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方法文章

监测细菌定植与维持 拟南芥 漂浮式水培系统中的根系

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DOI：

10.3791/59517

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2019年5月28日

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

本文内容

摘要

本文介绍了一种水培植物生长检测方法，用于量化物种的存在并可视化细菌在植物根部初始定植期间以及转移到不同生长环境后的空间分布情况。

摘要

细菌形成复杂的根际微生物组，其结构受到微生物之间、较大生物体以及非生物环境相互作用的影响。在实验室条件下，与未定植的植物相比，植物促生细菌（PGPB）对植物根际的定植可提高寄主植物的健康状况或发育水平。然而，在田间条件下，使用PGPB进行细菌处理通常无法为作物带来显著益处。一种可能的解释是，在植物整个生命周期中，PGPB可能因与土壤中原有微生物的相互作用而逐渐丧失。这一假设一直难以证实，因为大多数研究关注的是PGPB的初始定植过程，而非其在根际群落中的长期维持。本文假设细菌群落的组装、共存和维持受到根际微环境确定性特征的调控，这些相互作用可能影响PGPB在自然环境中的存活能力。为了研究这些行为，本研究优化了一种基于水培系统的植物生长实验，利用Arabidopsis thaliana来定量并可视化细菌在植物根部初始定植期间以及转移到不同生长环境后的空间分布情况。随后，通过广泛研究的PGPB菌株Pseudomonas simiae验证了该系统的可重复性与实用性。为了探究多种细菌物种共存如何影响植物根部的定植与维持动态，构建了一个由三种细菌菌株（分别为Arthrobacter、Curtobacterium和Microbacterium物种）组成的模型群落，这些菌株最初均分离自A. thaliana的根际。结果表明，利用该水培植物维持实验可检测到这些多样化细菌物种的存在，从而为基于测序的细菌群落研究提供了一种替代方法。未来利用该系统开展的研究有望加深我们对多物种植物微生物组中细菌行为随时间推移及环境变化规律的理解。

引言

细菌和真菌病害对农作物的破坏会导致粮食产量下降，并可能严重扰乱全球稳定1。基于在抑病土壤中发现微生物有助于提高植物健康的研究成果2，科学家们开始探讨是否可以通过调控特定细菌种类的存在和丰度，利用植物微生物组来促进植物生长3。那些被发现有助于植物生长或发育的细菌统称为植物促生细菌（plant growth-promoting bacteria, PGPB）。近年来，相关研究已从单纯鉴定潜在的PGPB，转向探究根际（即根系周围及根表区域）土壤中跨生物界相互作用如何影响PGPB活性的机制4。

植物根际促生细菌（PGPB）对根际的定殖可增强寄主植物在多种胁迫条件下的健康状况或发育水平，相较于未定殖的植物具有明显优势5。然而，与受控严格的温室和实验室环境相比，原位土壤条件下的实验结果往往表现出更大的变异性6。造成这种差异的一种假设是，田间原生土壤中的细菌或真菌可能抑制PGPB的生长或行为7,8。根际细菌产生的有益效应通常依赖于其以下能力：1）定位并趋向根部移动；2）通过生物膜形成实现根部定殖；3）通过产生小分子代谢物与寄主植物或病原体相互作用7,9。上述任何一种定殖行为均可能受到邻近微生物的存在及其活性的影响10。

我们设计了一个系统，用于量化和可视化根际细菌定植的不同阶段（图1）。该方法将有助于研究为何在将植物转移到新环境（例如移栽预接种的幼苗）后，有时无法实现植物促生细菌（PGPB）的长期维持。Arabidopsis thaliana 被选为植物模型，因其在实验室研究中被广泛使用，且关于其与微生物相互作用的已有大量数据11。该系统包括三个阶段：1）A. thaliana 的生长，2）细菌定植，以及 3）细菌维持（见 图1）。由于 A. thaliana 是陆生植物，因此在水培系统中确保其不受过度水分胁迫至关重要12。借鉴 Haney 等人13 使用的方法，幼苗被培养在塑料网筛上，以将地上部分与液体培养基分离。该系统似乎并未影响植物宿主的健康与发育，同时改善了 A. thaliana 在液体环境中的生长11。当植物地上部分漂浮于液面之上时，其根系则完全暴露于接种到液体细菌培养基中的细菌，从而实现定植。该设计允许在最有利于目标细菌生长的营养条件下对其进行定植研究，随后可转换条件，使植物继续在支持其自身生长的营养培养基中生长。两个阶段均包含持续振荡，以防止根系缺氧13。在从定植培养基或维持培养基转移后，均可对植物根系上的细菌进行可视化观察或定量分析。该水培系统具有高度灵活性，可根据研究人员的兴趣轻松调整实验条件和施加的胁迫因素。

