使用活体双光子荧光寿命成像显微技术在头部固定行为小鼠中可视化蛋白激酶A活性

摘要

本文介绍了一种在头部固定的活动小鼠中可视化蛋白激酶A活性的方法。通过颅窗将改良的A激酶活性报告基因tAKARα在皮层神经元中表达并实现成像。利用双光子荧光寿命成像显微技术，在强制运动过程中体内可视化PKA活性。

摘要

神经调节对大脑功能具有强大的调控作用。神经调节系统的功能障碍会导致神经性和精神性疾病。尽管神经调节系统至关重要，但能够以细胞分辨率追踪神经调节事件的技术才刚刚兴起。多巴胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱和5-羟色胺等神经调质通过各自的G蛋白偶联受体触发细胞内信号传导事件，从而调节神经元的兴奋性、突触通讯及其他神经功能，进而调控神经网络中的信息处理过程。上述神经调质均汇聚于环磷酸腺苷/蛋白激酶A（PKA）信号通路。因此，开发了以单细胞分辨率为基准的活体PKA成像技术，作为检测神经调节事件的读出手段，其作用方式类似于利用钙成像来监测神经元的电活动。本文介绍了一种在固定头部的行为小鼠大脑皮层中，对单个神经元水平的PKA活性进行可视化的方法。该方法采用一种改进的蛋白激酶A活性报告分子（AKAR），称为tAKARα，其基于荧光共振能量转移（FRET）原理。这种基因编码的PKA传感器通过DNA质粒的子宫内电穿孔（IUE）或腺相关病毒（AAV）的立体定位注射导入运动皮层。利用双光子荧光寿命成像显微技术（2pFLIM）检测FRET的变化，该技术在量化光散射脑组织中的FRET信号方面优于比值型FRET测量方法。为研究强制运动过程中PKA的活性变化，通过小鼠清醒状态下皮层上方植入的慢性颅窗，对tAKARα进行成像，小鼠在速度可控的电动跑台上进行奔跑或静息。该成像方法可广泛适用于其他多种脑区，用于研究相应行为诱导的PKA活性变化，也可推广至其他基于荧光寿命成像（FLIM）的传感器，用于活体成像研究。

引言

神经调节（也称为慢突触传递）在不同行为状态（如应激、觉醒、注意力和运动）下对大脑功能施加强有力的调控^1,2,3,4。尽管其重要性已被广泛认识，但关于神经调节事件发生的时间和位置的研究仍处于初级阶段。神经调节物质包括乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺以及多种神经肽，它们通过激活G蛋白偶联受体（GPCRs），进而触发细胞内第二信使通路，其作用时间尺度广泛，从数秒到数小时不等。虽然每种神经调节物质会引发特定的信号传导事件，但cAMP/蛋白激酶A（PKA）通路是多种神经调节物质共有的下游通路^1,5。cAMP/PKA通路调控神经元的兴奋性、突触传递和可塑性^6,7,8,9，从而调节神经元网络的动力学特性。由于不同神经元或神经元类型表达不同类型或水平的神经调节物质受体¹⁰

方案

本文所述所有方法均已获得俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 双光子FLIM显微镜设置

1. 安装光子定时计数模块（PTCM，材料表），并根据制造商手册将其连接至计算机（图1）。
   注意： PTCM通常是一块计算机板卡，接收来自激光脉冲的“同步”输入信号以及来自光电倍增管（PMT）的光子输入信号。它还接收来自双光子成像控制软件的像素、扫描线和帧的时钟信号。PTCM利用这些时钟信号将单个光子分配到不同的像素和帧中。
2. 添加一个带宽>200 MHz的光电二极管以测量激光时序。在光路中放置标准玻璃盖玻片，将一小部分激光反射至垂直于光路放置的光电二极管中（图1）。将光电二极管输出连接至PTCM的“同步”输入端。
   注意： 许多现代激光器本身即可输出激光时序信号。对于此类激光器，无需使用光电二极管，可直接将激光器的时序输出连接至PTCM的同步输入端。
3. 更换PMT，对于tAKARα，需将绿色通道的PMT更换为低噪声、快速响应的GaAsP PMT（图1）。将PMT输出连接至P....

