斑马鱼晶状体核定位及缝合完整性的评估

摘要

这些实验方案旨在分析斑马鱼晶状体的皮质形态、固定和活体晶状体缝合结构的完整性，并测量斑马鱼晶状体核沿前-后轴的位置。

摘要

斑马鱼特别适合进行遗传操作 体内 成像，使其成为反向遗传学研究和转基因品系构建中日益流行的模型 体内 成像。这些独特优势使斑马鱼成为研究眼晶状体发育与生理学的理想平台。我们近期发现，水通道蛋白-0（Aqp0a）对于维持晶状体前缝的稳定性以及随着年龄增长晶状体核向中心迁移具有重要作用，这一发现促使我们开发出专门适用于分析斑马鱼晶状体特性的工具。本文概述了适用于幼体和成体晶状体的详细解剖方法，以制备用于组织学分析、免疫组织化学和成像的样本。我们重点分析晶状体缝合完整性及皮质细胞形态，并将解剖所得晶状体的数据与通过其他方法获取的数据进行比较 体内 利用一种携带基因编码荧光标记的新型转基因斑马鱼品系实现晶状体形态的成像。通过沿晶状体光轴垂直方向对分离的晶状体进行分析，可量化晶状体核沿前后轴的相对位置。在成年斑马鱼中，晶状体核需从初始的前部位置移至中心，以实现正常的晶状体光学功能。因此，对晶状体核位置的定量测量可直接反映其光学特性。

引言

斑马鱼是研究晶状体发育和生理学的优良模型，因其晶状体在解剖结构上与哺乳动物相似，且易于进行遗传学和药理学操作，胚胎期眼部发育迅速，早期阶段个体小且通体透明，便于观察 体内 成像。本文所述方法旨在分析斑马鱼在胚胎期和成体期的晶状体形态，重点关注缝合完整性及皮质膜形态 体外 和 体内以及晶状体核沿前-后轴的位置 离体这些方法可作为研究晶状体发育与生理功能的起点，也可用于斑马鱼晶状体表型的反向遗传学筛选。

斑马鱼晶状体形态成像

水通道蛋白0（AQP0）是晶状体膜中最丰富的蛋白质，在哺乳动物中对晶状体的发育和透明性具有关键作用，因其具备多种重要功能。斑马鱼具有两种Aqp0（Aqp0a和Aqp0b），我们已建立了在胚胎期和成体晶状体中分析其功能缺失的方法。我们的研究表明 aqp0a^-/- 突变体由于前极缝合线不稳定而出现前极混浊， aqp0a/b 双突变体出现核不透明现象¹AQP0 已被证明在水运输中发挥作用²黏附^3,4细胞骨架锚定

方案

本研究中使用的动物实验方案遵循眼科与视觉研究中动物使用 ARVO 声明，并已获得加州大学欧文分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 斑马鱼饲养与安乐死

1. 在标准实验室条件下饲养和维持斑马鱼（AB品系）¹²。将胚胎置于胚胎培养基（EM）中培养¹²。从受精后20-24小时（在prim-5阶段之前）开始，在胚胎培养基中添加0.003% PTU，以防止用于胚胎期成像的胚胎形成色素¹²⁹。在受精后6至30天期间，以活体轮虫喂养幼鱼直至14 dpf，之后以活体卤虫喂养¹²。
   注意：PTU具有高毒性
2. 使用三卡因麻醉鱼类直至其对触碰无反应。
   1. 通过将400 mg 3-氨基苯甲酸乙酯与2.1 mL 1 M Tris（pH 9）溶于100 mL ddH₂O中配制三卡因储备液。调节pH至7.0，并于-20 °C保存。
      注意：三卡因具有毒性。
   2. 将4.2 mL三卡因储备液加入100 mL养殖用水中以麻醉幼....