该方法在植物-微生物互作研究领域具有重要意义，因为它提供了一个稳健的系统，可用于研究根表界面的相互作用，同时可根据不同细菌的生长偏好进行定制。植物生物学实验室通常在固体琼脂上进行植物-微生物定殖实验，这限制了细菌的运动（即使有也仅为平面运动），并且在后续转移过程中需要对植物进行可能造成损伤的操作。相比之下，微生物学实验室往往优先考虑实验中细菌的健康状态，而这可能对植物造成不利影响14,15。由于植物学和微生物学实验室的研究重点不同，历史上这两类研究团队之间的实验结果难以比较，因为各自通常会优化实验条件以利于其关注的目标生物15。 本文所述的浮置网架植物培养系统避免了植物完全浸没的问题，相较于以往偏向微生物学的研究具有明显优势，同时还能在短时间内优化细菌的生长与存活，从而促进其定殖过程。因此，本研究所提出的实验方法可能兼顾植物生物学家的关注点（如避免植物过度水合及机械操作）和满足微生物学家的标准（允许不同的细菌生长条件以及多种物种间的相互作用）7。本实验方案设计灵活，可适用于多种细菌、植物及环境条件。

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方案

注意：实验装置的描述是为了便于理解，并用于生成本报告中包含的代表性结果，但可根据需要修改条件。所有步骤均应根据所用细菌的生物安全等级（BSL），佩戴个人防护装备（PPE），并遵循机构和联邦的安全建议进行操作。

1. 细菌的表征

  1. 在固体培养基平板上观察细菌的形态。将菌液重悬至 OD600 ≈ 0.5，取 1 µL 点种于所选的琼脂培养基上。在琼脂平板中加入 X-gal 至终浓度为 20 mg/mL，以更好地区分特定细菌群落中的各个成员。在 24 °C 或 30 °C 培养至菌落形成，随后拍摄菌落形态照片并记录观察结果。
  2. 确定每种细菌菌株的光密度与每毫升菌落形成单位（CFU）数量之间的相关性16。将细菌重悬于 24 孔板中的 1 mL 水中，使 OD600 ≈ 5，进行两倍系列稀释，测定各稀释度的 OD600，并将各稀释液点种于平板，以确定在多个光密度下各样本的活菌数（CFU/mL）。
  3. 测定每种细菌菌株所能耐受的最大超声强度。具体操作：将菌液分装至含有液体培养基的 24 孔板中，保留部分菌液作为未超声处理的对照组。使用配备 24 个探头的超声仪，以 40 安培功率、2 秒脉冲模式进行三轮、每轮 12 秒的超声处理。
    注意：建议使用 24 孔超声仪，以便后续对植物样本进行高通量处理；若无此设备，可使用配备微探头的超声仪，逐个处理各样本。操作时务必佩戴降噪等级不低于 25 NRR 的耳罩。
  4. 对超声处理与未超声处理的样品进行 10 倍系列稀释，并点种于琼脂平板。判断超声处理后活菌数量是否减少。若存在减少，应使用新鲜样品，重复超声步骤，降低总超声时间或振幅，直至处理对最终 CFU/mL 无影响17。

2. 在塑料网筛上培养拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗

  1. 使用标准打孔器制备塑料网片。
    1. 将网片收集到带有松散铝箔盖的玻璃容器中，并使用设定为20分钟干循环的高压灭菌器进行灭菌13。
    2. 用火焰灭菌的镊子将约40个灭菌网片单层均匀分布在植物生长培养基琼脂平板表面。使用含500 mg/L MES缓冲液[2-(N-吗啉代)乙磺酸]和1.5% Bacto琼脂的0.5×Murashige和Skoog（MS）盐作为植物生长培养基，并添加50 µg/mL多菌灵以限制幼苗真菌污染。
  2. 按照先前描述的方法制备无菌的A. thaliana种子17。
    1. 将约100–300粒种子分别放入离心管架中的各个离心管内，并置于通风橱中的可密封玻璃或厚质塑料容器（“罐”）中。
    2. 小心地将盛有100 mL次氯酸钠溶液的烧杯放入罐中，向次氯酸钠溶液中加入3 mL浓盐酸，立即密封罐子，使气体对种子灭菌至少4小时。
    3. 小心从罐子下方取出已灭菌的种子管并密封。
  3. 在每片网片中心放置两粒种子。用外科胶带密封培养皿，并在4 °C黑暗条件下孵育2–6天，使种子春化。
  4. 为促进种子萌发和幼苗生长，将培养皿倒置（琼脂面朝下）放入植物培养箱中，在短日照条件下培养8–10天：光照9小时（21 °C），黑暗15小时（18 °C）（图1，步骤2）。

