本方案旨在指导如何在标准荧光显微镜上实施干涉反射显微技术，用于体外表面实验中对微管进行无标记、高对比度、高速成像。
本文内容
摘要
摘要
有多种方法可用于在表面附近观察纯化的生物大分子。全内反射荧光（TIRF）显微镜是一种常用方法，但其缺点是需要进行荧光标记，而标记可能干扰分子的活性。此外，光漂白和光损伤也是需要关注的问题。对于微管而言，我们发现使用干涉反射显微镜（IRM）可以获得与TIRF质量相当的图像。这表明IRM可能是一种适用于体外观察大分子生物分子及寡聚体动态行为的通用技术。本文中，我们展示了如何对荧光显微镜进行简单改造以获取IRM图像。与其他对比技术（如微分干涉差显微镜或干涉散射显微镜）相比，IRM的实现更为简便且成本显著更低。与暗场显微镜相比，IRM对表面缺陷和溶液杂质的敏感性也更低。结合本文所述的图像分析软件，使用IRM时，视场范围和帧率仅受限于相机性能；采用sCMOS相机和 宽场 照明 时，微管长度可在10 Hz带宽下以高达20 nm的精度进行测量。
引言
无标记微管成像技术具有重要意义，因为它无需对微管蛋白进行荧光标记即可在图像中产生对比度。荧光标记存在若干缺点：当蛋白浓度较低时无法有效标记1，且光漂白和光损伤会限制观察时间。已有多种技术被用于无标记微管成像，包括视频增强微分干涉差显微镜（DIC）和暗场显微镜2,3,4,5。近年来，干涉散射显微镜（iSCAT）6、旋转相干散射显微镜（ROCS）7 和空间光干涉显微镜（SLIM）8 也已被应用。这些技术均能够实现微管成像，并已被证明在研究微管动力学方面具有重要价值。然而，每种方法都有其自身的局限性。在DIC中，对比度依赖于微管与诺马尔斯基棱镜轴之间的夹角。 在暗场成像中，杂质或表面缺陷产生的散射光会降低微管信号的质量。尽管iSCAT具有极高的灵敏度（可达到单个蛋白水平），而ROCS能够对样品更深层的微管进行成像，但这两种方法在技术上要求较高，需要使用激光扫描装置。
本方案展示了如何建立干涉反射显微镜（IRM）9, 10 作为一种无需标记即可成像微管的替代技术。IRM 易于实现，仅需在标准荧光显微镜上添加一个低成本的50/50反射镜即可。结合本文所述软件使用时，IRM 能够生成高对比度的微管图像，可在高速下对大视野进行成像，仅需一次对准，并且可轻松与其他技术（如荧光成像）联用。
方案
1. 显微镜改装与物镜
- 使用合适的滤光片组，将50/50分光镜插入荧光显微镜的滤光轮中（图1）。操作50/50分光镜时需小心，因其表面通常具有抗反射涂层。
注意：本实验中，我们将50/50分光镜置于显微镜的一个空滤光片组中，并将其安装在原本放置二向色镜的位置。 - 使用高倍率/高数值孔径（NA）的油镜。
注意：在本方案中，我们使用了100倍/1.3 NA的物镜。
2. 准备用于使微管黏附至表面的反应室
- 清洁显微镜载玻片以及22 mm × 22 mm盖玻片（用于正置显微镜）或22 mm × 22 mm和18 mm × 18 mm盖玻片（用于倒置显微镜）。根据需要对表面进行修饰。例如，使用碱性洗涤剂清洗盖玻片（参见 材料表）随后用100%乙醇处理，中间及之后均用蒸馏水洗涤11.
