斑马鱼晶状体核定位及缝合完整性的评估

摘要

这些实验方案旨在分析斑马鱼晶状体的皮质形态、固定和活体晶状体缝合结构的完整性，并测量斑马鱼晶状体核沿前-后轴的位置。

摘要

斑马鱼特别适合进行遗传操作 体内 成像，使其成为反向遗传学研究和转基因品系构建中日益流行的模型 体内 成像。这些独特优势使斑马鱼成为研究眼晶状体发育与生理学的理想平台。我们近期发现，水通道蛋白-0（Aqp0a）对于维持晶状体前缝的稳定性以及随着年龄增长晶状体核向中心迁移具有重要作用，这一发现促使我们开发出专门适用于分析斑马鱼晶状体特性的工具。本文概述了适用于幼体和成体晶状体的详细解剖方法，以制备用于组织学分析、免疫组织化学和成像的样本。我们重点分析晶状体缝合完整性及皮质细胞形态，并将解剖所得晶状体的数据与通过其他方法获取的数据进行比较 体内 利用一种携带基因编码荧光标记的新型转基因斑马鱼品系实现晶状体形态的成像。通过沿晶状体光轴垂直方向对分离的晶状体进行分析，可量化晶状体核沿前后轴的相对位置。在成年斑马鱼中，晶状体核需从初始的前部位置移至中心，以实现正常的晶状体光学功能。因此，对晶状体核位置的定量测量可直接反映其光学特性。

引言

斑马鱼是研究晶状体发育和生理学的优良模型，因其晶状体在解剖结构上与哺乳动物相似，且易于进行遗传学和药理学操作，胚胎期眼部发育迅速，早期阶段个体小且通体透明，便于观察 体内 成像。本文所述方法旨在分析斑马鱼在胚胎期和成体期的晶状体形态，重点关注缝合完整性及皮质膜形态 体外 和 体内以及晶状体核沿前-后轴的位置 离体这些方法可作为研究晶状体发育与生理功能的起点，也可用于斑马鱼晶状体表型的反向遗传学筛选。

斑马鱼晶状体形态成像

水通道蛋白0（AQP0）是晶状体膜中最丰富的蛋白质，在哺乳动物中对晶状体的发育和透明性具有关键作用，因其具备多种重要功能。斑马鱼具有两种Aqp0（Aqp0a和Aqp0b），我们已建立了在胚胎期和成体晶状体中分析其功能缺失的方法。我们的研究表明 aqp0a^-/- 突变体由于前极缝合线不稳定而出现前极混浊， aqp0a/b 双突变体出现核不透明现象¹AQP0 已被证明在水运输中发挥作用²黏附^3,4细胞骨架锚定⁵ 以及折射率梯度的生成⁶，但这些研究在很大程度上是进行的 体外斑马鱼为研究Aqp0a或Aqp0b功能缺失或功能紊乱如何影响活体晶状体的形态与功能提供了独特的机会。为评估发育过程中晶状体细胞的形态及缝合结构的完整性，我们对现有方法进行了改进 体外 免疫组织化学方法⁷ 用于胚胎和成年晶状体，并构建转基因模型以监测该过程 体内.

对固定后的完整胚胎和成年晶状体进行了血浆膜结构和缝合完整性的免疫组织化学分析。与哺乳动物相比，斑马鱼晶状体极小（胚胎期晶状体直径约为100 µm，成年期可达1 mm），具有点状缝合⁸，这在冷冻切片中很少能观察到。因此，完整晶状体对于分析缝合完整性至关重要。对于 体内 通过分析前部缝合线的形成以及精确的晶状体细胞结构成像，我们构建了转基因品系，特异性表达标记晶状体膜的 mApple。

活体成像晶状体膜转基因模型的优势包括：1）避免固定所导致的人工假象；2）通过延时录像研究动态形态变化；3）实现纵向研究，将早期事件与后期表型相关联。虹膜的色素沉着通常会阻碍对晶状体周边区域的清晰成像。在原始-5（prim-5）阶段之前添加1-苯基-2-硫脲（PTU）⁹ 可抑制黑色素生成及眼睛色素沉着，直至受精后约4天（dpf）。然而，4 dpf后，晶状体周边区域变得模糊 体内尤其是发育较晚阶段。此外，晶状体本身的密度会阻碍对其后极部的成像。因此，若要在4 dpf后研究晶状体周边部或后部缝合结构的形态，需要将晶状体切除并固定。

