可视化蛋白质激酶 在头部固定行为小鼠中使用 Vivo 双光子荧光寿命成像显微镜的活性

Summary

提出了一个程序,以可视化蛋白激酶A活动在头部固定,行为小鼠。改进的A-激酶活动报告器tAKAR®在皮质神经元中表达,并通过颅窗口进行成像。双光子荧光寿命成像显微镜用于在强制运动期间可视化体内的PKA活动。

Abstract

神经调节对大脑功能有强大的控制作用。神经调节系统功能障碍导致神经和精神疾病。尽管技术非常重要,但用细胞分辨率跟踪神经调节事件的技术才刚刚开始出现。神经调节剂,如多巴胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱和血清素,通过各自的G蛋白耦合受体触发细胞内信号事件,以调节神经元兴奋性、突触通信和其他神经元功能,从而调节神经元网络中的信息处理。上述神经调节器收敛到cAMP/蛋白激酶A(PKA)通路。因此,在体内,具有单细胞分辨率的PKA成像被开发为神经调节事件的读出,其方式类似于神经元电活动的钙成像。在此,提出一种方法,在头部固定行为小鼠皮层的各个神经元水平上可视化PKA活动。为此,使用了一个改进的A-激酶活动报告器(AKAR),称为tAKAR®,它基于Fürster共振能量转移(FRET)。这种基因编码的PKA传感器通过DNA质粒的子宫电穿孔(IUE)或腺相关病毒(AAV)的立体注射引入运动皮层。FRET 变化使用双光子荧光寿命成像显微镜 (2pFLIM) 进行成像,该显微镜比比例 FRET 测量具有优势,用于量化光散射脑组织中的 FRET 信号。为了研究强迫运动期间的PKA活动,tAKAR®通过清醒、头部固定的小鼠皮层上方的慢性颅窗成像,这些小鼠在速度控制的电动跑步机上运行或休息。这种成像方法将适用于许多其他大脑区域,以研究相应的行为诱导的PKA活动和其他基于FLIM的传感器进行体内成像。

Introduction

神经调节,也称为缓慢突触传输,在不同的行为状态(如压力、觉醒、注意力和运动1、2、3)期间对大脑功能施加强有力的控制。^4.尽管其重要性,神经调节事件发生的时间和地点的研究仍处于起步阶段。神经调节剂,包括乙酰胆碱、多巴胺、肾上腺素、血清素和许多神经肽,激活G蛋白耦合受体(GPCRs),进而触发细胞内第二信使通路,时间范围很宽从秒到小时。虽然每个神经调节器触发一组不同的信号事件,cAMP/蛋白质激酶A(PKA)通路是许多神经调节器1,5的常见下游通路。cAMP/PKA通路调节神经元兴奋性、突触性传播和可塑性6,7,8,9,因此,调节神经元网络动力学。由于不同的神经元或神经元类型表达不同类型或水平的神经调节器受体10,同一细胞外神经调节器的细胞内效应可能是异质的,因此....

Protocol

这里描述的所有方法都已获得俄勒冈健康与科学大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。

1. 2pFLIM 显微镜设置

1. 安装光子定时计数模块(PTCM,材料表),并根据制造商手册连接到计算机(图1)。
   注:PTCM 通常是接收激光脉冲计时的"同步"输入和来自光电倍增管 (PMT) 的光子输入的计算机板。它还从双光子成像控制软件接收像素、线条和帧的时钟计时。PTCM 使用时钟信号将单个光子分离到不同的像素和帧中。
2. 添加具有 >200 MHz 带宽的光电二极管,以测量激光定时。在光道中放置一个标准玻璃盖玻片,将激光的一小部分反射到垂直于光路的光电二极管中(图1)。将光电二极管输出连接到 PTCM 的"同步"输入。
   注:许多现代激光器也输出激光正时。对于这些激光器,光电二极管是不必要的,可以直接将激光正时输出连接到PTCM的同步输入。
3. 在 tAKAR® 的情况下,使用低噪声、快速 GaAsP PMT 交换 PMT(图 1)。将 PMT 输出连接到 PTCM 的信号输入。
   1. ....

