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方法文章

斑马鱼晶状体核定位及缝合完整性的评估

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DOI：

10.3791/59528

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2019年5月6日

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

本文内容

摘要

这些实验方案旨在分析斑马鱼晶状体的皮质形态、固定和活体晶状体缝合结构的完整性，并测量斑马鱼晶状体核沿前-后轴的位置。

摘要

斑马鱼特别适合进行遗传操作 体内 成像，使其成为反向遗传学研究和转基因品系构建中日益流行的模型 体内 成像。这些独特优势使斑马鱼成为研究眼晶状体发育与生理学的理想平台。我们近期发现，水通道蛋白-0（Aqp0a）对于维持晶状体前缝的稳定性以及随着年龄增长晶状体核向中心迁移具有重要作用，这一发现促使我们开发出专门适用于分析斑马鱼晶状体特性的工具。本文概述了适用于幼体和成体晶状体的详细解剖方法，以制备用于组织学分析、免疫组织化学和成像的样本。我们重点分析晶状体缝合完整性及皮质细胞形态，并将解剖所得晶状体的数据与通过其他方法获取的数据进行比较 体内 利用一种携带基因编码荧光标记的新型转基因斑马鱼品系实现晶状体形态的成像。通过沿晶状体光轴垂直方向对分离的晶状体进行分析，可量化晶状体核沿前后轴的相对位置。在成年斑马鱼中，晶状体核需从初始的前部位置移至中心，以实现正常的晶状体光学功能。因此，对晶状体核位置的定量测量可直接反映其光学特性。

引言

斑马鱼是研究晶状体发育和生理学的优良模型，因其晶状体在解剖结构上与哺乳动物相似，且易于进行遗传学和药理学操作，胚胎期眼部发育迅速，早期阶段个体小且通体透明，便于观察 体内 成像。本文所述方法旨在分析斑马鱼在胚胎期和成体期的晶状体形态，重点关注缝合完整性及皮质膜形态 体外 和 体内以及晶状体核沿前-后轴的位置 离体这些方法可作为研究晶状体发育与生理功能的起点，也可用于斑马鱼晶状体表型的反向遗传学筛选。

斑马鱼晶状体形态成像

水通道蛋白0（AQP0）是晶状体膜中最丰富的蛋白质，在哺乳动物中对晶状体的发育和透明性具有关键作用，因其具备多种重要功能。斑马鱼具有两种Aqp0（Aqp0a和Aqp0b），我们已建立了在胚胎期和成体晶状体中分析其功能缺失的方法。我们的研究表明 aqp0a-/- 突变体由于前极缝合线不稳定而出现前极混浊， aqp0a/b 双突变体出现核不透明现象1AQP0 已被证明在水运输中发挥作用2黏附3,4细胞骨架锚定5 以及折射率梯度的生成6，但这些研究在很大程度上是进行的 体外斑马鱼为研究Aqp0a或Aqp0b功能缺失或功能紊乱如何影响活体晶状体的形态与功能提供了独特的机会。为评估发育过程中晶状体细胞的形态及缝合结构的完整性，我们对现有方法进行了改进 体外 免疫组织化学方法7 用于胚胎和成年晶状体，并构建转基因模型以监测该过程 体内.

对固定后的完整胚胎和成年晶状体进行了血浆膜结构和缝合完整性的免疫组织化学分析。与哺乳动物相比，斑马鱼晶状体极小（胚胎期晶状体直径约为100 µm，成年期可达1 mm），具有点状缝合8，这在冷冻切片中很少能观察到。因此，完整晶状体对于分析缝合完整性至关重要。对于 体内 通过分析前部缝合线的形成以及精确的晶状体细胞结构成像，我们构建了转基因品系，特异性表达标记晶状体膜的 mApple。

活体成像晶状体膜转基因模型的优势包括：1）避免固定所导致的人工假象；2）通过延时录像研究动态形态变化；3）实现纵向研究，将早期事件与后期表型相关联。虹膜的色素沉着通常会阻碍对晶状体周边区域的清晰成像。在原始-5（prim-5）阶段之前添加1-苯基-2-硫脲（PTU）9 可抑制黑色素生成及眼睛色素沉着，直至受精后约4天（dpf）。然而，4 dpf后，晶状体周边区域变得模糊 体内尤其是发育较晚阶段。此外，晶状体本身的密度会阻碍对其后极部的成像。因此，若要在4 dpf后研究晶状体周边部或后部缝合结构的形态，需要将晶状体切除并固定。