- 剪取3 mm宽的塑料石蜡膜条（参见 材料清单使用剃刀刀片和另一张显微镜载玻片的边缘进行操作。
- 在干净的 22 mm × 22 mm 盖玻片上，放置两条相距 3 mm 的塑料石蜡膜条，然后放上一块 18 mm × 18 mm 的盖玻片以形成通道。若使用正置显微镜，则将膜条置于干净的载玻片上，再在其上放置盖玻片。
- 将盖玻片（或载玻片）置于加热块上 100 °C 持续10-30秒，使石蜡膜形成密封通道。
- 流动 50 µg/mL 用移液器在BRB80缓冲液（Brinkley Buffer 1980）中灌注抗体。孵育10分钟。
注意：我们使用抗罗丹明抗体将罗丹明标记的微管种子结合到表面。 alternatively，可使用avidin结合生物素标记的微管种子或生物素化的金颗粒。若仅需在无溶液中微管蛋白的情况下观察微管（即非动态检测），可使用抗微管蛋白抗体。 - 用 BRB80 缓冲液洗涤五次。建议使用 0.22 µm 过滤器
- 在 BRB80 中加入 1% poloxamer 407（一种三嵌段共聚物）以阻断表面非特异性结合。孵育 10 分钟。
- 用BRB80缓冲液洗涤五次。
- 样品已准备好用于显微镜观察。为防止样品干燥，在通道两端各加入两滴 BRB80 缓冲液，并在需要时及时补充。
3. 显微镜校准
- 将样品放置在显微镜载物台上。打开落射照明光源。
- 对样品表面进行聚焦。由于光路中光学元件的背向反射，当物镜上下移动时，您会观察到多个表面。寻找样品表面的一个有效方法是聚焦于石蜡膜边缘。找到表面后，将视野调整至腔室中心。
- 通过将视场光阑关闭一半并使用调节螺丝，将视场光阑居中于视野中。对准后，重新打开光阑。
注意：螺丝调节仅需偶尔进行，大约每3至6个月一次，或在故障排查时进行。 - 推入伯特兰透镜，以观察物镜的出射光瞳（后焦平面）。
- 将孔径光阑（AD）关闭至超过物镜出射光瞳的边缘。
- 使用调节螺丝将孔径光阑与出射光瞳居中对齐。通过打开孔径光阑并使其边缘与出射光瞳边缘对齐来双重检查。
注意：此调节仅需偶尔进行。 - 将孔径光阑设置为物镜数值孔径（NA）的约2/3。有关优化孔径光阑的详细步骤，请参见第7节。
4. 成像稳定的微管或40 nm金颗粒
注意：稳定的微管和金纳米颗粒可作为良好的对照样本。建议首先对表面附着的微管或金纳米颗粒进行成像，以评估反射干涉显微镜（IRM）的性能，并有助于设定最佳的孔径光阑开度（第7节）。
- 将相机的曝光时间设置为 10 ms，并调节照明强度，使相机的动态范围接近饱和。
- 通过移液将 10 µL 的鸟苷酰-(α, β)-亚甲基二磷酸（GMPCCP）或紫杉醇稳定的微管溶液（或 40 nm 金颗粒）在 BRB804,12,13 缓冲液中）灌注到新样品中，通过成像观察表面结合情况。当视野内结合了 10–20 条微管后，用 BRB80 缓冲液洗涤样品 2 次。
注意：在显微镜对准良好的情况下，无需背景扣除即可观察到微管。 - 设置时间间隔为 1 秒、持续 10 秒（曝光时间为 10 ms）的延时拍摄，采集 10 幅图像。
- 采集背景图像。操作方法为：在采集 100 幅图像时（无延迟，即以接近 100 fps 的速度连续采集，曝光时间为 10 ms），使用载物台控制器或计算机软件沿通道长轴方向移动载物台。
注意：背景图像为这 100 幅图像的中值。通过取中值，可保留照明分布以及光学元件上的灰尘等静态特征，而其他动态信号则被滤除。样品不应存在倾斜，否则在移动载物台时会导致轴向位置变化，从而降低背景图像质量。若无法避免倾斜，则可采用替代方法：在灌注微管“种子”前采集平均背景图像。 - 进行图像处理与分析，请进入第 6 步。
5. 成像微管动态
- 使用脑源性微管蛋白研究微管动态时，将样品加热器温度设置为 37 °C。
- 通过移液管灌注 10 µL GMPCCP 稳定的微管种子溶液至新鲜样品中，该溶液使用 BRB8011 缓冲液配制，并通过实时成像（即在灌流过程中）观察其与表面的结合情况。当视野中已有 10–20 个种子结合后，用 2 倍通道体积的 BRB80 缓冲液清洗样品（BRB80 应预先加热至 37 °C，或至少达到室温）。