转基因斑马鱼品系已被用于在活体中分析晶状体膜结构in vivo¹⁰。 转基因品系Q01在晶状体纤维细胞中广泛表达一种与膜靶向序列Gap43融合的青色荧光蛋白，该表达由EF1α启动子及DF4 pax6增强子元件的六聚体驱动¹¹。Q01在晶状体外也有表达，包括视网膜中的无长突细胞，这会在研究重点为晶状体时引入背景信号。我们开发了一种新型转基因品系，可在晶状体中特异性表达膜锚定型mApple，旨在避免任何晶状体外信号的干扰。

晶状体核定位

我们发现，在斑马鱼幼体中，晶状体核最初位于前部位置，而在成体晶状体的前后轴上则移至中心位置。这种高折射率晶状体核位置的改变被认为对斑马鱼晶状体光学特性的正常发育至关重要¹。我们的方法可实现对晶状体核中心化程度相对于晶状体半径的量化分析。利用该方法，我们证明了Aqp0a在晶状体核中心化过程中是必需的¹，且这一简单方法可广泛应用于斑马鱼模型中晶状体发育、生理及其光学特性相关研究。

方案

本研究中使用的动物实验方案遵循眼科与视觉研究中动物使用 ARVO 声明，并已获得加州大学欧文分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 斑马鱼饲养与安乐死

1. 在标准实验室条件下饲养和维持斑马鱼（AB品系）¹²。将胚胎置于胚胎培养基（EM）中培养¹²。从受精后20-24小时（在prim-5阶段之前）开始，在胚胎培养基中添加0.003% PTU，以防止用于胚胎期成像的胚胎形成色素¹²⁹。在受精后6至30天期间，以活体轮虫喂养幼鱼直至14 dpf，之后以活体卤虫喂养¹²。
   注意：PTU具有高毒性
2. 使用三卡因麻醉鱼类直至其对触碰无反应。
   1. 通过将400 mg 3-氨基苯甲酸乙酯与2.1 mL 1 M Tris（pH 9）溶于100 mL ddH₂O中配制三卡因储备液。调节pH至7.0，并于-20 °C保存。
      注意：三卡因具有毒性。
   2. 将4.2 mL三卡因储备液加入100 mL养殖用水中以麻醉幼鱼或成鱼，或加入胚胎培养基中以麻醉胚胎（终浓度为0.0165% w/v）。

2. 胚胎和幼虫的固定

注意：免疫组织化学实验方案改编自先前发表的材料⁷。

1. 将去壳的胚胎或受精后两周内的幼虫置于含4%（v/v）多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在4 °C摇床上固定过夜。
   注意：PFA具有可燃性，且为致癌物。
2. 用PBS洗涤胚胎三次，每次10分钟，随后在含10% Triton和1% DMSO的PBS（PBS-T）中于4 °C透化过夜。
   注意：DMSO有毒，经口摄入或皮肤吸收有害，可携带危险物质穿透皮肤，且具有可燃性。Triton有毒、具腐蚀性，对水生环境有害。

3. 斑马鱼幼体和成体晶状体的解剖

1. 使用三卡因将6 dpf幼鱼至成年鱼麻醉至对触碰无反应，但仍保持强烈心跳。按照Schilling（2002）的方法测量鱼的标准体长以进行发育分期¹³。
2. 立即使用显微解剖剪切除眼睛，并将其放入含PBS的解剖皿中（图2展示成年鱼眼睛）。
   1. 制作一个装有硅胶的定制35 mm培养皿，用于晶状体解剖。待硅胶凝固后，在其中挖出一个直径约2–3 mm、深度约0.5 mm的凹坑，用于在解剖过程中固定成年鱼的眼睛或晶状体。
3. 成年斑马鱼晶状体的解剖
   1. 将一只成年鱼的眼睛背面朝上置于盛有PBS的培养皿凹坑中。通过视盘以<45°角插入镊子固定眼球，注意不要划伤或压迫晶状体。使用解剖剪从视盘向睫状区在视网膜和巩膜上做两到三个放射状切口。
   2. 像掀开花瓣一样将视网膜和巩膜剥离，并将眼球翻转，使角膜朝上。利用剪刀的平面对巩膜和角膜进行操作，间接固定晶状体，同时用镊子拉离视网膜及其附着组织。小心修剪晶状体周围的多余组织。
      注意：必须仔细解剖，以获得始终健康的晶状体。
4. 幼年斑马鱼晶状体的解剖
   1. 将幼鱼的眼睛背面朝上放置在盛有PBS的硅胶培养皿平坦区域，使用 sharpened 钨针在视网膜和巩膜上做放射状切割，同时用另一根钨针或镊子固定眼球。
      注意：注意不要损伤晶状体。
      1. 通过电解法 sharpen 一段2 cm长、直径0.1 mm的钨丝：将钨丝尖端悬于10%（w/v）NaOH溶液中并施加低电压交流电¹⁴。使用本生灯加热玻璃毛细管末端，将钨针固定于巴斯德吸管中。
         注意：也可使用其他精细解剖工具。
         警告： NaOH具有腐蚀性。
   2. 用钨针的钝端轻轻将晶状体从解离的眼球中舀出，并小心拉除附着组织。

