监测细菌定植与维持 拟南芥 漂浮式水培系统中的根系

摘要

本文介绍了一种水培植物生长检测方法，用于量化物种的存在并可视化细菌在植物根部初始定植期间以及转移到不同生长环境后的空间分布情况。

摘要

细菌形成复杂的根际微生物组，其结构受到微生物之间、较大生物体以及非生物环境相互作用的影响。在实验室条件下，与未定植的植物相比，植物促生细菌（PGPB）对植物根际的定植可提高寄主植物的健康状况或发育水平。然而，在田间条件下，使用PGPB进行细菌处理通常无法为作物带来显著益处。一种可能的解释是，在植物整个生命周期中，PGPB可能因与土壤中原有微生物的相互作用而逐渐丧失。这一假设一直难以证实，因为大多数研究关注的是PGPB的初始定植过程，而非其在根际群落中的长期维持。本文假设细菌群落的组装、共存和维持受到根际微环境确定性特征的调控，这些相互作用可能影响PGPB在自然环境中的存活能力。为了研究这些行为，本研究优化了一种基于水培系统的植物生长实验，利用Arabidopsis thaliana来定量并可视化细菌在植物根部初始定植期间以及转移到不同生长环境后的空间分布情况。随后，通过广泛研究的PGPB菌株Pseudomonas simiae验证了该系统的可重复性与实用性。为了探究多种细菌物种共存如何影响植物根部的定植与维持动态，构建了一个由三种细菌菌株（分别为Arthrobacter、Curtobacterium和Microbacterium物种）组成的模型群落，这些菌株最初均分离自A. thaliana的根际。结果表明，利用该水培植物维持实验可检测到这些多样化细菌物种的存在，从而为基于测序的细菌群落研究提供了一种替代方法。未来利用该系统开展的研究有望加深我们对多物种植物微生物组中细菌行为随时间推移及环境变化规律的理解。

引言

细菌和真菌病害对农作物的破坏会导致粮食产量下降，并可能严重扰乱全球稳定¹。基于在抑病土壤中发现微生物有助于提高植物健康的研究成果²，科学家们开始探讨是否可以通过调控特定细菌种类的存在和丰度，利用植物微生物组来促进植物生长³。那些被发现有助于植物生长或发育的细菌统称为植物促生细菌（plant growth-promoting bacteria, PGPB）。近年来，相关研究已从单纯鉴定潜在的PGPB，转向探究根际（即根系周围及根表区域）土壤中跨生物界相互作用如何影响PGPB活性的机制⁴。

植物根际促生细菌（PGPB）对根际的定殖可增强寄主植物在多种胁迫条件下的健康状况或发育水平，相较于未定殖的植物具有明显优势⁵。然而，与受控严格的温室和实验室环境相比，原位土壤条件下的实验结果往往表现出更大的变异性⁶。造成这种差异的一种假设是，田间原生土壤中的细菌或真菌可能抑制PGPB的生长或行为^7,8。根际细菌产生的有益效应通常依赖于其以下能力：1）定位并趋向根部移动；2）通过生物膜形成实现根部....

方案

注意：实验装置的描述是为了便于理解，并用于生成本报告中包含的代表性结果，但可根据需要修改条件。所有步骤均应根据所用细菌的生物安全等级（BSL），佩戴个人防护装备（PPE），并遵循机构和联邦的安全建议进行操作。

1. 细菌的表征

1. 在固体培养基平板上观察细菌的形态。将菌液重悬至 OD₆₀₀ ≈ 0.5，取 1 µL 点种于所选的琼脂培养基上。在琼脂平板中加入 X-gal 至终浓度为 20 mg/mL，以更好地区分特定细菌群落中的各个成员。在 24 °C 或 30 °C 培养至菌落形成，随后拍摄菌落形态照片并记录观察结果。
2. 确定每种细菌菌株的光密度与每毫升菌落形成单位（CFU）数量之间的相关性¹⁶。将细菌重悬于 24 孔板中的 1 mL 水中，使 OD₆₀₀ ≈ 5，进行两倍系列稀释，测定各稀释度的 OD₆₀₀，并将各稀释液点种于平板，以确定在多个光密度下各样本的活菌数（CFU/mL）。
3. 测定每种细菌菌株所能耐受的最大超声强度。具体操作：将菌液分装至含有液体培养基的 24 孔板中，保留部分菌液作为未超声处理的对照组。使用配备 24 个探头的超声仪，以 40 安培功率、2 秒脉冲模式进行三轮、每轮 12 秒的超声处理。
   注意：建议使用 24 孔超声仪，以便后续对植物样本进行高通量处理；若无此设备....