注意：在显微镜对准良好的情况下，无需背景扣除即可清晰观察到微管种子。 - 灌注聚合反应混合液（含 7.5 µM 未标记微管蛋白、1 mM 鸟苷三磷酸（GTP）、1 mM 二硫苏糖醇（DTT）的 BRB80 缓冲液）。为测量微管生长，使用采集软件设置时间序列，每 5 秒采集一幅图像（即 0.2 帧每秒（fps）），持续 15 分钟。
- 为增强对比度，每个时间点采集 10 幅图像（而非 1 幅）并进行平均。对于微管缩短过程，将时间延迟设为 0，曝光时间为 10 ms，以 100 fps 采集图像（若使用感兴趣区域较小的相机，可实现更高的帧率）。
- 按照步骤 4.4 的方法采集背景图像。
6. 图像处理与分析
注意：本方案在分析时使用 Fiji14，但读者也可自由选择任何其他自认为合适的软件。
- 打开已保存的背景图像。
- 使用 图像 > 栈 > Z 投影 > 中值 计算中值图像（即背景）。
- 使用 文件 > 打开 将微管动态影片作为栈打开（非动态微管操作相同）。
- 使用 处理 > 图像计算器 从栈中减去背景图像。请确保勾选“32位（浮点）结果”选项。
- 对于动态微管，使用直线工具沿目标微管绘制一条线，并通过按“t”键将其添加到感兴趣区域管理器中。对所有目标微管重复此操作。
- 对于动态微管，运行 Multi-Kymo 宏（补充文件 1）。该宏将为感兴趣区域管理器中的每条微管生成一个视频和一张线扫描图（kymograph），每条微管将获得一个唯一的标识符。
- 对于动态微管，运行 Kymo-Analysis 宏（补充文件 2），并按照其步骤测量微管的生长速率和缩短速率。
7. 光圈光阑尺寸
注意：使用干涉反射显微镜（IRM）获取微管高对比度图像的一个重要因素是正确设置照明数值孔径（INA）10,15。通过改变入射照明光束在物镜出瞳处的大小，可以调节INA，而该光束大小由孔径光阑（AD）的尺寸控制（AD位于与物镜出瞳（后焦平面）共轭的平面上，图1）：
其中DAD为孔径光阑的直径，fobjective 为物镜的焦距，Dep为物镜出瞳的直径。通常，在荧光成像时，孔径光阑保持完全打开状态，因此INA等于物镜的NA。在荧光显微镜中，AD刻度并不指示其实际直径，因此无法直接计算INA。尽管可以通过物镜对AD尺寸进行校准，但由于只需将AD固定在产生最高对比度的尺寸即可，因此该步骤并非必需。
- 制备固定在表面的荧光标记稳定微管样品（步骤 4.1–4.2）。
注：我们使用了四甲基罗丹明标记的微管16（激发：550 nm，发射：580 nm）。 - 使用显微镜调焦旋钮将微管调至焦平面，同时进行荧光成像（若微管未标记荧光，可使用红外反射显微术15 或微分干涉差显微术5 成像）。
- 使用相机软件将相机曝光时间设为 10 ms。
注：此曝光时间是任意的，100 ms 的曝光时间同样适用。 - 将孔径光阑（AD）关闭至最小开口。调节照明强度，使其接近相机动态范围的饱和值或达到可能的最大值。
注：可参考图像采集软件通常提供的查找表作为指导。 - 对一个包含 10 根以上微管的视野连续采集 10 幅图像（通过连续采集或每隔 1 秒拍摄 1 幅图像）。
- 按照步骤 4.4 的方法采集一幅背景图像。
- 改变孔径光阑（AD）的大小，并在整个孔径光阑开启范围（从关闭状态至出射光瞳尺寸，图 2）内重复步骤 7.5–7.6。每次改变 AD 尺寸时，均需调节照明强度，使其与步骤 7.4 中的强度一致。
- 对每个采集的视野图像，使用 图像处理 > 图像计算器（process > image calculator） 功能，在下拉菜单中选择“相减（subtract）”，减去对应的背景图像。确保勾选“32 位（浮点）结果（32bit (float) result）”选项。然后使用 图像 > 图像栈 > Z 投影 > 平均（image > stack > Z project > average） 对所得图像进行平均。
- 测量微管的信背比（SBR），其定义为微管信号的平均强度（微管强度减去背景强度）除以背景的标准差（图 3）。
- 通过计算每种孔径光阑开启尺寸下微管的平均 SBR，确定最佳 AD 尺寸（即最佳 INA），并将 AD 尺寸设定为产生最高 SBR 的值（图 2）。可能存在一段 AD 尺寸范围均可产生相近的对比度15。
结果
如上所述，在显微镜良好准直的情况下，应无需背景扣除即可观察到微管（图4A）。扣除背景（图4B）可增强微管的对比度（图4C）。为进一步提高对比度，可采用平均滤波、傅里叶滤波，或二者结合的方法（图4D,F,E）。图4G中的线扫描显示了图像质量的逐步改善。请注意，每一步处理均减少了背景噪声。