结果

成年斑马鱼的眼睛解剖结构与哺乳动物高度相似（图1A）。尽管斑马鱼与哺乳动物的眼睛存在一些差异，例如具有睫状区而非睫状体¹⁷、光学特性不同¹⁸，以及胚胎发育过程中形态发生方面的差异¹⁹，斑马鱼眼睛仍是研究眼发育和理解眼科疾病的理想模型^20,21,22。一层简单的上皮组织覆盖在晶状体前极，在赤道部，这些细胞终生经历增殖、伸长并分化为晶状体纤维细胞，构成晶状体的主体部分。成熟的纤维细胞（图1B，浅蓝色）最早在胚胎期开始分化，其细胞器完全消失，且终生不再更新。正在分化的纤维细胞尖端在晶状体两极相遇，形成前极和后极的缝合线。随后，这些细胞.......

讨论

斑马鱼晶状体形态分析是理解突变体表型或研究药理干预对眼晶状体生物学影响的首要步骤。本文概述了分析晶状体缝合线、皮质纤维细胞形态以及晶状体核特征的方法。这些方法结合了 体外 和 体内 （比较于 表格 1）. 该 体外 方法能够更详细地观察外层皮质细胞的形态，并可获取成年晶状体的后部缝合线。

体内分析可通过使用转基因标记实现。我们在此介绍的转基因具有晶状体膜特异性，与现有的Q01斑马鱼品系相比，后者在标记晶状体膜的同时还会标记眼部其他细胞类型（包括无长突细胞），从而增加了解读难度¹¹。由于眼色素上皮在胚胎发育第二天即形成，会限制体内信号的观察，因此在此阶段及后续阶段进行分析时需对胚胎进行PTU处理。在成体中，虹膜会遮挡晶状体皮质的清晰观察，但允许对晶状体前部皮质进行 体内分析。对活体鱼类晶状体的成像可实现对同一动物晶状体形态的纵向研究。该技术对于研究动态过程（如渗透压或药.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-苯基-2-硫脲（PTU）	Sigma	P7629	警告 – 剧毒
4% 甲醛水溶液	Electron Microscopy Sciences	RT 157-4	警告 – 有害健康，可燃
共聚焦显微镜	Nikon	Eclipse Ti-E
冷冻切片机	Leica	CM3050S	物镜和腔室温度设定为 -21 °C
DAPI	Invitrogen	D1306	警告 – 对眼睛和皮肤有刺激性
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher Scientific	D128	警告 – 可燃，可穿透皮肤
一次性底模	VWR Scientific	15154-631
一次性巴斯德玻璃移液管	Fisherbrand	13-678-20A
Dumont #5 镊子	Dumont & Fils		保持镊子锋利
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine）	Sigma-Aldrich	A5040	警告 - 有毒
玻璃底微孔培养皿（35 mm 培养皿，14 mm 微孔，#1.5 盖玻片）	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
甘油	Sigma	G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA 构建体	Addgene	ID:122451
ImageJ	Wayne Rasband, NIH	v1.51n
低熔点琼脂糖（LMA）	Apex	902-36-6
NIS-Elements	Nikon	V 4.5
NIS-Elements AR 软件	Nikon
Olympus  配备型号为 2.1.1.183 的控制器	Olympus Corp	DP70
Olympus 显微镜	Olympus Corp	SZX12
鬼笔环肽-Alexa Flour 546	Thermo Fisher	A22283
酚红指示剂（1% w/v）	Ricca Chemical Company	5725-16
磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific	BP399
Photoshop	Adobe	CS5 v12.0
Photoshop 软件	Adobe	CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD 物镜	Nikon
电源	Wild Heerbrugg	MTr 22	或同等电源
载片加热器型号 No. 26020FS	Fisher Scientific	12-594
氢氧化钠颗粒	Fisher Scientific	S612-3	警告 - 具腐蚀性/对眼睛和皮肤有刺激性，靶器官 - 呼吸系统，对金属具腐蚀性
Superfrost/Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
Sylgard 184 硅胶（Dow Corning）	World Prevision Instruments	SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583
Triton X-100 BioXtra	Sigma	T9284	警告 – 有毒，对水生环境有害，具腐蚀性
Vannas 显微解剖剪	Ted Pella Inc	1346	尖端锋利/直头
Vectashield 抗荧光淬灭封片剂	Vector laboratories	H-1000
麦胚凝集素（WGA）-Alexa Flour-594	Life Technologies	W11262