结果

FRET-FLIM 传感器可用于可视化多种不同的信号通路，包括参与神经调节的 cAMP/PKA 通路。本实验方案采用近期开发的 tAKARα 传感器，并结合双光子荧光寿命成像技术（2pFLIM），以在固定头部的行为小鼠中可视化 PKA 活性。大多数现有的双光子显微镜可通过添加三到四个组件升级为具备 2pFLIM 功能，如图1所示（另见第1节）。为了在 2pFLIM 获取的图像中可视化 FRET，需对每个像素收集的光子到达时间直方图进行平均寿命的量化分析（图3A、B）。平均寿命通过伪彩色图像进行可视化展示，其中较高的平均寿命（冷色调）和较低的平均寿命（暖色调）分别代表较低和较高的 PKA 活性，因为 PKA 的激活会导致荧光寿命缩短。必须谨慎正确设置 SPC 范围；该范围应设定在激光脉冲间隔内（例如 80 MHz 脉冲频率对应的 12.5 ns），并尽量减少硬件边缘伪影（另见第6节及“讨论”部分）。对感兴趣区域（ROI）内.......

讨论

本方案展示了使用FRET-FLIM传感器tAKARα在头部固定的行为小鼠中可视化神经调节触发的PKA活性。该应用基于对tAKARα在体外和体内进行的大量测试与表征，以证明所获得的FLIM信号与生理性的神经调节事件相关¹⁷。本文以运动诱导的运动皮层中PKA活性这一在体应用为例，详细描述了将传感器递送至脑组织、用于成像的动物手术、行为与成像数据采集所需的硬件和软件要求，以及成像数据分析所用的软件与算法。