转基因斑马鱼品系已被用于在活体中分析晶状体膜结构in vivo10。 转基因品系Q01在晶状体纤维细胞中广泛表达一种与膜靶向序列Gap43融合的青色荧光蛋白，该表达由EF1α启动子及DF4 pax6增强子元件的六聚体驱动11。Q01在晶状体外也有表达，包括视网膜中的无长突细胞，这会在研究重点为晶状体时引入背景信号。我们开发了一种新型转基因品系，可在晶状体中特异性表达膜锚定型mApple，旨在避免任何晶状体外信号的干扰。

晶状体核定位

我们发现，在斑马鱼幼体中，晶状体核最初位于前部位置，而在成体晶状体的前后轴上则移至中心位置。这种高折射率晶状体核位置的改变被认为对斑马鱼晶状体光学特性的正常发育至关重要1。我们的方法可实现对晶状体核中心化程度相对于晶状体半径的量化分析。利用该方法，我们证明了Aqp0a在晶状体核中心化过程中是必需的1，且这一简单方法可广泛应用于斑马鱼模型中晶状体发育、生理及其光学特性相关研究。

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方案

本研究中使用的动物实验方案遵循ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用的规定，并已获得加州大学欧文分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 斑马鱼饲养与安乐死

  1. 在标准实验室条件下饲养和维持斑马鱼（AB品系）12。将胚胎置于胚胎培养基（EM）中培养12。从受精后20-24小时（在prim-5阶段之前）开始，在EM中添加0.003% PTU，以防止用于胚胎期成像的胚胎形成色素129。在受精后6至30天期间，以活体轮虫喂养幼鱼直至14 dpf，之后改用活体卤虫喂养12。
    注意：PTU具有高毒性
  2. 使用三卡因麻醉鱼类直至其对触碰无反应。
    1. 通过将400 mg 3-氨基苯甲酸乙酯与2.1 mL 1 M Tris（pH 9）溶于100 mL ddH2O中配制三卡因储备液。调节pH至7.0，并于-20 °C保存。
      注意：三卡因具有毒性。
    2. 将4.2 mL三卡因储备液加入100 mL养殖用水中以麻醉幼鱼或成鱼，或加入胚胎培养基（EM）中以麻醉胚胎（终浓度为0.0165% w/v）。

2. 胚胎和幼虫的固定

注意：免疫组织化学实验方案改编自先前发表的材料7。

  1. 将去壳的胚胎或受精后最多两周的幼体在4% (v/v) 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于4 °C在摇床上固定过夜。
    注意：PFA易燃且具有致癌性。
  2. 用PBS洗涤胚胎三次，每次10分钟，然后在含10% Triton和1% DMSO的PBS（PBS-T）中于4 °C透化过夜。
    注意：DMSO有毒，经口摄入或皮肤吸收有害，可携带危险物质穿透皮肤，且易燃。Triton有毒、具有腐蚀性，并对水生环境有害。

3. 斑马鱼幼体及成体晶状体的解剖

  1. 用三卡因将6 dpf幼鱼至成年鱼麻醉至对触碰无反应但仍有强烈心跳。按照Schilling（2002）的方法测量鱼的标准体长以确定发育阶段13.
  2. 立即使用显微解剖剪切除眼球，并置于含 PBS 的解剖皿中（图2 （成年眼睛的示意图）。
    1. 制作一个装有硅胶的定制35 mm培养皿，用于晶状体解剖。待硅胶凝固后，挖出一个直径约2-3 mm、深度约0.5 mm的凹坑，用于在解剖过程中固定成年眼球/晶状体。
  3. 成年斑马鱼晶状体的解剖
    1. 将一只成年眼球置于盛有 PBS 的培养皿凹槽中，眼球后侧朝上。用镊子插入眼球以固定 <45° 通过视盘切开角度。注意不要划伤或压迫晶状体。使用解剖剪从视盘向睫状区在视网膜和巩膜上做两到三个放射状切口。
    2. 像展开花瓣一样掀开视网膜和巩膜，并将眼球翻转，使角膜朝上。用剪刀的钝面操作巩膜和角膜，间接固定晶状体，同时用镊子将视网膜及附着组织轻轻拉离。仔细修剪晶状体周围多余的组织。
      注意： 仔细解剖以获得始终健康的晶状体至关重要。
  4. 斑马鱼幼虫晶状体的解剖
    1. 将幼虫的眼置于盛有PBS的硅胶培养皿的平坦处，使眼的后侧朝上，用锋利的钨针在另一根钨针或镊子固定眼球的同时，穿过视网膜和巩膜做放射状切割。
      注意： 注意不要损坏镜头。
      1. 将一段2 cm长、直径0.1 mm的钨丝尖端通过电解法进行 sharpening：将钨丝尖端悬于10%（w/v）NaOH溶液中，并施加低电压交流电14将针头插入巴斯德吸管中，并用本生灯熔化玻璃末端以固定针头。
        注意： 也可使用其他精细解剖工具。
        警告： NaOH 具有腐蚀性。
    2. 用针的钝端轻轻将晶状体从解离的眼球中挖出，并小心移除附着的组织。