3. 在液体细菌培养基中对植物进行定植

  1. 向无菌24孔板的每个孔中加入1 mL细菌培养基，仅留作培养基对照的孔除外。使用Lennox Luria肉汤（10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g NaCl）作为细菌培养基。
  2. 将嵌在尼龙网中的萌发幼苗从琼脂平板转移至液体中（图1，步骤3a）。
    1. 使用经火焰灭菌的镊子轻轻将含有两株萌发幼苗的尼龙网从琼脂平板上剥离。选择幼苗大小一致且无损伤的尼龙网。
    2. 若从琼脂上移除不顺利，则丢弃该尼龙网及幼苗。将一个漂浮装置转移至每孔细菌培养液中，根部朝下。
  3. 向含有漂浮幼苗的孔中接种细菌。
    1. 将前一晚在琼脂平板上培养的细菌重悬于细菌培养液中，调整其OD600至相当于108 CFU/mL的浓度。向每孔加入10 µL细菌悬液，使每孔终浓度为106 CFU细菌。
    2. 若需制备多种细菌混合液，将每种细菌分别调整至OD600相当于108 CFU/mL，等比例混合后，每孔液体中加入10 µL最终混合液。
  4. 密封培养板以维持无菌生长环境。在不接触粘性面的前提下，小心地将透气膜平整覆盖于板上。通过按压每个孔周围的环形区域，确保每个孔均被单独密封。将培养板的塑料盖紧密盖在培养板及透气膜上方（图1，步骤3b）。
  5. 将培养板置于植物生长室中孵育18小时，孵育条件与幼苗最初萌发时相同，但需置于设定为220 rpm的摇床中进行振荡培养。

4. 细菌定植的维持

  1. 为清洗所有浮体（网格上的植株），向新的24孔板各孔中加入1 mL无菌水。移除透气膜。使用无菌镊子将浮体转移至含水的孔中（图1，步骤4a）。在室温（RT）下静置10分钟进行清洗，不进行震荡。
    注意：若需测定细菌对根部的定植效率，而非其长期维持定植的能力，可在本步骤直接进行步骤5.1，处死植株。
  2. 用1 mL植物生长培养基填充新的24孔板各孔。将一片网格转移至每个孔中。用透气封口膜密封，并在植物培养室中以220 rpm转速于轨道摇床上孵育72小时（图1，步骤4b）。
  3. 在72小时孵育期后，参照步骤4.1的方法对浮体进行重复清洗。

5. 活菌计数的细菌收集

注意：可在任意孵育时间点测定每株幼苗根部的细菌数量。定植过程可在0小时至18小时之间进行监测，而维持状态则可从18小时开始监测。用于成像的植株可直接进入第6部分操作。

  1. 从网筛中取出幼苗（图1，步骤5）。将经火焰灭菌的镊子轻轻置于叶片下方（但位于网筛的叶片一侧），并轻轻夹住茎部。轻轻晃动幼苗，使其根部脱离网筛而不折断。若根部断裂，可轻柔刮取网筛底部，以收集完整的根段。
  2. 去除植物根部的细菌。将细菌转移至含有1 mL ddH2O的24孔板的孔中。按照步骤1.3所述进行样品超声处理。
    注意：使用显微镜观察经超声处理的样品根表面是否仍有残留细菌。若仍有细菌附着，可逐步增加总超声时间或强度，直至无细菌残留，但不得超过第1节中确定的不影响活细胞计数的最高超声强度。
  3. 定量根部细菌。
    1. 将超声处理后的样品在细菌培养基中进行10倍系列稀释，最高稀释至10-6。取每种稀释液50 µL分别接种于独立的琼脂平板上，并用无菌玻璃珠（或细菌涂布器）涂布均匀。将平板置于细菌最适生长温度下培养，直至可清晰计数单个菌落。
    2. 待菌落形态可区分后，统计每种菌落形态的数量（依据第1节确定），并计算每株幼苗中各细菌种类的菌落形成单位（CFU）。若样品出现污染，应予以弃用，因为在定植或培养过程中发生的污染可能影响细菌的存在情况。

6. 显微镜观察用完整植物根系的采集

  1. 使用镊子按照第5节所述方法从网筛中取出幼苗。
  2. 将每株植物转移至显微镜载玻片上。
    1. 将根尖置于载玻片上，从根尖处向外拖动，使茎部平贴于载玻片表面，确保根部伸直以获得最佳成像效果。在样品上滴加一滴水或无菌植物生长培养基，以润湿盖玻片与载玻片之间的界面。
    2. 将玻璃盖玻片放置在根冠正上方（图1 中最上方的方框区域）且位于茎叶下方，以避免盖玻片倾斜（便于根冠成像），并轻轻按压17。
  3. 若使用荧光标记细菌，应选用适当的激发/发射滤光片进行成像，以区分不同细菌以及细菌与植物根部18。