从延时录像生成的微管动态典型走时图如图5所示。视频以两种帧率采集：0.2 fps（慢速）和100 fps（快速）。前者适用于测量微管生长速率，而后者更适合测量比生长速率快一个数量级的微管缩短速率。
当使用金纳米颗粒校准显微镜时，图6展示了一个示例图像。金纳米颗粒被动吸附在表面。虽然推荐使用40 nm的颗粒，但也可对20 nm的颗粒进行成像，只是对比度较低。
图1. 干涉反射显微镜（IRM）示意图。 (A) 来自光源的落射照明光束穿过孔径光阑后到达50/50分光镜。孔径光阑决定了光束宽度，从而设定了照明数值孔径（NA）。50/50分光镜将部分光线反射至物镜，用于照射样品。从样品反射的光线被收集后，经管镜投射到相机芯片上，通过干涉形成图像。图像对比度源于从玻璃/水界面反射的光（I1）与从水/微管界面反射的光（I2）之间的干涉。根据微管与表面之间的距离（h），I1与I2之间的光程差将导致相长干涉（明亮信号）、相消干涉（暗信号）或介于两者之间的任何状态。例如，若使用波长为600 nm的光进行成像，当微管高度变化约100 nm时，对比度将在暗与亮之间切换。星号表示共轭平面（修改自15）。 (B) 50/50分光镜安装示例。打开一个合适的滤光立方盒，在通常放置二向色镜的位置插入该分光镜，并按照制造商说明正确朝向。然后将立方盒装入滤光轮中，并将滤光轮重新装回显微镜（图中未示）。安装过程中需佩戴手套，且仅可接触镜片边缘。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 最佳孔径光阑设置。（A） 在未进行背景扣除的情况下，同一视野在不同孔径光阑开度下成像。从视觉上看，随着孔径光阑尺寸的增大，对比度逐渐提高，直至达到平台期，随后开始下降。这一点通过（B） 背景扣除后图像的信背比（SBR）测量结果得到证实。误差条表示标准偏差。比例尺分别为 500 µm（AD）和 3 µm（微管）。请点击此处查看此图的放大版本。
图3. 信噪比（Signal-to-Background Ratio, SBR）的测量。 在选定的感兴趣区域中分离微管结构。对每个感兴趣区域进行阈值分割，以区分微管与背景信号。通过沿微管进行线扫描获取微管平均信号强度，扫描线宽度设置为等于微管长度。如此，扫描线上每一点均为沿微管轴线方向上所有与该点平行的像素信号的平均值。背景噪声为低于阈值截断的所有像素信号的标准差。请点击此处查看该图的高清版本。
图4. 图像处理。 在获取原始图像 (A) 后，减去背景 (B) 以增强微管的对比度 (C)。为进一步提高对比度，对图像进行平均处理 (D)、傅里叶滤波 (E)，或同时进行两种处理 (F)。线扫描图 (G) 的位置由 (A) 中的红色虚线标示，并以颜色对应于 (A) 至 (F) 中的各幅图像。右下角的数值为在整个视野范围内测得的平均信背比（SBR）。比例尺为 5 µm（修改自15）。请点击此处查看此图的放大版本。
图5. 典型的显迹图示例。 （A）由以0.2 fps采集的时间推移视频生成的微管动态显迹图示例。（B）由以100 fps采集的视频生成的收缩事件显迹图示例。虚线标记了成核位点。请点击此处查看该图的高清版本。
图6. 使用IRM成像的金纳米颗粒示例。 尺寸为20 nm和40 nm的金纳米颗粒被被动吸附至表面。共采集了10张图像。经背景扣除后，对图像进行平均以增强对比度。请点击此处查看该图的放大版本。
图7. 在反射干涉显微镜（IRM）图像中微管长度追踪的精度。 对已稳定的微管（即长度固定）以100帧/秒的速率连续成像200次，随后降采样至10帧/秒以增强对比度。接着使用Fiesta17追踪软件测量微管的长度。对于每根微管，计算其平均长度和标准差，如图所示（虚线表示平均值，实红线表示标准差，长度 = 3971 ± 20 nm）。总体追踪精度为所有被追踪微管标准差的平均值（n = 6根微管 × 20个数据点 = 120个数据点）。请点击此处查看该图的高清版本。
补充文件 1. 请点击此处下载该文件。
补充文件 2. 请点击此处下载该文件。
讨论