4. 离体晶状体的固定

  1. 立即将解剖得到的晶状体用含1.5% (v/v) PFA的PBS溶液在室温（RT）下固定24小时。用PBS洗涤晶状体三次，每次10分钟。
  2. 对晶状体进行整体染色分析时需进行通透处理，或为冷冻切片做冷冻保护处理（参见第8节）。
    1. 在4 °C下，用PBS-T对晶状体过夜通透处理。

5. 晶状体免疫组织化学

  1. 通过在鬼笔环肽- Alexa Fluor 546（1:200）中孵育，对固定后的胚胎/幼虫或成体晶状体的膜进行标记 细胞核用 PBS-T 稀释的 DAPI（1:1,000，5 mg/mL 原液）避光孵育过夜 4 °C.
    注意： DAPI 对皮肤和眼睛具有刺激性。
  2. 用 PBS-T 洗涤三次，每次 10 分钟。在 PBS-T 中依次加入 30%、50% 和 70% 的甘油（v/v），于室温下每步孵育至少 1 小时，或每步过夜，以进行组织透明化处理。 4 °C.
  3. 将鱼置于含70%甘油（v/v）的PBS-T中，固定于35 mm玻璃底培养皿内，尽量使眼睛平直紧贴盖玻片。对于较年轻的鱼，可略微倾斜至前侧方，以帮助调整晶状体缝合线与盖玻片平行。

6. 利用转基因品系分析斑马鱼晶状体前部缝合线 体内

  1. 生成 Tg(βB1cry:mAppleCAAX) 使用 Tol2 试剂盒的实验步骤15Tol2 转座子系统15 实现由人源300 bp启动子驱动mApple表达的构建体的稳定整合 βB1-晶状体蛋白启动子16 通过CAAX序列锚定在膜上，从而特异性地在晶状体纤维细胞膜中表达。
    注意： 该载体（货号：122451）可进行购买。
    1. 注射当天早晨，配制注射混合液，并置于冰上保存。为达到最终体积 10 µL 含有无RNase和无DNase的H2O，添加： 1.5 µL 的人类βB1cry:mAppleCAAX DNA 质粒，50 ng/μLµL - [0.375–0.75 pg/终末注射] 1.5 µL Tol2 转座酶 mRNA 的 300 ng/µL （Tol2 试剂盒）15 [15–30 pg/末次注射]，以及 1 µL 1% w/v 的酚红指示剂 [1 x10-5%（w/v）/终浓度注射]
    2. 向单细胞期胚胎注射50-100 pL注射混合物12.
  2. 通过检测3 dpf时mApple阳性晶状体胚胎的频率，测定F0注射胚胎的转基因效率。
    注意： 预计将会 >使用该方法可实现80%的转基因效率。F0代嵌合体可用于对单个细胞的膜形态进行详细分析。不同程度的嵌合性使得研究者能够对单个细胞或少量细胞群体的形态进行成像，而更广泛的晶状体表达则可用于分析多细胞结构，如晶状体缝合线。 体内.
  3. 将F0代嵌合鱼进行杂交以建立稳定品系，用于标记所有纤维细胞膜。F0代 founder 鱼若将转基因整合至生殖系，其后代将获得稳定的转基因整合，可由此建立并维持转基因品系。

7. 利用转基因品系分析斑马鱼晶状体前部缝合线 体内

  1. 将 3 dpf 或成年嵌合体或稳定转基因斑马鱼用三卡因麻醉后，置于含三卡因的 1% 低熔点琼脂糖（LMA）中，并使眼睛紧贴玻璃底微型培养皿的盖玻片进行固定。
    1. 将 1 g LMA 溶于 100 mL EM（不含亚甲蓝）中，配制 1% LMA。长期储存时分装为每管 15 mL，置于 4 °C 保存。使用前微波加热溶解，随后置于 42 °C 保温待用。
  2. LMA 凝固后，用含三卡因的 EM 覆盖 6 dpf 及以下的幼鱼，或用含三卡因的养殖用水覆盖成鱼。
    1. 若对经 PTU 处理的斑马鱼进行成像，取 5 mL 不含亚甲蓝的 EM 或养殖用水，加入 250 µL 三卡因母液及 7 µL PTU。