Results

FRET-FLIM 传感器允许可视化许多不同的信号通路,包括神经调节中涉及的 cAMP/PKA 通路。当前协议利用最近开发的 takaR® 传感器与 2pFLIM 相结合,在头部固定行为小鼠中可视化 PKA 活动。大多数现有的双光子显微镜可以通过添加三到四个组件来升级,如图 1所示(另请参阅第 1 节)。为了在2pFLIM采集的图像中可视化FRET,对每像素收集的光子计时的直方图图进行了平均寿命的量化(图3A,B)。使用伪彩色图像可视化平均生存期,其中高(冷色)和低(暖色)均值分别表示低和高 PKA 活动,因为 PKA 激活会导致寿命缩短。必须注意正确设置 SPC 范围;此范围应在激光脉冲间隔内设置(例如,脉冲速率为 80 MHz 的 12.5 ns),并尽可能减少硬件边缘伪影(另请参阅第 6 节和讨论)。通过组合给定 ROI 内所有像素的 LT(图 3C

Discussion

该协议演示了使用 FRET-FLIM 传感器 tAKAR® 来可视化头部固定行为小鼠的神经调节触发的 PKA 活动。此应用基于 TAKAR® 体外和体内的广泛测试和表征,以证明获得的 FLIM 信号与生理神经调节事件¹⁷相关。在这里,一个在体内的应用,运动诱导的PKA活动在运动皮层,用于描述程序,提供传感器到大脑,动物手术成像,硬件和软件要求的行为和成像数据采集,用于成像数据分析的软件和算法。