4. 解剖晶状体的固定

1. 将解剖得到的晶状体立即置于含1.5% (v/v) 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在室温（RT）下固定24小时。用PBS清洗晶状体三次，每次10分钟。
2. 对晶状体进行通透处理以用于整体封片分析，或进行冷冻保护以用于冷冻切片（见第8节）。
   1. 在PBS-T中于4 °C下过夜通透晶状体。

5. 晶状体免疫组织化学

1. 通过在鬼笔环肽- Alexa Fluor 546（1:200）中孵育，对标记固定后的胚胎/幼虫或成体晶状体的膜结构 在4 °C下，用含DAPI（1:1,000稀释，原液浓度为5 mg/mL）的PBS-T溶液避光孵育细胞核过夜。
   警告： DAPI 对皮肤和眼睛有刺激性。
2. 用 PBS-T 洗涤三次，每次 10 分钟。在 PBS-T 中依次加入 30%、50% 和 70% 的甘油（v/v），于室温下每步孵育至少 1 小时，或在 4 °C 下过夜，以清除组织。
3. 将鱼样置于含70%甘油（v/v）的PBS-T中，用35 mm玻璃底共聚焦培养皿进行封片，尽量使眼睛平直紧贴盖玻片。对于较年轻的鱼，可轻微向前外侧倾斜，以帮助调整晶状体缝合线与盖玻片平行。

6. 利用转基因品系分析斑马鱼晶状体前缝 体内

1. 生成 Tg(βB1cry:mAppleCAAX) 使用 Tol2 试剂盒的转基因品系¹⁵Tol2 转座元件系统¹⁵ 实现由人源300 bp启动子驱动mApple表达的构建体的稳定整合 βB1-结晶素启动子¹⁶ 通过CAAX序列锚定在膜上，从而特异性地在晶状体纤维细胞膜中表达。
   注意： 该质粒（编号：122451）可购买。
   1. 注射当天早晨，配制注射混合液，并置于冰上保存。为获得终体积为 10 µL 且含有无 RNase 和 DNase 的 H₂O，添加：1.5 µL 的 huβB1cry:mAppleCAAX DNA 载体，50 ng/µL — [最终注射量 0.375–0.75 pg]，Tol2 转座酶 mRNA 1.5 µL，300 ng/µL（Tol2 试剂盒）¹⁵ [15-30 pg/终次注射]，以及1 µL 1% w/v 的酚红指示剂 [1×10^-5%（w/v）/终末注射量]
   2. 向1细胞期胚胎注射50-100 pL注射混合液¹².
2. 通过检测3 dpf时mApple阳性晶状体胚胎的频率，测定F0注射胚胎的转基因效率。
   注意： 预计将会 >使用该方法可实现80%的转基因效率。F0代嵌合体可用于对单个细胞的膜形态进行详细分析。不同程度的嵌合性使得研究者能够对单个细胞或少量细胞群体的形态进行成像，而更广泛的晶状体表达则可用于分析多细胞结构，如晶状体缝合线。 体内.
3. 将F0代嵌合鱼进行杂交以建立稳定品系，用于标记所有纤维细胞膜。F0代 founder 鱼若将转基因整合至生殖系，其后代将获得稳定的转基因整合，可由此建立并维持转基因品系。

7. 利用转基因品系分析斑马鱼晶状体前缝 在体 内

1. 将3 dpf或成年嵌合体或稳定转基因鱼用三卡因麻醉后，置于含三卡因的1%低熔点琼脂糖（LMA）中，使眼睛紧贴玻璃底微型培养皿的盖玻片进行固定。
   1. 将1 g LMA溶解于100 mL EM（不含亚甲蓝）中，配制1% LMA。长期储存时分装为15 mL储备液，置于4 °C保存。使用前微波加热溶解，并将溶液维持在42 °C直至使用。
2. LMA凝固后，用含三卡因的EM覆盖6 dpf以内的幼鱼，或用含三卡因的养殖水覆盖成年鱼。
   1. 若成像对象为PTU处理的鱼类，取5 mL不含亚甲蓝的EM或养殖水，加入250 µL三卡因储备液和7 µL PTU。