结果

特征明确的植物根际促生细菌 P. simiae WCS417r 已知可定殖于根部 A. thaliana 在水培培养中。这种天然荧光细菌在定植后可通过显微镜轻松观察到幼苗根部的菌体图2）。尽管可以对这些的全长进行成像 A. thaliana 幼苗（4–6 mm 长）的根部，若对大量植株进行此操作将耗费难以接受的时间。由于大多数在不同时间点及细菌种类间的差异均可通过成像根部的基部、中部和根尖来捕捉¹⁴ （由红色方框标示） 图1），这些区域被优先用于成像，而非对整个根部长度进行成像。在明场图像中 P. simiae-定植的 A. thaliana 根图2), 可以观察到根和根毛的轮廓；然而，在定殖18小时时，无法通过明场图像清晰区.......

讨论

在各种环境中，植物会与成千上万乃至数百万种不同的细菌和真菌相互作用^5,7。这些相互作用可能对植物健康产生正面或负面的影响，进而影响作物产量和食品生产。最近的研究还表明，植物促生细菌（PGPB）在作物上的定殖程度不同，可能是导致田间试验中植物大小和作物产量不可预测的原因之一²²。深入了解这些相互作用背后的机制，可能使我们能够直接调控与植物相关的微生物群落，从而促进植物在正常乃至胁迫条件下的健康生长²⁴。

由于根部的细菌定殖及其在根际中的维持对于植物-微生物相互作用至关重要⁹，我们希望构建一个可重复地可视化并定量这些细菌行为的系统。这种水培浮苗培养系统可实现对拟南芥（A. thaliana）根部细菌群体的显微成像与定量分析。

所描述的植物-微生物互作检测方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
必需材料
1.5 mL 离心管	任意	N/A
24孔板	BD Falcon	1801343
Aeraseal密封膜	Excel Scientific	BE255A2
高压灭菌器	任意	N/A
目标细菌	任意	N/A	建议在-80°C下以40%甘油保存
BactoAgar琼脂	BD	2306428; 货号 214010
次氯酸钠溶液（漂白剂）	任意	N/A
Conviron人工气候室	任意	N/A	短日照光暗循环：光照强度460–600 µmol/m²/s，光周期9小时光照/15小时黑暗，温度18/21°C，配备内置电源插座
干燥器罐：玻璃或厚质塑料	任意	N/A
乙醇	任意	N/A
火焰源	任意	N/A
镊子	任意	N/A
培养箱	任意	N/A	设定为指定细菌生长的最适温度
盐酸	任意	N/A
Lennox LB液体培养基	RPI	L24066-1000.0
微量离心机	任意	N/A
移液器	任意	N/A	量程5 µL 至 1000 µL
显微镜（推荐荧光显微镜）	任意	N/A	若无需高分辨率，普通光学显微镜亦可
MS盐类 + MES缓冲液	RPI	M70300-50.0
轨道式平板摇床	任意	N/A	能够以220 rpm持续运行至少96小时
培养皿	任意	N/A	总容量50 mL
试剂储液槽	任意	N/A
分光光度计	任意	N/A
标准打孔器	任意	N/A	打孔直径约7 mm
无菌水	任意	N/A
医用胶带	3M	MMM1538-1
聚四氟乙烯（Teflon）网筛	McMaster-Carr	1100t41
超声波破碎仪	任意	N/A
涡旋混合器	任意	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	其他供应商亦可提供
推荐材料
24针超声波探头附件	任意	N/A	用于同时超声处理多个样品；也可逐个处理
Alumaseal II密封胶	Excel Scientific	FE124F
玻璃珠	任意	N/A
多通道移液器/重复移液器	任意	N/A
无菌96孔板	任意	N/A	用于梯度稀释；可用离心管替代
使用的生物材料
Arabidopsis thaliana种子	任意	N/A	建议从拟南芥生物资源中心（Arabidopsis Biological Resource Center）获取种子资源
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			该菌株在Haney, et al. 2015中类似系统中已有报道；本研究所用菌株构建于Cole, et al. 2017