8. 晶状体冷冻切片与免疫组织化学

  1. 将冷冻保护的固定胚胎或成体晶状体置于10%蔗糖PBS溶液（w/v）中，随后分别在20%蔗糖溶液中室温孵育1小时（或4 °C过夜），最后在30%蔗糖溶液中4 °C过夜。
  2. 将组织包埋于OCT包埋剂中的底模内，再用OCT将其冷冻固定到样品夹上。以12–14 µm厚度进行冷冻切片，并将切片收集至Superfrost/Plus载玻片上。将切片在预热至约35 °C的载片加热器上温育10分钟。
  3. 用PBS洗涤切片三次，每次10分钟。加入Phalloidin-Alexa Fluor 546（1:200）与DAPI（1:1,000）或WGA-Alexa Fluor 594（1:200）对切片进行标记，随后再进行三次PBS洗涤。用抗荧光淬灭封片剂封片，并用指甲油封固盖玻片。

9. 成像

  1. 使用共聚焦显微镜获取图像。采用60倍、数值孔径1.2的水浸物镜或类似物镜，从晶状体前极至后极的特定区域获取z轴层扫图像或光学切片。使用以下采集参数：1.2 airy单位，561 nm激光配合Texas red滤光片用于phalloidin-Alexa Fluor 546或mApple，或405 nm激光配合紫外滤光片用于DAPI。
  2. 校正z轴方向的激光功率强度，以补偿随晶状体深度增加导致的信号衰减。该方法可在固定或活体3 dpf胚胎的晶状体后极获得强信号，并在成年鱼晶状体的赤道部光学切片中获得强信号。
  3. 使用图像处理软件对图像进行整合与观察。

10. 晶状体核在前后轴方向定位的测量

  1. 在35 mm培养皿中，将新切除的晶状体在PBS中以载玻片为底进行轴向定位，使极部和缝合线与焦平面平行。观察折射率的差异，该差异通常出现在晶状体皮质与晶状体核的界面处，以此识别晶状体核。
    注意： 健康的野生型成年晶状体具有极高的透明度，难以观察晶状体缝合线和晶状体核，也无法确定晶状体的方向。在此情况下，使用镊子在晶状体囊上造成轻微切口，可引起轻微损伤，约10分钟后晶状体缝合线和晶状体核即变得清晰可见，有助于确定晶状体的方位以进行测量。然而，由于晶状体已受损，将无法用于后续实验应用。
  2. 使用带有相机的解剖显微镜，在明场照明下（有或无微分干涉相差光学器件）对晶状体核清晰对焦后拍摄晶状体图像。在相同放大倍数下拍摄显微测微尺的图像，用于校准。
    1. 单击实时查看按钮，调整曝光设置以观察晶状体核及晶状体周边，然后单击拍摄按钮获取图像。保存为 tif 文件。
    2. 使用图像处理软件校准所获取的镜头图像。选择直线工具，在微米尺图像上绘制一段已知长度的直线，点击分析 | 设定比例尺。输入已知距离、单位，并选择“全局”校准，然后点击确定。
  3. 测量晶状体核中心至前极的距离（a - r).
    1. 在图像处理软件中，使用直线工具沿轴向穿过晶状体核成像的中心绘制一条直线。将该直线的中点作为晶状体核的中心。
    2. 从该点向晶状体前极画另一条线，在“分析”菜单中选择“测量”，以测定距离a - r），其中 a 是透镜的半径，且 r 是从透镜中心到晶状体核中心的距离。
    3. 从晶状体前极到后极画另一条线，并测量此距离作为晶状体直径（2a）。从“结果”窗口复制这些长度，并转移至电子表格或统计软件中。
      注意： 从晶状体核中心到晶状体前极的距离比从晶状体核中心到晶状体中心的距离更容易精确测量。该测量值通过步骤10.3.5中的公式转换，以报告晶状体核中心到晶状体中心的距离。测量时应始终使用成体核，即使胚胎核清晰可见。
    4. 将直径除以2，以计算透镜半径。 a.
    5. 计算 r/a，作为 数学表达式：几何序列项；序列差异分析方程。即晶状体核相对于晶状体半径的归一化定位。
      注意：对于更靠近前极的细胞核， r/a 将是 >0.0，而细胞核位于中央时将具有 r/a 0.0
  4. 将归一化轴向晶状体核测量值的对数作为标准长度的函数作图，以确定斑马鱼发育过程中晶状体核定位的变化。

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结果

成年斑马鱼的眼睛解剖结构与哺乳动物高度相似（图1A）。尽管斑马鱼与哺乳动物的眼睛存在一些差异，例如具有睫状区而非睫状体17、光学特性不同18以及胚胎发育过程中形态发生方式的差异19，斑马鱼眼仍是研究眼部发育和理解眼病的优秀模型20,21,22。一层简单的上皮组织覆盖晶状体的前极，在赤道处该上皮终生经历增殖、伸长并分化为晶状体纤维细胞，构成晶状体的主体部分。成熟的纤维细胞（图1B，浅蓝色）最早在胚胎期分化形成，无细胞器且终生不再更新。正在分化的纤维细胞尖端在晶状体两极相遇，形成前极和后极缝线。随后，新分化的纤维细胞将这些细胞向内包...