通过子宫内电穿孔（IUE）导入DNA质粒或通过立体定位注射AAV颗粒，可将tAKARα传感器引入大脑皮层。根据电穿孔参数和DNA浓度的不同，IUE可在皮层相对较大的区域内实现不同程度的皮层神经元标记密度²⁵。使用IUE所标记的皮层层级取决于手术时的胚胎发育阶段。当需要在特定脑亚区成像大量细胞时，通常采用立体定位注射AAV颗粒。该方法通常在注射中心处产生密集的神经元标记，而距离中心越远，标记密度逐渐降低。重要的是，AAV对脑内细胞的感染效率取决于所使用的AAV血清型。AAV2/1在皮层、丘脑和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 μm 醋酸纤维素注射器滤器	Nalgene	190-2520	步骤 3.2.2.
16倍 0.8 NA 水浸物镜	Nikon	MRP07220	步骤 5.5.
3针电缆	US digital	CA-MIC3-SH-NC	步骤 2.5. 用于连接旋转传感器与显微镜的DAQ输入端口
铝制光学平台板	Thorlabs	MB1012	步骤 2.5.
AnimalTracker MATLAB 软件	N/A	N/A	步骤 2.5 及第5–6节。可向通讯作者申请获取
带通滤光片	Chroma	ET500-40m	步骤 1.4.
笼式安装板	Thorlabs	CP01	步骤 2.4. 用作旋转传感器的安装支架
微型钻头用碳钢钻头，尖端直径 0.5 mm	FST	19007-05	步骤 3.2.3. 和 4.4.
圆形盖玻片（直径 5 mm）	VWR	101413-528	步骤 4.5.
定制注射针固定装置	N/A	N/A	步骤 3.2.4. 技术细节可向通讯作者申请获取
牙科丙烯酸树脂	Yates Motloid	44114	步骤 4.3. 和 4.5.
牙科钻机；Microtorque ii	Ram products	66699	步骤 3.2.3. 和 4.4.
道康宁透明聚合物	The Dow Chemical Company	3-4680	步骤 4.5. 人工硬脑膜
电穿孔电极	Bex	LF650P5	步骤 3.1.4.
电穿孔仪	Bex	CUY21	步骤 3.1.4.
亮蓝FCF	Sigma-aldrich	F7258-25G	步骤 3.1.1.
FLIMimage MATLAB 软件	N/A	N/A	第5节。由Max Planck Florida研究所Ryohei Yasuda博士惠赠
FLIMview MATLAB 软件	N/A	N/A	第5和第6节。可向通讯作者申请获取
泡沫兼容胶水（Gorilla 白胶）	Gorilla	5201204	步骤 2.3.
头固定板	N/A	N/A	步骤 4.3. 技术细节可向通讯作者申请获取
头固定板支架	N/A	N/A	步骤 2.6. 技术细节可向通讯作者申请获取，需与安装柱支架和直角支架配合使用
液压显微操作器	Narishige	MO-10	步骤 3.2.4.
Krazy胶水	Krazy glue	KG82648R	步骤 4.3. 氰基丙烯酸酯类胶水
低噪声高速光电倍增管	Hamamatsu	H7422PA-40 或 H10769PA-40	步骤 1.3.
MATLAB 2012b	Mathworks	N/A	步骤 2.6 及第5、6节。用于运行显微镜采集和数据分析软件
电机	Zhengke	ZGA37RG	步骤 2.4.
电机调速控制器	Elenker	EK-G00015A1-1	步骤 2.5.
电动显微操作器	Sutter	MP-285	步骤 3.2.4.
安装底座	Thorlabs	BA1S	步骤 2.5. 与PH4和TR2配合使用，用于电机和传感器的安装柱
安装柱	Thorlabs	P14	步骤 2.6. 与PB2配合使用，用于头固定板支架的安装柱
安装柱底座	Thorlabs	PB2	步骤 2.6. 与P14配合使用，用于头固定板支架的安装柱
安装柱支架	Thorlabs	C1515	步骤 2.6. 与直角支架和头固定板支架配合使用
光学安装柱	Thorlabs	TR2	步骤 2.5. 与BA1S和PH4配合使用，用于电机和传感器的安装柱
磷酸盐缓冲液	Ν/Α	Ν/Α	步骤 3.2.2. 方案来源：Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
光电二极管	Thorlabs	FDS010	步骤 1.2.
光子计时计数模块	Becker and Hickl	SPC-150	步骤 1.1.
质粒：tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE)	Addgene	119913	步骤 3.1.3.
安装柱固定夹	Thorlabs	PH4	步骤 2.5. 与BA1S和TR2配合使用，用于电机和传感器的安装柱
直角支架	Thorlabs	AB90	步骤 2.6 与安装柱支架和头固定板支架配合使用
旋转编码器	US digital	MA3-A10-250-N	步骤 2.4.
橡胶垫	Rubber-Cal	B01DCR5LUG	步骤 2.1.
轴套联轴器（1/4 英寸 × 1/4 英寸）	McMaster	6208K433	步骤 2.3. 和 2.4.
ScanImage 3.6	Svoboda Lab/Vidrio Technology	N/A	步骤 5.9. 和 6.1.
信号分路器	Becker and Hickl	HPM-CON-02	步骤 1.3.1.
不锈钢轴（直径 1/4 英寸，长度 L = 12 英寸）	McMaster	1327K66	步骤 2.3.
立体定位对准系统	David Kopf	1900	步骤 3.2. 和 4.1. 经过改装；包含Sutter显微操作器、定制注射针固定装置和液压显微操作器
双光子显微镜	N/A	N/A	第5节。基于HHMI Janelia研究园区的模块化活体多光子显微系统（MIMMS）构建（https://www.janelia.org/open-science/mimms）
Vetbond 组织粘合剂	3M	14006	步骤 3.2.6.
病毒：tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE)	Addgene	119921	步骤 3.2.2.
白色聚乙烯泡沫滚筒（8 英寸 × 12 英寸）	Fabrication Enterprises INC.	30-2261	步骤 2.1.1.
白色聚苯乙烯泡沫球半球（直径 200 mm，两个空心半球）	GrahamSweet	200mm diameter 2 hollow halves	步骤 2.1.1.
Zipkicker	PACER	PT29	步骤 4.3. 硬化加速剂