TAKAR®传感器通过DNA质粒的IUE或AAV粒子的立体注射引入皮层。根据电穿孔参数和DNA浓度,IUE在皮^层25相对较大的区域产生皮质神经元的各种标记密度。使用 IUE 标记的皮质层由手术时的胚胎阶段确定。当AAV粒子需要成像定义的大脑分区域内的许多细胞时,将使用AAV粒子的立体注入。它通常导致在注射中心有密集标记的神经元,并且离中心越来越稀疏。重要的是,大脑中细胞的感染效率取决于所使用的AAV血清型。AAV2/1在皮质、丘质和纹状神经元中具有相对较低的逆行标记活性,具有极高的效率。建议从经验.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm 醋酸纤维素针头过滤器	Nalgene	190-2520	步骤 3.2.2.
16x 0.8 NA 水浸物镜	尼康	MRP07220	步骤 5.5。
3 针电缆	US 数字	CA-MIC3-SH-NC	步骤 2.5.将旋转传感器连接到显微镜的 DAQ 输入
铝制面包板	Thorlabs	MB1012	步骤 2.5。
AnimalTracker MATLAB 软件	N/A	N/A	步骤 2.5 和第 5 - 6 节。将根据要求提供给主要作者
带通屏障滤波器	Chroma	ET500-40m	步骤 1.4。
笼式板	Thorlabs	CP01	步骤 2.4.用作旋转传感器的支架
用于微型钻头的碳钢毛刺，尖端直径为 0.5 毫米	FST	19007-05	步骤 3.2.3. 和 4.4.
圆形盖玻片（直径 5 mm）	VWR	101413-528	步骤 4.5.
定制的注射针架	N/A	N/A	步骤 3.2.4.应要求向主要作者提供技术细节
牙科丙烯酸	Yates Motloid	44114	步骤 4.3. 和 4.5.
牙钻;Microtorque ii	Ram 产品	66699	步骤 3.2.3. 和 4.4.
Dowsil 透明聚合物	陶氏化学公司	3-4680	步骤 4.5.人工硬脑膜
电穿孔电极	Bex	LF650P5	步骤 3.1.4.
电穿孔仪	Bex	CUY21	步骤 3.1.4.
快速绿色 FCF	Sigma-aldrich	F7258-25G	步骤 3.1.1.
FLIMimage MATLAB 软件	N/A	N/A	第 5 节。由佛罗里达州马克斯普朗克
FLIMview MATLAB 软件	N/A	N/A	5 节和第 6 节。将根据要求提供给主要作者
泡沫兼容胶水 （Gorilla White Glue）	Gorilla	5201204	步骤 2.3。
头板	N/A	N/A	步骤 4.3.应要求向主要作者提供技术细节
	不	不	步骤 2.6。应要求提供技术细节 第一作者，与安装柱支架和直角支架结合使用
液压显微作器	Narishige	MO-10	步骤 3.2.4。
Krazy 胶水	Krazy 胶	水 KG82648R	步骤 4.3.氰基丙烯酸酯基胶水
低噪声快速光电倍增管	滨松	H7422PA-40 或 H10769PA-40	步骤 1.3.
MATLAB 2012b	Mathworks	不适用	步骤 2.6，以及第 5 节和第 6 节。用于运行显微镜采集和数据分析软件
Motor	Zhengke	ZGA37RG	Step 2.4。
电机速度控制器	Elenker	EK-G00015A1-1	步骤 2.5.
电动显微作器	Sutter	MP-285	步骤 3.2.4.
安装底座	Thorlabs	BA1S	步骤 2.5.用于电机和传感器的接线柱，与 PH4 和 TR2 安装
柱	Thorlabs	P14	步骤 2.6.用于头板固定柱与 PB2
安装柱底座	Thorlabs	PB2	步骤 2.6 的组合。用于头板支架与 P14
安装柱支架	Thorlabs	C1515	步骤 2.6 的组合。与直角支架和头板支架结合使用
光学柱	Thorlabs	TR2	Step 2.5。与 BA1S 和 PH4 磷酸盐缓冲盐水结合使用，用于电机和传感器的接线柱
	Ν/Α	Ν/Α	步骤 3.2.2.协议：冷泉港协议 2006，doi：10.1101/pbd.rec8247
光电二极管	Thorlabs	FDS010	步骤 1.2。
光子定时计数模块	Becker 和 Hickl	SPC-150	步骤 1.1.
质粒：tAKARα（CAG-tAKARα-WPRE）	Addgene	119913	步骤 3.1.3.
职位持有人	Thorlabs	PH4	步骤 2.5.与 BA1S 和 TR2 右
角支架	Thorlabs	AB90	步骤 2.6 与安装柱支架和头板支架组合使用
旋转编码器	美国数字	MA3-A10-250-N	步骤 2.4.
橡胶垫	Rubber-Cal	B01DCR5LUG	步骤 2.1.
联轴器（1/4 英寸 x 1/4 英寸）	麦克马斯特	6208K433	步骤 2.3. 和 2.4.
ScanImage 3.6	Svoboda Lab/Vidrio Technology	不适用	步骤 5.9. 和 6.1.
信号分路器	Becker 和 Hickl	HPM-CON-02	步骤 1.3.1.
不锈钢轴（直径 1/4 英寸，L = 12 英寸）	麦克马斯特	1327K66	步骤 2.3.
立体定位对位系统	David kopf	1900	步骤 3.2. 和 4.1. 修改;萨特显微作器，定制注射针架，液压显微作器
双光子显微镜	N/A	N/A	第 5 节。基于 HHMI Janelia Research Campus （https://www.janelia.org/open-science/mimms） 的模块化体内多光子显微镜系统 （MIMMS） 构建Vetbond
组织胶粘剂	3M	14006	步骤 3.2.6。
病毒：tAKARα（AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE）	Addgene	119921	步骤 3.2.2.
白色 PE 发泡辊 （8 英寸 x 12 英寸）	制造企业 INC.	30-2261	步骤 2.1.1.
白色聚苯乙烯球半	GrahamSweet	直径 200 毫米 2 个空心半球	步骤 2.1.1.
Zipkicker	PACER	PT29	步骤 4.3.硬化加速器