到低剂量辐射。关闭治疗室门。
7. 在控制台上确认照射野大小、MU 及 MU/min 参数，然后启动射束。
8. 对需要在更高或更低剂量率下照射的细胞，重复步骤 4.3–4.8。
   1. 为使用加速器实现更高剂量率（例如 2100 MU/min 或更高），需减小源皮距（SSD），以根据平方反比定律提高对细胞的有效剂量率：有效剂量率 = 剂量率 × (100 cm / SSD_新)²。
   2. 为实现低剂量率（例如 20 MU/min），需增大源到表面的距离（SSD_新）以降低剂量率。例如，可将细胞培养皿放置于治疗室地面。
   3. 若采用此设置，需重新计算加速器上的监测单元设定值，公式为 MU = 剂量(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20×20) / (100 cm / SSD_新)²。有关 MU 计算的更多资料，请参见 McDermott 和 Orton¹⁸ 的参考文献。
9. 通过公式 DoseRate(Gy/Min) = Dose(Gy) × (MU/min) / MU 计算剂量率（单位：Gy/分钟）。例如，以 400 MU/min 输出 4 Gy 剂量需要 380 MU，则剂量率为 4 × 400 / 380 = 4.2 Gy/min。参见 表 1。

图1：细胞培养皿在直线加速器上的设置。（A）显示一台临床用直线加速器。（B）在治疗床面上放置5 cm的等效水材料。（C）将细胞培养皿放置于该材料表面。（D）利用加速器的十字准线将培养皿置于照射野中心，照射野由方形光野标示。（E）在细胞培养皿上方再覆盖1 cm的等效水材料。使用光学距离指示器（F, G）或前指针（H, I）检查源皮距（SSD）。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 辐照后的生物学检测

1. 照射后，以与上述相同的方式将细胞放回细胞培养箱中（参见步骤 1.9、2.8 和 3.10）。
2. 根据需要，可调整多种生物学检测方法以适应研究项目。
   注意：此处我们展示一个典型的细胞周期分析¹⁶，作为照射后进行的生物学检测示例。

结果

为研究直线加速器在标准剂量率与超高剂量率照射下对细胞周期的影响，按照本方案制备了三份胶质瘤干细胞样细胞样本，并在照射后24小时收集¹⁷：一份未接受照射的对照样本（图2A），一份以400 MU/min（监测单位，4.2 Gy/min标准剂量率，图2B）照射至4 Gy的样本，以及另一份以2100 MU/min（21.2 Gy/min超高剂量率，图2C）照射至4 Gy的样本。细胞周期分布图显示了处于细胞周期不同阶段的细胞百分比。

讨论

放射治疗是癌症管理的重要组成部分。目前的研究工作致力于提高放射治疗的效果和效率。直线加速器技术的进步使得能够以空前的精确性和安全性对患者进行治疗。由于大多数患者接受的是来自直线加速器的高能X射线治疗，因此在直线加速器上开展的、针对广泛剂量率范围内生物学效应的研究结果可直接应用于临床患者。已有若干研究报告将直线加速器应用于辐射生物学研究，但结果尚不一致，仍需进一步研究^{13,14,15,16,19}。

直线加速器在一定程度上是安全的，因为当完成规定剂量的照射后，将不再产生X射线。这与放射性同位素持续释放辐射的情况不同。此外，使用直线加速器进行放射治疗可采用复杂的射线束布置方式，从而精确控制靶区形状，并实现广泛可调的剂量和剂量率。该方法的缺点是，由于患者治疗的占用，直...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
胶质瘤干细胞样细胞 387			由 Jeremy Rich 博士惠赠
293 细胞	ATCC	CRL-1573
神经干细胞培养基	赛默飞世尔科技	21103049	NeurobasalTM 培养基
DMEM	赛默飞世尔科技	10569044
胎牛血清	赛默飞世尔科技	16000044
青霉素/链霉素	赛默飞世尔科技	15140-122
重组人 EGF 蛋白	R&D Systems	236-EG-01M
重组人碱性 FGF	R&D Systems	4114-TC-01M
B-27™ 添加剂	赛默飞世尔科技	17504044
丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	11360070
L-谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	25030164
胰蛋白酶-EDTA	赛默飞世尔	25200056
细胞外蛋白基质	Corning	354277	MatrigelTM
乙醇	Fisher Chemical	A4094
仪器
10 cm 细胞培养皿	Denville	T1110
3.5 cm 细胞培养皿	USA Scientific Inc.	CC7682-3340
22×22 mm 玻璃盖玻片	电子显微镜科学公司	72210-10
15 ml 离心管	Thomas Scientific	1159M36
50 ml 离心管	Thomas Scientific	1158R10
5 ml 移液管	Fisher Scientific	14-955-233
移液器辅助器	Fisher Scientific	13-681-06
涡旋混合器	Fisher Scientific	02-215-414
离心机	Eppendorf	5810R
直线加速器	Varian	n/a
水等效材料	Sun Nuclear Corporation	557	Solid WaterTM
试剂配制
DMEM 培养基	在 500 ml DMEM 培养基中加入 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素 G、100 µg/mL 链霉素
干细胞培养基	在 500 ml Neurobasal 培养基中加入 10 ml B27 添加剂、20 µg hFGF、20 µg hEGF、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素 G、100 µg/mL 链霉素