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结果

特征明确的植物根际促生细菌 P. simiae WCS417r 已知可定殖于根部 A. thaliana 在水培培养中。这种天然荧光细菌在定植后可通过显微镜轻松观察到幼苗根部的菌体图2）。尽管可以对这些的全长进行成像 A. thaliana 幼苗（4–6 mm 长）的根部，若对大量植株进行此操作将耗费难以接受的时间。由于大多数在不同时间点及细菌种类间的差异均可通过成像根部的基部、中部和根尖来捕捉14 （由红色方框标示） 图1），这些区域被优先用于成像，而非对整个根部长度进行成像。在明场图像中 P. simiae-定植的 A. thaliana 根图2), 可以观察到根和根毛的轮廓；然而，在定殖18小时时，无法通过明场图像清晰区...

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讨论

在各种环境中，植物会与成千上万乃至数百万种不同的细菌和真菌相互作用5,7。这些相互作用可能对植物健康产生正面或负面的影响，进而影响作物产量和食品生产。最近的研究还表明，植物促生细菌（PGPB）在作物上的定殖程度不同，可能是导致田间试验中植物大小和作物产量不可预测的原因之一22。深入了解这些相互作用背后的机制，可能使我们能够直接调控与植物相关的微生物群落，从而促进植物在正常乃至胁迫条件下的健康生长24。

由于根部的细菌定殖及其在根际中的维持对于植物-微生物相互作用至关重要9，我们希望构建一个可重复地可视化并定量这些细菌行为的系统。这种水培浮苗培养系统可实现对拟南芥（A. thaliana）根部细菌群体的显微成像与定量分析。

所描述的植物-微生物互作检测方...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国能源部生物与环境研究项目（DOE-BER 0000217519，授予 E.A.S.）、美国国家科学基金会（INSPIRE IOS-1343020，授予 E.A.S.）研究经费的支持。SLH 还获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目的支持。我们感谢 Jeffrey Dangl 博士提供细菌菌株以及宝贵的指导。感谢 Andrew Klein 博士和 Matthew J. Powers 在实验设计方面的建议。最后，SLH 要感谢社交媒体上的同行们，提醒我们传播科学既是一种特权，也是一种责任，尤其是通过富有创意且易于理解的方式进行传播。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
必需材料
1.5 mL 离心管任意N/A
24孔板BD Falcon1801343
Aeraseal密封膜Excel ScientificBE255A2
高压灭菌器任意N/A
目标细菌任意N/A建议在-80°C下以40%甘油保存
BactoAgar琼脂BD2306428; 货号 214010
次氯酸钠溶液（漂白剂）任意N/A
Conviron人工气候室任意N/A短日照光暗循环：光照强度460–600 µmol/m²/s，光周期9小时光照/15小时黑暗，温度18/21°C，配备内置电源插座
干燥器罐：玻璃或厚质塑料任意N/A
乙醇任意N/A
火焰源任意N/A
镊子任意N/A
培养箱任意N/A设定为指定细菌生长的最适温度
盐酸任意N/A
Lennox LB液体培养基RPIL24066-1000.0
微量离心机任意N/A
移液器任意N/A量程5 µL 至 1000 µL
显微镜（推荐荧光显微镜）任意N/A若无需高分辨率，普通光学显微镜亦可
MS盐类 + MES缓冲液RPIM70300-50.0
轨道式平板摇床任意N/A能够以220 rpm持续运行至少96小时
培养皿任意N/A总容量50 mL
试剂储液槽任意N/A
分光光度计任意N/A
标准打孔器任意N/A打孔直径约7 mm
无菌水任意N/A
医用胶带3MMMM1538-1
聚四氟乙烯（Teflon）网筛McMaster-Carr1100t41
超声波破碎仪任意N/A
涡旋混合器任意N/A
X-galGoldBiox4281c其他供应商亦可提供
推荐材料
24针超声波探头附件任意N/A用于同时超声处理多个样品；也可逐个处理
Alumaseal II密封胶Excel ScientificFE124F
玻璃珠任意N/A
多通道移液器/重复移液器任意N/A
无菌96孔板任意N/A用于梯度稀释；可用离心管替代
使用的生物材料
Arabidopsis thaliana种子任意N/A建议从拟南芥生物资源中心（Arabidopsis Biological Resource Center）获取种子资源
Arthrobacter nicotinovoransLevy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentumLevy, et al. 2018
Microbacterium oleivoransLevy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r该菌株在Haney, et al. 2015中类似系统中已有报道；本研究所用菌株构建于Cole, et al. 2017

参考文献

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