8. 晶状体冷冻切片与免疫组织化学

1. 将固定后的胚胎或成体晶状体用PBS（w/v）配制的10%蔗糖溶液在室温下浸泡，随后分别用20%蔗糖溶液在室温下处理1小时（或在4 °C下过夜），最后在4 °C下用30%蔗糖溶液浸泡过夜，以进行冷冻保护。
2. 将组织包埋于OCT包埋剂中的底模内，再用OCT将包埋块固定于持样头，于恒冷切片机中切片（厚度12–14 µm），并将切片贴附于Superfrost/Plus载玻片上。将载玻片置于预热至约35 °C的玻片加热台上，使切片受热贴附约10分钟。
3. 用PBS洗涤切片三次，每次10分钟。加入Phalloidin-Alexa Flour 546（1:200）与DAPI（1:1,000）或WGA-Alexa Flour 594（1:200）对切片进行标记，孵育后再次用PBS洗涤三次。使用抗荧光淬灭封片剂封片，并用指甲油密封盖玻片。

9. 成像

1. 使用共聚焦显微镜获取图像。采用60倍、数值孔径1.2的水浸物镜或类似物镜，从晶状体前极至后极的特定区域采集z轴层扫图像或光学切片。成像参数设置如下：使用561 nm激光，针孔大小为1.2艾里斑，Texas Red滤光片用于phalloidin-Alexa Fluor 546或mApple信号检测，或使用405 nm激光配合紫外滤光片检测DAPI信号。
2. 校正z轴方向的激光功率强度，以补偿随晶状体深度增加而导致的信号衰减。该方法可在固定或活体3天龄胚胎晶状体后极获得强信号，同时在成年鱼晶状体赤道区的光学切片中实现强信号检测。
3. 使用图像处理软件对图像进行整合与观察。

10. 晶状体核在前后轴方向定位的测量

1. 将新鲜摘除的晶状体置于含 PBS 的 35 mm 培养皿中，培养皿底部为盖玻片，使晶状体轴向定位，极点和缝合线与焦平面平行。通过观察折射率差异来识别晶状体核，该差异通常出现在晶状体皮质与晶状体核的交界处。
   注意：健康的野生型成年晶状体极为透明，难以观察到晶状体缝合线和晶状体核，或确定晶状体方向。此时，可用镊子在晶状体囊膜上轻微划伤，造成微小损伤，约 10 分钟后缝合线和晶状体核会变得明显，有助于晶状体的定位。但晶状体因已受损，无法用于后续实验。
2. 使用带相机的解剖显微镜，在明场照明条件下（可选是否使用 DIC 光学元件），对晶状体核处于焦平面的晶状体进行成像。在相同放大倍数下对显微测微尺成像，用于校准。
   1. 点击实时预览按钮，调整曝光参数以清晰显示晶状体核和晶状体周边区域，然后点击快照按钮获取图像。保存为 tif 文件。
   2. 使用图像处理软件对获取的晶状体图像进行校准。选择直线工具，在显微测微尺图像上绘制已知长度的线段，点击分析 | 设定比例尺。输入已知距离、单位，并选择“全局”校准，然后点击确定。
3. 测量晶状体核中心至前极的距离（a - r）。
   1. 在图像处理软件中使用直线工具，在轴向方向上穿过成像的晶状体核中心绘制一条线段，将该线段的中点视为晶状体核的中心。
   2. 从该点绘制另一条线段至晶状体前极，并在“分析”菜单中选择“测量”，以测定距离（a - r），其中 a 为晶状体半径，r 为晶状体中心至晶状体核中心的距离。
   3. 绘制一条从前极至后极的线段，并测量该距离作为晶状体直径（2a）。从“结果”窗口复制这些长度数据，并导入电子表格或统计分析软件。
      注意：精确测量晶状体核中心至前极的距离比测量晶状体核中心至晶状体中心的距离更容易。该测量值可通过第 10.3.5 步中的公式转换，以报告晶状体核中心相对于晶状体中心的位置。测量时始终使用成年晶状体核，即使胚胎期晶状体核仍可见。
   4. 将直径除以 2，计算晶状体半径 a。
   5. 计算 r/a，公式为 ，该值表示晶状体核相对于晶状体半径的归一化定位。
      注意：若晶状体核更靠近前极，则 r/a 将 >0.0；若晶状体核位于中心位置，则 r/a 为 0.0。
4. 以标准化的轴向晶状体核测量值的对数为纵坐标，标准体长为横坐标作图，以确定斑马鱼发育过程中晶状体核定位的变化。