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讨论

斑马鱼晶状体形态分析是理解突变体表型或研究药理干预对眼晶状体生物学影响的首要步骤。本文概述了分析晶状体缝合线、皮质纤维细胞形态以及晶状体核特征的方法。这些方法结合了 体外 和 体内 （比较于 表格 1）. 该 体外 方法能够更详细地观察外层皮质细胞的形态，并可获取成年晶状体的后部缝合线。

体内分析可通过使用转基因标记实现。我们在此介绍的转基因具有晶状体膜特异性，与现有的Q01斑马鱼品系相比，后者在标记晶状体膜的同时还会标记眼部其他细胞类型（包括无长突细胞），从而增加了解读难度11。由于眼色素上皮在胚胎发育第二天即形成，会限制体内信号的观察，因此在此阶段及后续阶段进行分析时需对胚胎进行PTU处理。在成体中，虹膜会遮挡晶状体皮质的清晰观察，但允许对晶状体前部皮质进行 体内分析。对活体鱼类晶状体的成像可实现对同一动物晶状体形态的纵向研究。该技术对于研究动态过程（如渗透压或药...

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致谢

我们感谢以下资助来源：J.E.H. 获得的 NIH R01 EY05661 项目资助；Ines Gehring 在构建 aqp0a/b 双重突变体及斑马鱼养殖方面提供的协助；Daniel Dranow 博士在转基因品系构建过程中的有益讨论；Bruce Blumberg 博士和 Ken Cho 博士实验室提供体视显微镜的使用；以及 Megan Smith 博士在统计分析方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-苯基-2-硫脲（PTU）SigmaP7629警告 – 剧毒
4% 甲醛水溶液Electron Microscopy SciencesRT 157-4警告 – 有害健康，可燃
共聚焦显微镜NikonEclipse Ti-E
冷冻切片机LeicaCM3050S物镜和腔室温度设定为 -21 °C
DAPIInvitrogenD1306警告 – 对眼睛和皮肤有刺激性
二甲基亚砜（DMSO）Fisher ScientificD128警告 – 可燃，可穿透皮肤 
一次性底模VWR Scientific15154-631
一次性巴斯德玻璃移液管Fisherbrand13-678-20A
Dumont #5 镊子Dumont & Fils保持镊子锋利
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine）Sigma-AldrichA5040警告 - 有毒
玻璃底微孔培养皿（35 mm 培养皿，14 mm 微孔，#1.5 盖玻片）MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
甘油SigmaG2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA 构建体AddgeneID:122451
ImageJWayne Rasband, NIHv1.51n
低熔点琼脂糖（LMA）Apex902-36-6
NIS-ElementsNikonV 4.5
NIS-Elements AR 软件Nikon
Olympus  配备型号为 2.1.1.183 的控制器Olympus CorpDP70
Olympus 显微镜 Olympus CorpSZX12
鬼笔环肽-Alexa Flour 546Thermo FisherA22283
酚红指示剂（1% w/v）Ricca Chemical Company5725-16
磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher ScientificBP399
PhotoshopAdobeCS5 v12.0
Photoshop 软件AdobeCS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD 物镜Nikon
电源Wild HeerbruggMTr 22或同等电源 
载片加热器型号 No. 26020FSFisher Scientific12-594
氢氧化钠颗粒Fisher ScientificS612-3警告 - 具腐蚀性/对眼睛和皮肤有刺激性，靶器官 - 呼吸系统，对金属具腐蚀性
Superfrost/Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15
Sylgard 184 硅胶（Dow Corning）World Prevision InstrumentsSYLG184
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂Sakura Finetek4583
Triton X-100 BioXtraSigmaT9284警告 – 有毒，对水生环境有害，具腐蚀性
Vannas 显微解剖剪Ted Pella Inc1346尖端锋利/直头
Vectashield 抗荧光淬灭封片剂Vector laboratoriesH-1000
麦胚凝集素（WGA）-Alexa Flour-594Life TechnologiesW11262

参考文献

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