本方案展示了利用干涉反射显微镜（IRM）成功成像并测量微管动态过程的方法。在实验中应正确设置照明系统的数值孔径，因为它对图像对比度的影响最为显著。此外，使用高数值孔径（NA）物镜对于获得高分辨率和高对比度图像至关重要，因为相比低NA物镜，高NA物镜具有更强的光收集能力。所使用的表面和溶液越洁净，背景噪声就越低，因为杂质会附着在表面，并在实验过程中逐渐引入类似散斑的噪声。获取背景图像同样重要，因为它可消除照明不均、静态噪声以及表面不规则性带来的影响。
建议的改进方法是在照明光路中引入一个长通滤光片（>600 nm）。白光光源的光谱通常包含紫外波长，可能对微管造成损伤。此外，在将干涉反射显微镜（IRM）与荧光成像联用时（例如研究微管相关蛋白（MAPs）对微管动力学的影响），使用较长波长的红外光尤为便利。需要注意的是，在长时间成像过程中，样品漂移（特别是沿光轴方向的漂移）会导致成像平面偏离背景平面，从而降低图像对比度。现代显微镜通常配备有稳定机制（例如，Nikon的Perfect Focus系统、Zeiss的Definite Focus.2、Olympus的IX3-ZDC2）。另一种解决方案是通过被动或主动方式对系统进行热稳定18，或通过漂移校正技术来补偿漂移19,20,21。最后，可通过减小视场光阑的尺寸来提高微管的对比度（将光阑开至70%左右是一个较佳选择，可在提高对比度与保持视场大小之间取得良好平衡）15。
虽然反射式干涉显微镜（IRM）适用于微管成像，但其灵敏度不足以检测单个蛋白质。对于此类应用，干涉散射显微技术（iSCAT）更为合适。同样地，当需要低于10 nm的追踪精度时，荧光显微技术和iSCAT更具优势。对于IRM而言，其测量得到的长度追踪精度约为20 nm，如图7所示。
IRM在表面检测中的应用不仅限于微管；例如，可以使用金纳米颗粒标记分子马达，并追踪其与微管的相互作用。此外，一种更高级的IRM技术，称为反射干涉对比显微镜（RICM）22，原则上可用于进一步增强微管的对比度，并获得更高的追踪精度。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢 Anna Luchniak 和 Yin-wei Kuo 对本实验方案提出的审阅意见与修改建议。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 显微镜 | Nikon | Ti-Eclipse | 用于进行实验的倒置显微镜 |
| 50/50 分束器 | Chroma | 21000 | 购买时请确保选择适合显微镜所用立方体尺寸的分束器 |
| NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris 物镜 | Nikon | MRH02902 | 成像物镜。该物镜具有可调节数值孔径（NA）的虹膜，实验中将其打开至 NA 1.3 |
| Mucasol 通用洗涤剂 | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | 用于清洁盖玻片和载玻片 |
| 塑料石蜡膜（商品名 Parafilm M） | Sigma-aAldrich | P7793 | 用于构建流动通道 |
| 抗 TAMRA 抗体 | Invitrogen | A-6397 | 用于将 TAMRA 标记的分子（例如微管）结合到样品表面。RRID (AB_2536196) |
| Poloxamer 407（商品名 Pluronic F-127） | Sigma-aAldrich | 用于封闭通道表面，防止非特异性结合 | |
| 40 nm 金纳米颗粒 | Sigma-aAldrich | 753637 | 用作对照样品 |
| 20 nm 金纳米颗粒 | Sigma-aAldrich | 753610 | 用作对照样品 |
| Zyla 4.2 相机 | Andor | Zyla 4.2 | 2048×2048 像素（6.5µm 像素尺寸），量子效率为 72%，动态范围为 16 位 |
| Feista 跟踪软件 | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
| 稳定化的微管 | 实验室自制（参见文中参考文献） |
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