结果

成年斑马鱼的眼睛解剖结构与哺乳动物高度相似（图1A）。尽管斑马鱼与哺乳动物的眼睛存在一些差异，例如具有睫状区而非睫状体¹⁷、光学特性不同¹⁸，以及胚胎发育过程中形态发生方面的差异¹⁹，斑马鱼眼睛仍是研究眼发育和理解眼科疾病的理想模型^20,21,22。一层简单的上皮组织覆盖在晶状体前极，在赤道部，这些细胞终生经历增殖、伸长并分化为晶状体纤维细胞，构成晶状体的主体部分。成熟的纤维细胞（图1B，浅蓝色）最早在胚胎期开始分化，其细胞器完全消失，且终生不再更新。正在分化的纤维细胞尖端在晶状体两极相遇，形成前极和后极的缝合线。随后，这些细胞...

讨论

斑马鱼晶状体形态分析是理解突变体表型或研究药理干预对眼晶状体生物学影响的首要步骤。本文概述了分析晶状体缝合线、皮质纤维细胞形态以及晶状体核特征的方法。这些方法结合了 体外 和 体内 （比较于 表格 1）. 该 体外 方法能够更详细地观察外层皮质细胞的形态，并可获取成年晶状体的后部缝合线。

体内分析可通过使用转基因标记实现。我们在此介绍的转基因具有晶状体膜特异性，与现有的Q01斑马鱼品系相比，后者在标记晶状体膜的同时还会标记眼部其他细胞类型（包括无长突细胞），从而增加了解读难度¹¹。由于眼色素上皮在胚胎发育第二天即形成，会限制体内信号的观察，因此在此阶段及后续阶段进行分析时需对胚胎进行PTU处理。在成体中，虹膜会遮挡晶状体皮质的清晰观察，但允许对晶状体前部皮质进行 体内分析。对活体鱼类晶状体的成像可实现对同一动物晶状体形态的纵向研究。该技术对于研究动态过程（如渗透压或药...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-苯基-2-硫脲（PTU）	Sigma	P7629	警告 – 剧毒
4% 甲醛水溶液	Electron Microscopy Sciences	RT 157-4	警告 – 有害健康，可燃
共聚焦显微镜	Nikon	Eclipse Ti-E
冷冻切片机	Leica	CM3050S	物镜和腔室温度设定为 -21 °C
DAPI	Invitrogen	D1306	警告 – 对眼睛和皮肤有刺激性
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher Scientific	D128	警告 – 可燃，可穿透皮肤
一次性底模	VWR Scientific	15154-631
一次性巴斯德玻璃移液管	Fisherbrand	13-678-20A
Dumont #5 镊子	Dumont & Fils		保持镊子锋利
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine）	Sigma-Aldrich	A5040	警告 - 有毒
玻璃底微孔培养皿（35 mm 培养皿，14 mm 微孔，#1.5 盖玻片）	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
甘油	Sigma	G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA 构建体	Addgene	ID:122451
ImageJ	Wayne Rasband, NIH	v1.51n
低熔点琼脂糖（LMA）	Apex	902-36-6
NIS-Elements	Nikon	V 4.5
NIS-Elements AR 软件	Nikon
Olympus  配备型号为 2.1.1.183 的控制器	Olympus Corp	DP70
Olympus 显微镜	Olympus Corp	SZX12
鬼笔环肽-Alexa Flour 546	Thermo Fisher	A22283
酚红指示剂（1% w/v）	Ricca Chemical Company	5725-16
磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific	BP399
Photoshop	Adobe	CS5 v12.0
Photoshop 软件	Adobe	CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD 物镜	Nikon
电源	Wild Heerbrugg	MTr 22	或同等电源
载片加热器型号 No. 26020FS	Fisher Scientific	12-594
氢氧化钠颗粒	Fisher Scientific	S612-3	警告 - 具腐蚀性/对眼睛和皮肤有刺激性，靶器官 - 呼吸系统，对金属具腐蚀性
Superfrost/Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
Sylgard 184 硅胶（Dow Corning）	World Prevision Instruments	SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583
Triton X-100 BioXtra	Sigma	T9284	警告 – 有毒，对水生环境有害，具腐蚀性
Vannas 显微解剖剪	Ted Pella Inc	1346	尖端锋利/直头
Vectashield 抗荧光淬灭封片剂	Vector laboratories	H-1000
麦胚凝集素（WGA）-Alexa Flour-594	Life Technologies	W11262